博 士 （ 歯 学 ） 齋 藤 豪 紀
学 位 論 文 題 名
骨 芽細 胞様 細胞 の Mg2 ゛ 依存 性 ATPase 活性の性質 学位論文内容の要旨
【緒 言】骨 組織 の形成 におい ては、 骨芽 細胞が コラー ゲンな どの石 灰化 の基質 を合成 した後 に、 細胞外 に分泌 し形成 さ れ た 基 質に カ ル シ ウ ム(Ca)やり ン(P)が蓄 積 し て 石 灰化 が 生 じ る 。骨 芽細胞 の分化 や増殖 、機 能の調 節に関 しては 多 くの 報告が あり 現在も 活発な 研究が なさ れてい るが、 石灰化 部位へ の無 機イオンの輸送や蓄積の機構に関してはまだ不明 な 点 が 多い 。 マ ウ ス の頭 蓋 冠 か ら 樹立 さ れ たMC3T3‑E1細 胞(El細 胞 ）は骨 原性 細胞か ら骨芽 細胞に 分化 し、培 養中の ディ ッシュ 内に 石灰化 組織を 形成す るこ とから 、硬組 織形成 機構の 研究 に広く用いられている有用な細胞である。El細胞 培養 中の石 灰化 に伴い 、経時 的に増 加す るCaz+およ びMg2+.Arj｀Pase活性が存在し、Ca2+.ATPase活性の基本的な性質は、
ア ル カ リ性 が 至 適pHで あ り 、Caに 対 す る 親 和性 が 非 常 に 高い こ と 、 リ ン酸 化 反 応 中 間体(EP)を形 成 す るP型ATPase の特 徴を示 す。 骨切片 を用い た組織 化学 的な研 究にお いて、 骨形成 が行 われている側にアルカリ性ホスファターゼとは異 なる 中性か らア ルカリ 性が至 適pHで あるCa2゛お よびMg2+.AIヽPase活性 が存在 するこ とが 知られ ている 。E1細 胞には 培 養中 の石灰 化に 伴い経 時的に 増加す るCa2十お よぴMg2十．ATPase活性 が存在 し、骨切片においても骨形成が行われている 側にCa2゛およぴMg2゛囎I、Pa8e活性が存在すること、また、両觚・Pa8eの性質が類似していることから、Ca2十、Mg2゛‐ATPa8e がCaあ る い はMgを 石 灰 化部位 に輸 送する パrP・aBe活性 とし て石灰 化に関 与して いる 可能性 もある と考え られる 。そ こ で、 石灰化 にお ける両ATPa8eの関 与を明 らか にする ことを 目的と する研 究を 計画し た。本 研究で は、Mぎh．ATPase活性 の 性 質 につ い て の 報 告が 少 な ぃ こ とか ら 、E1細胞 のMg2十‐ATPa8e活 性 のpH、Mgおよ ぴ 觚P濃度 依存性 と活 性に対 す る各種金属イオン、及ぴ觚やase活性阻害剤の影響などの基本的な性質を検討した。
【 材 料 と方 法 】El細胞 は10％牛 胎 仔 血 清 を 加え たa．M亜M中 で5％C02．95％空気 、37℃ 気相下 にて培 養した 。コン フ ルエ ント後3〜5週 の石灰 化期に あるE1細胞を 回収し 、超 音波破 砕処理 を行っ た。 核とミ トコン ドリア 及び細 胞質 を除い たミ クロソ ーム 分画を 調整し て、活 性測 定の材 料とし た。ATPa8e活性は 、觚P加水 分解 により 生成された無機リン量を、
Cbi佃et法に従って定量することによって測定した。
【結果】
・Mg2゛．ATPa8e活性の基本的性質
MC3T3゜E1細 胞 のCa2十 一ATPaseは ア ル カ リ 性 に至 適pHを有 し 、pH8．56付 近と10．43付近 で最大 活性を 示すこ とか ら、Mg2＋ ‐ATPa8eについ ても活 性のpH依存性を調ぺた。その結果、活性は中性付近からpHの増加に伴って増大し、pH9．47 付近において最大活性を示した後減少し、pHn．oo付近に小さなショルダーを示した。
Mg2十 ‐ATPa8e活 性 のMg濃 度 依 存性 を 調 ぺ たと ころ、 活性 は遊離Mg濃度依 存性 に増加 し，1．67mMで 最大 となっ た。ま たMgに よ る50％ 活 性 化 濃 度 は 約n011MMgで あ っ た。Mg2十‐ 衄Pase活 性 の 觚P濃度 依 存 性 を 調べ た と こ ろ 、活 性 は 觚｀Pの 濃度に 依存性 して 増加し た。そ こで、ATP濃 度と 活性の 二重逆 数プロ ットを行った。プロツ卜は折れ曲がり、それ ぞ れ の 直 線 か らKD．5値 が 80mと1．7mMの 觚lPに 対 す る 高 ・ 低 親 和 性 の 結 合 部 位 が 検 出 さ れ た 。
