博 士 （ 医 学 ） 大 芦 孝 平
学 位 論 文 題 名
悪性黒色腫の転移経路に関する動物実験：リンパ行性転移と 血行性転移の関連について
学位論文内 容の要旨
【 背 景 と 目 的 】
悪 性 黒 色 腫 は メ ラ ノ サ イ ト 由 来 の 悪 性 腫 瘍 で あ り 、 高 率 に り ン パ 節 転 移 を 来 た し 、 進 行 例 の 予 後 は 不 良 で 、 化 学 療 法 や 免 疫 療 法 な ど の 各 種 治 療 法 に 対 し て 強 こ と が 知 ら れ て い る 。 本 研 究 は 悪 性 黒 色 腫 の 予 後 に 関 わ る 、 リ ン パ 行 性 転 移 お よ び 血 行 性 転 移 に つ い て 、 以 下 の 2点 を 検 証 す る こ と を 目 的 と し て 行 っ た 。
悪 性 黒 色 腫 に 特 徴 的 な り ン パ 行 性 転 移 と し て 、in‑transit転 移 が あ る 。In‑transit転 移 は 原 発 巣 か ら 所 属 リ ン パ 節 間 の り ン パ 管 内 で 腫 瘍 が 増 殖 す る こ と で 生 じ る 。In‑transit転 移 は 局 所 の 病 態 で あ る に も か か わ ら ず 、 そ の 予 後 は 不 良 で あ る 。 し か し 、 そ の 性 質 に つ い て は 十 分 に 解 明 さ れ て い る と は 言 え な い 。 そ の 理 由 の ー っ と し て 動 物 実 験 でin‑transit転 移 を 再 現 で き て い な い こ と が 挙 げ ら れ る 。 本 研 究 で は 動 物 実 験 で 悪 性 黒 色 腫 のin‑transit 転 移 を 再 現 し 、 予 後 不 良 で あ る こ と の メ カ ニ ズ ム 解 明 を1つ 目 の 目 的 と し た 。 ま た 、 臨 床 に お け る セ ン チ ネ ル リ ン パ 飾 転 移 と 遠 隔 転 移 の 発 生 に 関 す る 検 討 か ら 、 悪 性 黒 色 腫 の 転 移 経 路 に 関 し て 次 の よ う な 仮 説 を 立 て た 。 即 ち 悪 性 黒 色 腫 は ま ず 原 発 巣 か ら り ン パ 行 性 に セ ン チ ネ ル リ ン パ 飾 に 転 移 し た 後 、 リ ン パ 節 内 に 存 在 す る り ン パ 流 と 血 流 を つ な ぐ シ ヤ ン ト を 通 過 し て 血 行 性 の 遠 隔 転 移 を 生 じ る と い う も の で あ る 。 こ の 仮 説 の 正 当 性 を 検 証 す る こ と を2つ 目 の 目 的 と し た 。
【 材 料 と 方 法 】
上 記2点 を 検 証 す る た め に 、 マ ウ ス の 後 肢 を り ン パ 浮 腫 状 態 に し て 、 そ こ に 悪 性 黒 色 腫 細 胞 を 移 植 し た 。In‑transit転 移 は り ン パ 流 の う つ 滞 が あ る 状 態 で 生 じ や す い こ と が 知 ら れ て い る こ と 、 リ ン パ 管 内 で の 腫 瘍 細 胞 の ト ラ ッ プ と い うin‑transit転 移 の 病 態 を 考 慮 し 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 の 脚 に 腫 瘍 を 移 植 す る こ と で 再 現 が 可 能 で あ る と 推 測 し た 。 ま た 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 で は 原 発 巣 か ら の り ン パ 流 は 所 属 リ ン パ 節 へ は 到 達 で き な ぃ 。 リ ン パ 節 内 に り ン パ 流 と 血 流 を っ な ぐ シ ヤ ン ト が 存 在 し 、 悪 性 黒 色 腫 細 胞 が そ こ を 通 過 し て 遠 隔 転 移 を 生 じ る と い う 仮 説 が 正 し け れ ば 、 シ ヤ ン ト に 到 達 で き ず に 遠 隔 転 移 は 減 少 す る こ と が 予 想 さ れ る 。
