博士（歯学）坂口友朗 学位論文題名
口腔マイコプラズマ由来リポタンパク質は Toll‑like receptor2 で認識される
学位論文内容の要旨
【 目 的 】 歯周 疾患 は歯 肉溝 にお ける 細菌性 プラ ーク の蓄 積と 宿主 免疫 応答 機構 と の アン バラ ンス によ り惹起 され る慢 性の炎症性疾患であり、現時点では、ヒトの歯周 疾 患の 発症 には 、あ る特定 のグ ラム 陰性細菌群が重要な役割を果していると考えられ ている。
歯周 疾患 患者 の炎 症局所 にお いて は、リンパ球、マクロファージなどの浸潤が著明 で 、リ ンパ 球と 歯肉 線維芽 細胞(hGF)が 直接 相互 作用し てい るこ とが明らかにされて い る 。 現 在 、 歯 周 病 原 性 細 菌 と 呼 ば れ てい るグ ラム 陰性 細菌 はhGFにIL‑1、Iし‑、 IL―8な ど の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 産 生 と と も に 、 細 胞 接 着 分 子 の1つ で あ る intercellular adhesion molecule―1aCAIVI一1）の発現を誘導すること、また、その活性物 質 の1っ は これ ら の 細 菌 の り ポ 多 糖 体(LPS)であ るこ とが 明ら かに されて いる 。LPS は グラ ム陰 性細 菌の 主要な 細胞 壁構 成成 分で 、主 要な 病原 因子 の1つであり、上記の ような活性以外にも様々な炎症反応の惹起に関わっていることが明らかにされている。
近 年 、 こ のLPSや り ポ タ イ コ 酸 等 を 有 し ない 口腔 マイ コプ ラズ マと 歯周 疾患 との 関 連 を示 すい くっ かの 報告が なさ れて いる。マイコプラズマは、他の一般細菌群と構造 が 異な り、 細胞 壁を 欠いた 自己 増殖 可能な最小の微生物である。これまでに、口腔マ イ コ プ ラ ズ マ と し て い く っ か の 種 が 分 離 同 定 さ れ て い る が 、 こ れ ら の 中 で Mycoplasma salivariumは最も高率に分離され、主な棲息部位はプラークと歯肉溝内で あ り、 歯肉 溝か らの 検出率 なら びに 抗体価は歯周疾患患者では健常者に比べて有意に 高 い こ と が 知ら れて いる 。ま た、M. salivariumがhGFに炎 症性 サイ トカ イン であ る IL一6、IL‑8の産 生な らび にICAM−1などの細胞接着分子の発現を誘導し、さらに、マ ク口ファージを活性化することも報告されている。これらのことから、Isロfi〃ロrz観粥 は 歯周 疾患 を含 むい くっか の口 腔感 染症において何らかの病因的役割を果たしている ものと推測されている。
そこ で、本研究では、hGFを活性化するMsロff〃ロゲ砒絖由来物質ならびにその受容
体を同定することを目的として実験を行った。
【 方 法 と 結 果 】hGFを コ ン フ ル ェ ン トの 状態 にな るま で培 養し た後 、口腔 マイ コプ ラ ズマ で刺 激し たとこ ろ、M. salivarium細 胞、そ の細 胞膜(CM)ならびにM. orale細 胞 は 細 胞変 性活性 を示 した 。ま た、M. salivar砒 絖細 胞とCMと を比 較した 場合 、CM の活性が強いことが判明した。
これらのことから、hGFに対するM．sロfめロゲf銘所の細胞変性活性を担う物質はCM に 存在 する 物質 ではな いか と推 測した。この細胞変性活性はアポトーシスにより説明 で き る の で は な い か と 考 え 、 染 色 体DNAの断 片化 、カ スバ ーゼ の活 性化等 を調 べた が 、ア ポト ーシ スを実 証す る証 拠は得られなかった。そこで、このような細胞変性活 性 を 示 す と い う こ と は 、 こ れ ら の マイ コプラ ズマ がhGFと 強い 相互 作用を し、 何ら か の サ イ ト カ イ ン の 産 生 を 誘 導 し て い る の で は な い か と 考 え た 。 hGFにMsロ ； め ロ 繊 繊 細 胞 のWC浮 遊液 を加 え、16時 間培 養し た後 遠心し 、上 清と 沈 査 に 分 離 し た 。 上 清 に 含 ま れ るIL16およびIL18の産 生量 はELISA法で測 定し 、更 にhGF細 胞 か ら 全m岨 を 抽 出 し 、 サ イ ト カ イ ン のmRNAの 発 現 をRT−PCR法 で 調 べ た 。 そ の 結 果 、 舩sロfめ ロrm繊 細胞 はhGFにn一6お よびH′8の産 生なら びに それ らのmRNAの発現を誘導した。