・Mg2゛．越四a8e活性に対する各種金属イオンの作用 ―532―
pH 9.47で 最 大 活 性 を 示 すMg2十 ・ 觚IPase活 性 に 対 す る 各 種 イ オ ン の 影 響 を 調 ぺ 、lmMのMg存 在 下 のATPa8e活J陸 を 100％ と し た 相 対 値 で 示 し た 。1mMのMgを 添 加 し て2mMに な る と 、 活 性 は20％ 程 度 低 下 し た 。 他 の2価 金 属 イ オ ン を 添 加 す る と1mMの マ ン ガ ン （Mめ で は90％ 、 銅 （Cb） で は60％ 、Ca存 在 下 で は30％ の 活 性 抑 制 が み ら れ た 。 こ の ATPa8eがNが ，K＋ ．ATPaseで あ る 可 能 性 を 調 ぺ る た め に ナ ト リ ウ ム （Na冫 の 効 果 を 調 ぺ た が 、 活 性 は 濃 度 に 依 存 し て 低 下 し た 。 同 様 にpHn． OOに お け るlmMのM呂 存 在 下 のATPa8e活 性 に 対 す る 各 種 金 属 イ オ ン の 効 果 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、1mMの Mn存 在 下 で 35％ 、CuとCaでlOか ら20％ 、Naで40％ 程 度 の 活 性 の 低 下 が み ら れ た 。pH9． 47とn．oo で のlmMMg存 在 下 のATPase活 性 に 対 す るMnに よ る 瀞 陸 抑 制 の 濃 度 依 存 性 を 調 べ た 。 活 性 はpH9．47で はMnの 濃 度 に 依 存 し て 低 下 し 、1mMで は10％ 程 度 と な っ た 。Mnに よ るMg2十 ― パrPase活 性 の50％ 阻 害 濃 度 は 約O．7mMで あ っ た 。 一 方 、pHll．00で はlOOllM以 下 の 低 い 濃 度 で 活 性 の 低 下 が 見 ら れ た が 、lmMま で 濃 度 を 上 げ て も66％ 程 度 の 活 性 が 残 存 し て い た 。P型ATPa8eで あ るNa十 ，I【 ＋ ‐A1珊8eは 、 数llMの 白 金 （Pt冫 に よ り 活 性 が 阻 害 さ れ る こ と から 、P型 ATPa8eの 可 能 性 が あ るMg2゛ ￣AH）ase活 性 に 対 す るPtの 影 響 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 測 定 し た す ぺ て のpHに お い て 、1mM のPtは1mMのMg存 在 下 のAロa8e活 性 を 抑 制 し な か っ た 。
・Mg2十 ．ATPase活 性 に 対 す る 阻 害 剤 の 影 響
Mg2十 ．ATPa8e活 性 に 対 す る 各 種 觚Pase阻 害 剤 の 影 響 を 調 ぺ た 。pHを 広 く 変 え てP型 越 ぽaseの 代 表 的 な 阻 害 剤 で あ るvanadate（1五M） のMg2十 ‐ パIPa8e活 性 に 対 す る 作 用 を 調 ぺ た と こ ろ 、pH9．47で は50％ の 活 性 が 抑 制 さ れ た が 、pH n．00で は 活 性 は 抑 制 さ れ な か っ た 。lmMvana出lteのpH9．47に お け る 活 性 抑 制 が60％ で あ っ た の で 、vanadateの 濃 度 を 広 く 変 え て 活 性 の 濃 度 依 存 性 を 調 ぺ た 。 そ の 結 果 、O．3mMで 約30％ の 活 性 が 阻 害 さ れ 、 さ ら に 濃 度 が 上 が ると 活 性 は 減 少 し た が 、10mMのvaDadateが 存 在 し て も30％ の 活 性 が 残 存 し 、 完 全 に 阻 害 す る こ と は で き な か っ た 。 さ ら に 低 濃 度 のvanadateで の 活 性 低 下 の 濃 度 依 存 性 を 調 べ た と こ ろ 、 数 脚 で20％ 強 の 活 性 が 低 下 し た 。 ミ ト コ ン ド リ ア のATPase を 阻 害 す るaZideの 影 響 を 広 くpHを 変 え て 調 べ た と こ ろ 、azideに よ っ てMg2゛ ‐ATPase活 性 は ど のpHに お い て も20 か ら30％ の 活 性 が 抑 制 さ れ た 。 そ こ で 、aZideに よ る 阻 害 の 濃 度 依 存 性 を 調 ぺ た と こ ろ 、1か ら10pMのazideで20％ 程 度 の 活 性 が 低 下 し 、 そ れ 以 上 濃 度 を 上 げ て も 活 性 の 低 下 は 起 こら な い こ と が 示 さ れた 。Na，K．ATPaseの 特 異的 な 阻 害 剤 で あ るouaba血 で は 、 広 い 濃 度 範 囲 で 活 性 の 抑 制 は み ら れ な か っ た 。