マ ウ ス 後 肢 の り ン パ 浮 腫 モ デ ル 作 成 の 際 に は 、 マ ウ ス 鼡 径 部 へ の 放 射 線 照 射 と 、 リ ン パ 管 結 紮 、 リ ン パ 節 切 除 、 お よ び 全 周 性 の 皮 膚 欠 損 作 成 を 行 っ た 。 螢 光 リ ン パ 管 造 影 と 脚 周 径 の 計 測 に よ り 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 を 再 現 で き て い る こ と を 確 認 し た 。 実 験 に はC57BL/6マ ウ ス 、 悪 性 黒 色 腫 細 胞 株 はB16‑Fl0の 同 系 移 植 系 を 用 い た 。 腫 瘍 の 生 体 内 で の 動 態 把 握 、 細 胞 数 の 定 量 を 容 易 に す る た め にB16‑Fl0にluciferase遺 伝 子 を 導 入 し 、 安 定 発 現 さ せ た 細 胞 株(B16‑FlO‑luc2)を 使 用 し た 。 生 体 内 で の 転 移 巣 の 観 察 に は luciferinを 腹 腔 内 投 与 後 にin vivo Bioluminescence imagingを 使 用 し た 。 ま た 、 抗CD31 抗 体 ・ 抗Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor‑l(LYVE ‑1） 抗体 に よ る 免 疫 染 色 を 行 い 、 腫 瘍 内 お よ び 腫 瘍 周 囲 の 血 管 ・ リ ン パ 管 面 積 を 計 測 し た 。 細 胞 増 殖 の 指 標 と し て 抗 Ki‑67抗 体 に よ る 免 疫 染 色 を 行 い 、 陽 性 率 を カ ウ ン ト し た 。
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定 量Reverse Tsanscription一PCR(RTPCR)を 用 い て 腫 瘍 の 性 質 を 検 討 し た 。 転 移 能 の 指 標 と し て 細 胞 接 着 因 子 E‑Cadherin発 現 、E‑Cadherin発 現 を 制 御 す るSnail、 Epithelial一mesenchymal transition(EMT)の 指 標 と し て 間 葉 系 マ ー カ ー のalpha smooth muscle actin(0 ‑SMA)、 リ ン ノ 弋 管 増 殖 因 子 と し てVascular endothelial growth factor‑C(VEGF‑C)の 発 現 を 検 討 し た 。 遠 隔 転 移 の 指 標 と し て の 肺 転 移 定 量 は 、 マ ウ ス の 肺 か らluciferaseを 抽 出 し 、luciferinを 添 加 し て 発 光 強 度 を 計 測 す る こ と で 行 っ た 。 【 結 果 】
リ ン パ 浮 腫 状 態 の 後 肢 ヘ 悪 性 黒 色 腫 細 胞 を 移 植 す る こ と でin‑transit転 移 を 再 現 可 能 だ っ た 。 ま た 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 の マ ウ ス で は 、 通 常 で は 見 ら れ な い よ う な 移 植 後 早 期 か ら の 遠 隔 リ ン パ 節 （ 腋 窩 リ ン パ 節 ） へ の 転 移 が み ら れ た 。In‑transit転 移 巣 で は 腫 瘍 細 胞 の Ki‑67陽 性 率 が 有 意 に 高 か っ た 。 リ ン パ 浮 腫 状 態 に 移 植 し た 腫 瘍 で は 、 リ ン パ 管 の 面 積 ・ 血 管 面 積 が 増 加 し て い た 。 リ ン パ 浮 腫 の 腫 瘍 ．in‑transit転 移 で は 、 通 常 と 比 較 し て E‑Cadherinの 発 現 が 低 下 し て い る 傾 向 が あ っ た 。a‑SMAの 発 現 は 、 通 常 と 比 較 し て り ン パ 浮 腫 で 有 意 に 低 下 し て い た 。 ま た 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 で は 通 常 と 比 較 し て 肺 転 移 が 有 意 に 増 加 し て い た 。
