博 士 （ 薬 学 ） 浦 田 秀 造
学 位 論 文 題 名
エマージングウイルスの出芽機構に関する研究 学位論文内容の要旨
人類は 現在、 新興感染 症を引 き起こす ことで 新たな脅威となっているSARS（重症急性 呼吸器症候群）や高病原性トリインフルエンザ、度々アウトブレイクを引き起こしている エポラウイルス、マールブルグウイルス及ぴラッサウイルスなどの、多くの高病原性ウイ ルスの脅威に曝されている。また、これらのエマージングウイルスはバイオテロとして使 用される危険性も非常に高い。しかし、これらの感染症に対する効果的な治療法は未だに 確立されていなぃ。最近、エボラウイルスやfflV（ヒト免疫不全ウイルス）などの多くの エンベロープウイルスが、共通のメカニズムで宿主細胞から出芽することが明らかにされ つっあ る。そ して、こ れらの ウイルス のマトリ ックス タンパク 質に存 在するLドメイン (PTISAP、PPxYあるい はYxxlー配列からなる）が、ウイルス出芽の過程において必須の役 割を果 たすこ とが明ら かとなっている。Lドメインはそれぞれ特異的に宿主細胞因子と結 合 し て ウ イ ル ス の 出 芽 を 誘 導 す る が 、 詳 細 な 出 芽 機 構 は 不 明 な ま ま で あ る 。 ウイルス出芽機構の解明は、ウイルス複製のメカニズムを明らかにするとともに、ウイ ルス出芽をターゲッ卜とした新規抗ウイルス薬の開発に大きく貢献すると考えられる。そ こで、 本研究 では、ラ ッサウイルス、マールブルグウイルス及びHTLV‑1（ヒトT細胞自血 病ウイルス）に焦点を当て、ウイルス出芽に必要なウイルス側及ぴ宿主側の因子を同定す る こ と を 目 的 と し て 、 ウ イ ル ス 出 芽 機 構 に 関 す る 分 子 生 物 学 的 解 析 を 行 っ た 。 Tsgl01、Vps4A及 びVps4Bは 細 胞 内膜 輸 送 系の ー っ であ るMVB(multi‑vesicular body)経 路及ぴ 細胞質分 裂において機能する重要な因子であり、これらのタンパク質がラ ッサウ イルス のマ卜リ ックス タンパク 質Zに よって形成されるウイルス様粒子(VLP)の出 芽にお いて機 能してい ることを明らかにした。この結果は、ラッサウイルスの出芽がMVB 経 路を 模 倣 して いる ことを裏 付ける。ZはC末端 領域にLドメ インと考 えられ る2つ のモ チ ーフ 配 列PTAPとPPPYを持 っ が 、実 際 に これら のLド メイン が出芽に 重要な 役割を果 た すこ と を 確認 した 。PTAPはTsgl01と 、PPPYはHECT型 ユビキチ ンリガ ーゼと結 合し、
出芽を制御していると考えられている。しかし、HECT型ユビキチンリガーゼであるNedd4.1 がラッ サウイ ルス出芽 には関 与してい ないとい う成績が得られたことから、他のHECT型 ユビキチンリガーゼの関与が示唆され、今後これを同定することが重要な課題である。ラ ッ サウ イ ル スはZの 他にウ イルス構 造タン パク質と してGP‑c、NPを保有す る。NPはZに よ るVLP産生 に 影 響し な か っ たの に 対 し、GP‑cはZによ るVLP産 生 量を 減少 させた。Z によるVLP出 芽と異な り、Z、GP‑cによ る出芽 は、脂質ラフトで起こることを示す成績を ―613―
得 てお り 、GP‑cはZに よ るVLP出 芽の場 を脂質ラ フトー移 行させ ることが 示唆さ れた。
GP‑c発現 によるZ‑VLP出芽 の減少は 、このことが原因のーっとなっている可能性がある。