【 考 察 】MC3T3．E1細 胞 は 、 骨 原 性 細 胞 か ら 骨 芽 細 胞 に 分 化 す る と 、 泣vitroで 分 泌 し た 基 質 を 石 灰 化 す る 細 胞 株 で あ る 。Ca2゛ ．ATPaseは ア ル カ リ 性 に 至 適pHを 有 し 、pH8．56付 近 と10．43付 近 で ピ ー ク を 示 す が 、 本 研 究 に お け る Mg2十 ．ATPa8e活 性 もpH9．47で 最 大 活 性 を 示 しn，00付 近 で シ ョ ル ダ ー を 示 し た 。P型ATPa舶 の う ちNa゛ ，K＋ ￣ 朋 ぼa8e あ る い は 形 質 膜 に 存 在 す るCa2゛ ．ATPaseの 至 適pHは 中 性 で あ る が 、 本 研 究 のMg2十 ．ATPaBeは ア ル カ リ 性 で あ っ た 。 今 後 、 ア ル カ リ 陸 環 境 の 硬 組 織 石 灰化 に お け る 必 要 性 と、 ア ル カ リ 性 環 境の 形 成 に 関 与 し てい る シ ス テ ム に っ いて 、 明 ら か に す る 必 要 が あ る 。pH9．47のMg2十 ・ 觚tPa8e活 性 は60％ で あ る がvanadateに よ っ て 阻 害 さ れ た 。 ま た 、1mMのMn 及 ぴCuに よ っ て90及 ぴ60％ 阻 害 さ れ 、Mnに よ る50％ 阻 害 濃 度 は 約O．7mMで あ っ た 。 ー 方 、pHn．OOのMg2十 ‐r丶Pa8e 活 性 はvana（lateに よ っ て 阻 害 さ れ ず 、lmMのMn及 ぴ （kに よ っ て86及 び15％ し か 阻 害 さ れ な か っ た 。 ま た 、Ml二Lに よ る 阻 害 はO．1mM程 度 で 生 じ た こ と か ら 、pH9．47とn．ooで 観 察 さ れ るMg2十IArPase活 性 は 別 の 酵 素 に よ る 活 性 と 推 測 さ れ る 。Mg2＋ ． パrPa8eが 、 觚 丶Pに 対 する 高 ・ 低 の 両 親 和 性部 位 を 示 す こ と 、及 ぴvaIladateに よ っ て 阻害 さ れ る こ と か らP型ATPaseの 特 徴 を 保 持 し て い る 。 し か し 、Ptに よ っ て 阻 害 さ れ な い こ と か らNnK＋ ．ATPa8eな ど と は 異 な っ て い る 。 放 射 性 の 飢 丶Pを 用 い てEP形 成 実 験 を 行 い 、 そ の 性 質 を 明 ら か に す る こ と に よ り 、 本 酵 素 がP型 觚 ヽPaseに 属 す る の か 否 か に っ い て 決 定 す る 必 要 が あ る 。Mg2゛ ‐ 觚Pase活 性 は多 く の 細 胞 で 検 出き れ る 活 性 で あ る が、 一 般 に そ の 活 性は 低 く 機 能 に 関 し て も ほ と ん ど 知 ら れ て い な ぃ 。 ほ と ん ど の 觚 丶Paseや タ ン パ ク 質 リ ン 酸 化 酵 素 は 活 性 発 現 にMgを 必 要と す る こ と か ら 、Mg2十 ‐ATPase活 性 は そ の 一 部 と し て 測 定 さ れ て い る 可 能 性 も あ る 。 本 実 験 に おい て もN心 王p．ATPa8eに よ る
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活性である可能性を考え、Na による活性化を調べたが逆に抑制され、
Na+，K+.ATPase の特異的な阻害剤であるouabam によって阻害されなかったことから、Na+,K+‑ATPase とは異なっていた。また、azide によって部分的にしか阻害されな かったことからミトコンドリア酵素とも異なると考えられた。
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