【 考 察 】
In‑transit転 移 を 動 物 実 験 で 再 現 し た 報 告 は こ れ ま で に は 無 か っ た が 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 の マ ウ ス 後 肢 に 悪 性 黒 色 腫 細 胞 を 移 植 す る こ と でin‑transit転 移 を 再 現 可 能 で あ っ た 。 リ ン パ 浮 腫 状 態 で は り ン パ 管 の 面 積 が 増 加 し て お り 、 リ ン パ 行 性 転 移 で あ るin‑transitの 形 成 に 寄 与 し て い る と 思 わ れ た 。
In‑transit転 移 巣 で は 、Ki‑67陽 性 率 の 上 昇 ・E‑Cadherinの 発 現 低 下 が 起 こ っ て お り 、 腫 瘍 の 増 殖 能 、 転 移 能 が 高 ま っ て い る こ と が 示 唆 さ れ 、 予 後 不 良 で あ る 要 因 の ー っ で あ る と 考 え ら れ た 。Q ‑SMA発 現 の 検 討 結 果 か ら は 、 転 移 ・ 増 殖 能 の 亢 進 はEMTと は 異 な る メ カ ニ ズ ム で 生 じ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、 リ ン パ 浮 腫 状 態 で は 血 管 の 面 積 が 増 加 し て お り 、 リ ン パ 浮 腫 マ ウ ス で 肺 転 移 が 多 か っ た 原 因 の ー っ で と な っ て い る 可 能 性 も 考 え ら れ た 。
リ ン パ 浮 腫 マ ウ ス で は 、 通 常 と 比 較 し て 肺 転 移 が 増 加 し て い た 。 リ ン パ 節 内 の シ ャ ン ト に 到 達 で き な ぃ 状 態 で は 遠 隔 転 移 は 減 少 す る と い う 仮 説 と は 相 反 す る 結 果 と な り 、 仮 説 が 誤 っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 し か し 、 リ ン パ 浮 腫 マ ウ ス で は 遠 隔 リ ン パ 節 へ の 転 移 が 観 察 さ れ て お り 、 本 研 究 に 用 い た モ デ ル で は 腫 瘍 が り ン パ 節 内 の シ ャ ン ト ヘ と 到 達 で き な ぃ 状 態 を 完 全 に は 再 現 で き て い な か っ た 。 ま た 、 リ ン パ 浮 腫 で は 増 殖 能 ・ 転 移 能 の 亢 進 し たin‑transit転 移 を 生 じ て い た こ と か ら 、 そ の 影 響 が 大 き い た め に り ン パ 節 内 の シ ャ ン ト に よ る 影 響 が マ ス ク さ れ た 可 能 性 も 考 え る 必 要 が あ る 。 そ の 他 に 、 リ ン パ 浮 腫 モ デ ル で は り ン パ 節 を 切 除 し た 事 に よ り 、 局 所 の 腫 瘍 免 疫 能 が 低 下 し て い た こ と が 遠 隔 転 移 の 増 加 に 寄 与 し て い た 可 能 性 も 否 定 で き な ぃ と 考 え ら れ た 。
【 結 論 】