ま た 、 Zの3‑10番 目 の ア ミ ノ 酸 が 出 芽 を 制 御 す る 配 列 で あ る こ と も 示 し た 。 マ ールブル グウイ ルスに関 しては、VP40のN末端領域 に存在 するPPPY配 列が出芽 に 重要 な役割を 果たすこ とを示 した。この結果は、マールブルグウイルスの出芽がMVB経路 を模 倣して いること を示唆 する。さ らに、PPPY配列依存 的なNedd4.1及びTsgl01のVP40 へ の結 合 、 並 ぴにVps4Bの 関与 を 示 した 。 マ ール ブ ル グウ イルスVP40はPPPY配列依 存 的 にNedd4.1のWWド メ イン と 結 合す る こ とを 示 し たが 、 さらに 詳細な解 析によ りVP40 はNedd4.1に 存 在 す る4つ のWWド メ イン の う ち、1番 目 のWWド メイ ン を 最も 強 く 認識 していることが明らかとなった。．AP38が出芽（もしくは膜への集合）の過程に関与してい るこ とも示し ており、 この事 実は興味 深いが 、AP38がVP40と 直接結合するかは現時点で は不 明である。また、Nedd4.1による出芽制御にはNedd4.1のりガーゼ活性は必ずしも必要 では なく、 むしろHECTドメイン 全体が必 要であ ることを 示した 。これはNedd4.1の りガ ーゼ 活性以外の機能がウイルス出芽に必要であることを示唆するが、詳細なメカニズムは 現 在不 明 で あ る。 ま た 、NPやGPの存 在下で 、Zに よるVLP産生が 促進され るとい う結果 は、 感染性の 完全ウイ ルス粒 子はVLPの系よ りも出芽 効率が 高いことを意味するが、Lド メ イン に 変 異 を導 入 す ると 、NPやGPの存 在 下 でもVLP産 生量 は野生型VP40単独の 場合 と変 わらなか った。こ の事実 は、Lドメインが感染性ウイルスの出芽においても重要な役 割を果たすことを示唆している。
HTLV‑1に関 し て は、HTLV‑1が保 有 す る2つ のLドメ イン(PTAP、PPPY）が出芽 に重 要な 役割を果 たし、そ れぞれ がTSg101及びNedd4．1（も しくはWWPl）と特異的に結合す る こと が 報 告 され て い る。 本研 究により 、HTLv‐1の場合 も、Vps4MVps4BがVLP産 生に 関与 することが明らかになり、HTIN．1出芽においてもMヽ但経路が利用され、出芽してい ると 結諭した。さらに、HTLv．1には心Pl/Alixと結合すると考えられるコンセンサス配列 が存 在しなぃにも関わらず、このタンパク質が出芽を制御していることを示したが、この 制御メカニズムに関しても詳細は現在分かっていない。．
以上の結果より、ラッサウイルス、マールブルグウイルス及びHTI´v‐1のいずれの場合 も、MVB経路及び細胞質分裂の機構を模倣して出芽が行われていると考えられる。これは、
多く のエンベロープウイルスが同様のメカニズムで出芽しているという考えを強く支持す る。 そして、MVB経路 で働く 因子の中で、ウイルスによって出芽に必須な因子には違いが あり 、本研究では、出芽に必須な因子について詳細な違いを示すことができた。今後、宿 主因 子とウイルスタンパク質の結合の阻害作用、あるいは、出芽に必須なウイルスタンパ ク質 （ドメイン）の拮抗作用に基づぃた創薬研究が、新規抗ウイルス療法の開発に大きく 貢献すると期待される。
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学 位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 准教授 准教授 室長
横沢 木原 川原 安田
学 位 論 文 題 名
英 良 章 雄 裕 之
二 朗（科学警察研究所）
エ マージングウイルスの出芽機構に関する研究