これ まで に、 マイコ プラ ズマ のりポタンパク質（LP）はマクロファージを活性化し て炎症性サイトカインを誘導することが明らかにされている。そこで、Msロfあロ′f舘桝 のCMか らTdtonXーn4二 相 分 離 法 に よ りLPを 抽 出 し （LPsめ 、hGFに 対 す る 凡16 産生誘導活性を調べた。
そ の 結 果 、LP瑚 は 濃 度 依 存 的 に 凡 邨産 生 誘 導 活 性 を 示 し 、 そ の 活性はCMに 比較 し 明ら かに 強い も・の であ った 。こ のこ とか ち、hGFに 対す るIL16産生誘導活性を担 う物質はマイコプラズマ細胞膜のLPであることが示唆された。
次 に 、LP跏がど のよ うな 受容 体で 認識 され 、細 胞内 にシ グナ ルが 伝達さ れる のか をチャイニーズハムスター卵巣（CH0−K1）細胞を使用し、転写因子nuclearfactor―KB
（NFべB）依 存性 のレ ポー ター アッ セイ 法によ り調 べた 。す なわ ち、CHOーKl細 胞に CD14を 導入 した3E10細 胞に 、pFI´AGベ クター （EastnlanKodak社） に導入 した ヒト のTLR2あ る い はTI´R4のcDNA遺 伝 子 を 、NFxB依 存 性 のCD25レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 と と も に ト ラ ン ス フ ウ ク ト し た 細 胞 （CHO／CD14、CHO／CD1卵LR2な ら び に CHO/CD1卵LR4） を 用 い 、 発 現 し たCD25を フ 口 ー サ イ ト ヌ ー タ ー に より測 定し た。
そ の 結 果 、LPsal刺 激 に よ りCHO/CD14お よ びCHO／CD1卵LR4細 胞 に お い て CD25の 発 現 は 認 め ら れ な か っ たが 、CHO／CD14佰LI也 細 胞 にお い て はCD25の 発 現 が 認 め ら れ た 。 こ の こ と か ら 、CH0−K1細 胞 に お け るLPの 細胞 内 シ グ ナ ル 伝 達 は TLI也を介して行われているものと推測された。
我 々 はTLR2分 子 な ら び にmRNAがhGFに 発 現 し て い る こ と を 既 に 明 ら か に し て ―765―
いる（未 発表デー夕 ）。そこで、抗TLR2抗体がhGFに対するLPの凡ー6産生誘導活 性を阻害するのか否かを調べた。その結果、抗TLR2抗体濃度が増加するに従い凡―6 の産生が 抑制された 。このことから、hGFに対するLPsalの細胞内シグナル伝達は TLR2を介して行われているものと推測された。
【考察と結論】 口腔マイコプラズマであるM. salivariumは歯周結合組織である hGFに、炎症性サイトカインであるIL‑6およびIL‑8の産生を誘導した。その活性物 質はM. salivariumの細胞膜に存在するLPであることが示唆された。また、このLP の受容体の同定を、CHO−・Kl細胞のトランスフェクタントを用いて行ったところ、
Toll‑like receptor2(TLR2)により認識されることが明らかにされた。このTLR2は、
hGF上に おいても発 現が認めら れ、また、 抗TLR2抗体によりLPのサイトカイン誘 導活性が阻害されたことから、hGFにおけるM. salivarium由来LPのサイトカイン誘 導活性はTLR2を介して行われているものと推測された。
これらのことから、hGFにおける炎症性サイトカインであるIL‑6および凡一8の産 生は、TI R2による抗原の認識とそれによ って惹起された細胞内シグナルにより誘導 されたものと推測される。このように、M. salivariumがhGFに炎症性サイトカイン ならびに接着分子等を誘導する活性を有することは、本マイコプラズマが歯周疾患な ど の 炎 症 局 所 で 何 ら か の 病 因 的 役 割 を 果 た し て い る も の と 考 え ら れ る 。
学位論文審査の要旨 主査 教授 小 口春久 副査 教授 柴田健一郎 副査 教授 鈴 木邦明
学 位 論 文 題 名
口腔マイコプラズマ由来リポタンパク質は Toll‑like receptor2 で認識される
審査 は柴 田、鈴 木両 副査 が一 同に 会し て、 小口 主査 は個 別に 実施 し、学 位申 請者 に 対し て提 出論文 の内 容と それに関連する学科目について口頭試問の形式によって行わ れた。以下に提出論文の要旨と審査の内容を述べる。
ヒ ト正 常 歯 肉 線 維 芽 細 胞(hGF)を コン フル エン トの 状態 にな るま で培養 した 後、
代表的な口腔マイコプラズマであるM. salivarium細胞、その細胞膜ならびにM. orale 細胞 で刺 激した とこ ろ、hGFは形 態変 化を起 こし 、最 終的には培養器から剥がれた。