リ ン パ 浮 腫 状 態 の マ ウ ス 後 肢 へ 悪 性 黒 色 腫 細 胞 を 移 植 す る こ と で 、in‑transit転 移 を 再 現 す る こ と が 可 能 だ っ た 。In‑transit転 移 で は 細 胞 の 転 移 能 ・ 増 殖 能 が 高 ま っ て い る こ と が 示 唆 さ れ 、 予 後 不 良 の 原 因 と な っ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 転 移 能 ・ 増 殖 能 の 亢 進 は EMTと は 異 な る メ カ ニ ズ ム で 起 こ っ て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。
仮 説 に 反 し て り ン パ 浮 腫 状 態 で は 遠 隔 転 移 が 減 少 し て お り 、 悪 性 黒 色 腫 が 転 移 の 際 に り ン パ 節 内 の シ ャ ン ト を 通 過 し て い る か ど う か に つ い て は 、 本 研 究 で は 検 証 が 不 十 分 で あ る と 考 え ら れ 、 更 に 検 討 す る 必 要 が あ る と 思 わ れ た 。
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学位論 文審査の要旨 主査 副査
副査 副査
教授 教授 准教授 教授
松野 山本 濱田 秋田
学 位 論 文 題 名
吉宏 有平 淳一 弘俊
悪性黒色腫の転移経路に関する動物実験：リンパ行性転移と 血行性転移の関連について
申請者は以下の内容について発表した。
悪性黒色腫のin‑transit転移を再現した動物実験モデルを作製しその性質を解析するこ と、およびりンバ節内の血管・リンパ管接続を介した悪性黒色腫の転移を証明することを 目標として研究を行った。
本研究ではまずマウス後肢のりンパ浮腫モデルを作製した。過去に報告のあったラット のモデル作製法を応用して、マウスの後肢をりンバ浮腫状態にすることに成功した。そこ に悪性黒色腫細胞を移植することでin‑transit転移の再現が可能だった。In‑transit転移巣で は腫瘍の増殖能・転移能が亢進していた。
また、リンバ節内の血管・リンバ管間の接続を介した転移が実際に起こっているならば、
リンバ節を切除したりンパ浮腫状態では、転移経路が遮断されているため遠隔転移が減少 すると予想されたが、実際には遠隔転移が増加した。In‑vivo imagingによルリンバ浮腫マ ウスヘの腫瘍移植モデルでは側副リンバ流によって遠隔リンバ節である腋窩リンパ節への 転移が観察され、リンバ節内の血管・リンバ管接続を介した転移を完全に遮断することが できいていなかったことが明らかとなった。遠隔転移の増加した原因は、転移能・増殖能 の亢進した状態であるin‑transit転移を生じたこと、リンパ節切除によって局所的な免疫不 全状態に陥っていたことなどが関与していると推測された。
血管・リンパ管接続を介した転移経路は証明できなかったが、世界で初めてin‑tr．a恥it 転 移 を 動物 実 験 で 再現 す る こと に成功し 、その 性質を明 らかに すること ができた 。 発表の後、以下の如く質疑応答がされた。
濱田准教授から、病理組織における血管とりンバ管の評価において、数や太さではなく 面積を計測したことの妥当性について質問があった。それに対して申請者は、本研究では 脈管の増加と拡張の双方が生じていることが推測されたため、包括的に評価するために面 積の計測を選択したと回答した。
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さ ら に 濱 田 准 教 授 か ら肺 転移 が多 かっ た 個体 の病 理組 織 にお いて 、腫 瘍の 脈 管浸 潤が 多 く観 察 され たの かに 関し て 質問 があ った 。 それ に対 して 申請 者 はin←transitを 生じ た個体 で は り ン パ 管 侵 襲 は 多 く観 察さ れ、 肺転 移 が多 かっ た個 体 では 血管 侵襲 が目 立 つ傾 向が あ った と 回答 した 。
秋 田 教 授 か ら 悪 性 黒 色 腫 以 外 の 皮 膚 悪 性 腫瘍 で はin―transit転 移は 見ら れ ない のか と 質問 が あっ た。 申請 者は 基 底細 胞癌 や有 棘 細胞 癌で はinーtransit転 移 は起 こら ない が、悪 性黒 色 腫で は約6％ でiriーtransit転移 を生 じる とい う デ一 夕を 引用 し 、悪 性黒 色腫 はりン パ行 性 転移 を生 じや すい こ とを 裏付 けて い ると 回答 した 。