人 類は現在、新興感染症を引き起こすことで新たな脅威となっているSARS（重症急 性呼吸器症候群）や高病原性トリインフルエンザ、度々アウトブレイクを引き起こして いるエポラウイルス、マールブルグウイルス及びラッサウイルスなどの、多くの高病原 性ウイルスの脅威に曝されているが、これらの感染症に対する効果的な治療法は未だ確 立されていない。最近、工ボラウイルスやHIV（ヒト免疫不全ウイルス）などの多くの ェ ンベ口ープウイルスが共通の機構で宿主細胞から出芽することが明らかにされつつ あり、これらのウイルスのマ卜リックスタンパク質に存在するLドメインがそれぞれ特 異的に宿主細胞因子と結合してウイルスの出芽を誘導する。しかし、詳細なウイルス出 芽機構は不明なままである。
本 論文提 出者は、 ラッサウ イルス、マールブルグウイルス及びHTLV‑1（ヒトT細胞 白血病ウイルス）に焦点を当て、ウイルス出芽に必要なウイルス側及び宿主側の因子に 関する一連の研究を展開し、以下の成果をおさめた。
（1）細胞内膜輸送系のーつであるMVB (multi‑vesicularbody)経路において機能する 重 要な因子 であるTsgl01、Vps4A及びVps4Bが、ラ ッサウイルスのマトリックスタン バ ク質Zによっ て形成さ れるウ イルス様 粒子(VLP)の出芽 において機能していること を 明らかに した。 この結果 から、ラッサウイルスの出芽がMVB経路を模倣していると 結 論した。 また、ZのC末端領 域に存 在するLドヌ インと考えられる2つのモチーフ配 列PTAPとPPPYが 出芽 に 重 要 な役割を 果たすこ とを明 らかにし た。一 方、HECT型ユ ビキチンリガーゼであるNedd4.1がラッサウイルス出芽には関与していないことを明ら か にし、他のHECT型ユピキチンリガーゼの関与を提案した。ラッサウイルスの構造夕 ン パ ク 質で あ るGP‑cとNPの う ち、GP‑cがZによ るVLP産 生量を 減少さ せ、ZとGP‑c に よる出芽 が脂質 ラフ卜で 起こる ことを明 らかに し、GP‑cはZによるVLP出芽の場を
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脂質ラフ卜に移行させると提案した。
（2）マ ー ル プル グ ウ イ ルスの 場合、VP40のN末 端領域に 存在す るPPPY配列が 出芽 に重 要な役 割を果た すこと を明らかにし、マールブルグウイルスの出芽がMVB経路を 模倣 してい ると結論 した。 また、PPPY配 列依存 的なNedd4.1及びTsgl01のVP40への 結合 、Vps4B及びAP38の 出芽への関与を明らかにした。さらに、NPやGPの存在下で、
ZによるVLP産生 が促進さ れるこ とを明ら かにし 、感染性 の完全 ウイルス 粒子はVLP の系 よりも 出芽効率 が高い と提案した。そして、Lドメインに変異を導入すると、NP やGPの 存在下 でもVLP産生量 は野生型VP40単独の 場合と変 わらな かったこ とを明 ら かにし、Lドメインが感染性ウイルスの出芽において重要な役割を果たしていると提案 した。
（3） HTLV‑1の場合 、Vps4A/Vps4BがVLP産生に関 与することを明らかにし、HTLV‑1 の出芽がMVB経路を利用していると結論した。また、AIPl/Alixが出芽を制御している ことを明らかにした。
以上の新知見及びそれらを得るために用いた新研究方法は、ラッサウイルス、マール ブルグウイルス及びHTLV‑1の出芽機構の理解にとどまらず、広く他のウイルスの出芽 機構を理解する上で重要な寄与をなし、また、宿主因子とウイルスタンパク質の結合の 阻害作用、あるいは、出芽に必須なウイルスタンパク質の拮抗作用に基づいた創薬研究 の展開にも重要な寄与をなすものである。
審査委員一同このことを高く評価し、本論文提出者が博士（薬学）の称号を受けるに ふさわしいものと一致して判断した。
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