この 細胞 変性活 性をM. salivarium細 胞と細 胞膜 とで 比較したところ、細胞膜が強い 活性 を有 してい た。 この こと から 、hGFに対 するM. salivariumの 細胞変 性活 性を 担 う物 質は 細胞膜 に存 在す る物質ではないかと推測した。この細胞変性活性はアポトー シ ス によ り 説 明 で き る の で は ない かと 考え、 染包 体DNAの 断片 化、 カスパ ーゼ の活 性化 など を調べ たが 、ア ポトーシスを実証する証拠は得られなかった。そこで、この よ う な細 胞 変 性 活 性 を 示 す と いう こと は、こ れら のマ イコ プラ ズマ がhGFと強 い相 互作 用し 、なん らか のサ イト カイ ンの 産生 を誘 導し てい るの では ないか と考 えた 。 hGFをM. salivarium細胞 浮遊 液で 刺激 した とこ ろ、 炎症 性サ イト カイン であ るIL‑6 お よ びIL‑8が 産 生 さ れ て い る こ と が わ か っ た 。 さ ら に 、hGFか ら全RNAを 抽出 し、
こ れ ら の サ イ ト カ イ ン のmRNAの 発 現 をRT‑PCR法 で 調 べ た と こ ろ 、 そ れ ら の mRNAの発現も誘導されていることが確認された。
マ イコ プラズ マ細 胞膜 に存 在す るり ポタ ンパ ク質(LP)がマ クロ ファー ジを 活性 化 して 炎症 性サイ トカ イン を誘導することがこれまでに明らかにされていることから、
hGFに 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン を 誘 導 する 物 質 はLPで は な い か と推 測し た。 そこ で、M salivariutmの 細 胞 膜 か らTritonX‑114二相分 離法 によ りLPを抽 出し 、hGFに対 する
IL‑6産生誘導活性を調べた。その結果、LPは濃度依存的にIL‑6産生誘導活性を示し、
その活性は細胞膜に比較して明らかに強いものであった。このことから、hGFに対す るIL―6産生誘導活性を担う物質はM. salivarium細胞の細胞膜に存在するLPである ことが示唆された。
次に、マイコプラズマの細胞膜LPがどのような受容体で認識され、細胞内にシグ ナルが伝達 されるのか をチャイニ ーズハムスター卵巣(CHO‑K1)細胞を使用し、転 写因子NFーKB依存 性のレポ一 夕ーアッセイ法により調べた。すなわち、CHO‑K1細 胞にCD14を導入した細胞に、ヒトのToll‑like receptor2(TLR2)あるいはTIーR2と TLR4のcDNA遺 伝子 をNF―KB依存性 のCD25レポ一夕 一遺伝子と ともに導入 した細 胞 (CHO/CD14、 CHO/CD14/TLR2な ら び に CHO/CD14/TLR4)を 用 い た 。 そ の 結 果 、LP刺 激 に よ りCHO/CD14お よ びCHO/CD14/TLR4細 胞に お いてCD25 の発現は認 められなか ったが、CHO/CD14/TLR2細胞におい てはCD25の発現が認め られた。こ のことから 、、CHO‑K1細胞におけるLPの細胞内シグナル伝達はTLR2を 介して行われて．いるものと推測された。柴田らはTLR2がhGFに発現していること を既に明ら かにしてい る。そこで 、抗TI一R2抗体がhGFに対す るLPの刺激により IL‑6産生の誘導活性を阻害するか否かを調べた。その結果、抗体濃度依存的にIL‑6 の産 生 が阻 害 され た 。こ の こと か ら、hGFに 対 するLPの 細胞内シグ ナル伝達は TLR2を介して行われているものと推測された。
学位申請者に対して論文内容に関連する質問が行われた。主な質問事項は以下のと おりである。
1） マ イ コ プ ラ ズ マ の 構 造 上 の 特 性 とM. salivarizrmの 病 原 性 に つ い て 2）歯周疾患の炎症局所における炎症性サイトカイン(IL‑6、IL‑8)と細胞接着分子 (ICAM‑I)の役割にっいて
3） 自 然 免 疫 と Toll− like receptorの 病 原 体 認 識 機 構 に っ い て これらの質問に対しそれぞれ適切な回答が得られ、また、本研究は、口腔マイコプ ラズマがhGFに炎症性サイトカインを誘導する物質がLPであり、そのレセプ夕一が 現在自然免疫系でもっとも注目されているTLR2であることを明らかにした点、さら に口腔微生物由来リポタンバク質が歯周疾患においてなんらかの病因的役割を果たし ている可能性を示唆した点が高く評価された。
現在、さらに詳細な解析の準備を進めており、将来の展望についても評価された。
レたがって、学位申請者は博士（歯学）の学位授与に相応しい者と認められた。