さ ら に 秋 田 教 授 か らin―transit転 移 の 動 物 実験 モデ ル を用 いる と、 どの よ うに 臨床 へ 寄与 で きる か質 問が あっ た 。申 請者 は新 治 療法 を開 発す る際 の効果検証に利 用可能なこと、
inーtransit転 移 に 特 異 的 な 分 子 を 解 明 し 分 子 標的 薬の 開 発へ っな がる こと を 説明 した 。 次 に 松 野 教 授 か ら 、 臨 床 検 体 に お け るin―transit転 移 に特 異的 な所 見が 、 過去 に報 告 さ れ て い る の か に つ い て質 問が あっ た。 申 請者 はin一transit転 移で はMIB一lindexが高 か った と いう 臨床 デー タの 報 告例 を引 用し 、 本研 究と 矛盾 しな い内容であるこ とを説明した。
更 に 今 後 は 臨 床 検 体 を 用 い て 更 な る 検 討 に っ な げ て い く 考 え を 示 し た 。 ま た 松 野 教 授 か らin−transit転 移 巣 に お け る腫 瘍細 胞 の性 質の 変化 はど の よう な機 序 で 生 じ て い る の か に つ い て 質 問 が あ っ た 。 申請 者 は2つ の 仮説 につ いて 説明 し た。 一っ は り ン パ 浮 腫 と い う 特 殊 な 環 境 が 腫 瘍 細 胞 の 性 質 を 変 化 さ せ た と い う 考 え 、 も う ー っ は inーtransit転 移 の 過 程 に お い て 高 悪 性 度 な 細 胞 の 選 択 が 生 じ た と い う 考 え だ っ た 。 さ ら に 松 野 教 授 か ら は 悪 性 黒 色 腫 細 胞 と りン バ 管内 皮細 胞の 相互 作 用が 、in―transit 転 移 の 形 成 に ど の よ う に関 与し てい たの か につ いて 質問 が あっ た。 申請 者は 悪 性黒 色腫 と り ン バ 管 内 皮 細 胞 の 相 互作 用に 関与 する ケ モカ イン に関 し ても 検討 を行 った も のの 、現 時 点 で は 有 用 な 結 果 が 得 ら れ て お ら ず 、 引 き 続 き 解 析 を 進 め て い く 考 え を 示 し た 。 山 本 教 授 か ら 、 リ ン バ 節 郭 清 術 を 行 う こ とはinーtransit転 移の ルス クと な るの では な い か と の 指 摘 が あ っ た 。そ れに 対し て申 請 者は 原発 巣か ら 所属 リン パ節 まで 、 リン バ管 を 含 め て 連 続 的 に 切 除 す るsubtotal integumentectomyの 術 式に つい て言 及し 、 適応 を吟 味 し た 上 で 治 療 を 行 う こ とが 重要 であ り、 本 研究 の結 果は 必 ずし も所 属リ ンバ 節 郭清 の有 用 性を 否 定す るも ので はな い と回 答し た。
こ の 論 文 は 、 こ れ ま で内 容を 発表 した 国 内の 学会 およ び 国際 学会 で高 く評 価 され ，悪 性 黒 色 腫 の 病 態 解 明 、 治 療法 開発 に関 する 基 礎お よび 臨床 研 究結 果に 有用 な新 知 見を 付与 す る も の と 期 待 さ れ る 。 審査 員一 同は 、こ れ らの 成果 を高 く 評価 し、 大学 院課 程 にお ける 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ申 請者 が博 士（ 医 学） の学 位を 受 ける のに 充分 な資 格 を有 する も のと 判 定し た。
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