多機能タンパク質 DJ-1 と病態
―酸化ストレス防御因子としての機能―
平 敬 宏
山梨大学大学院医学工学総合研究部分子細胞生物学研究室 要 旨：パーキンソン病は，近年の高齢化社会の到来により患者数の激増が問題化している神経変 性疾患である。パーキンソン病は患者の大多数が加齢を主要因とする孤発性パーキンソン病であり， 若年発症が顕著な家族性パーキンソン病は稀である。家族性パーキンソン病の病因は原因遺伝子変 異による。そのため，この 10 年で 12 個の家族性パーキンソン病原因遺伝子が相次いで明らかにさ れた。発症に複雑な要因が絡む孤発性パーキンソン病に対し，家族性パーキンソン病は原因遺伝子 変異が特定できるため，原因遺伝子産物の機能解析は，家族性のみならず孤発性パーキンソン病発 症機構解明にも重要な手がかりを与えると考えられる。本稿では，家族性パーキンソン病原因遺伝 子（PARK7）である DJ-1 タンパク質の酸化ストレス防御因子としての機能と，パーキンソン病の 発症機構，神経変性抑制作用，さらに，酸化ストレスによる各種疾患治療薬として DJ-1 タンパク 質の可能性，DJ-1 タンパク質の抗酸化ストレス機能を制御することによる細胞死抑制，生物種間 での DJ-1 機能の変異，臨床診断指標化への可能性ついて基礎生物学的な解析を紹介する。 キーワード 神経変性疾患，パーキンソン病，酸化ストレス，DJ-1 I はじめに DJ-1 は 1997 年に我々が ras と協調的に細胞が ん化を促進する新規遺伝子として報告した1）。 表 1 に示すようにヒトなどのホ乳類では例外な く 189 アミノ酸残基の比較的小さなタンパク質 であり，ショウジョウバエからヒトに至る生物 種間で高度に保存されたタンパク質である。ヒ トでは遺伝子座 1p36.12-13 に位置し，この領域 は消化器がん，肺がん，乳がん，神経芽腫など の種々のがんで LOH（Loss of heterozygosity） が観察され，がん（抑制）遺伝子としての機能 が示唆された。 その後，内分泌かく乱物質により，精巣・精 子で減少するタンパク質であり，システインプ ロテアーゼ活性を有すること，AR（Androgen receptor）の正の転写制御因子であること，タ ンパク質立体構造などが我々を含めた国内外の 研究により明らかにされた2,3,4,5）。 2003 年になり，イタリアの 2 家族の家系調 査の結果，DJ-1 が家族性パーキンソン病原因遺 伝子（PARK7）であることが報告された6）。か ねてから，第一染色体短腕には連鎖する 2 つの 家族性パーキンソン病原因遺伝子（PARK6 お よび PARK7）の存在が推定されていたが，1 つ が PARK7 である DJ-1,もう 1 つが PARK6 の原因 遺伝子である PINK1（PTEN-induced putative kinase 1）と明らかにされた7,8）。表 2 に示すよ うに，現在までに 12 の家族性パーキンソン病 原因遺伝子座が示唆され，そのうち 7 つの遺伝 子が同定されている。孤発性パーキンソン病の 〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110 受付： 2006 年 11 月 17 日 受理： 2006 年 11 月 17 日総 説
主たる病因が，加齢と不確定要素の蓄積による のに対し，家族性パーキンソン病では原因遺伝 子産物の機能破綻（変異・置換・欠失）と特定 されることから，これらの遺伝子産物解析は， 家族性のみならず孤発性パーキンソン病発症原 因解明の大きな手がかりとなる。 II 抗酸化ストレス因子としての DJ-1 タンパ ク質 DJ-1 は，Northern Blot により，すべての組 織（臓器）で ubiquitous に発現しているが， 脳，精巣で極めて発現が高い。さらに，一つの 表 1．各生物種の DJ-1 1 60 human ＭＡＳＫＲＡＬＶＩＬＡＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩＫＶＴＶＡＧＬＡＧＫＤＰＶＱＣＳＲＤＶＶＩＣＰＤＡＳＬＥＤ mouse ＭＡＳＫＲＡＬＶＩＬＡＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＶＤＶＭＲＲＡＧＩＫＶＴＶＡＧＬＡＧＫＤＰＶＱＣＳＲＤＶＭＩＣＰＤＴＳＬＥＤ chicken ＭＡＳＫＲＡＬＶＩＬＡＫＧＡＥＥＭＥＴＶＩＰＴＤＶＭＲＲＡＧＩＫＶＴＶＡＧＬＴＧＫＥＰＶＱＣＳＲＤＶＬＩＣＰＤＡＳＬＥＤ Frog −−−−−−−−−−−−−−−−ＭＥＴＶＩＰＴＤＶＭＲＲＡＧＩＫＶＴＶＡＧＬＳＧＫＤＰＶＱＣＳＲＤＶＭＬＣＰＤＴＳＬＥＥ Fly −−−−−−−−−−−−−−−−ＭＥＦＴＩＳＡＤＶＬＲＲＧＫＩＬＶＴＶＡＧＬＨＤＣＥＰＶＫＣＳＲＳＶＶＩＶＰＤＴＳＬＥＡ ＊＊ ・＊・・＊＊：＊＊・ ＊ ＊＊＊＊＊＊ ・ ：＊＊：＊＊＊・＊：： ＊＊：＊＊＊ 61 120 human ＡＫＫＥＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳＥＳＡＡＶＫＥＩＬＫＥＱＥＮＲＫＧＬＩＡＡＩＣＡＧＰＴＡＬＬＡＨＥＩＧＣＧ mouse ＡＫＴＱＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳＥＳＰＭＶＫＥＩＬＫＥＱＥＳＲＫＧＬＩＡＡＩＣＡＧＰＴＡＬＬＡＨＥＶＧＦＧ chicken ＡＲＫＥＧＰＹＤＶＩＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳＥＳＡＡＶＫＤＩＬＫＤＱＥＳＲＫＧＬＩＡＡＩＣＡＧＰＴＡＬＬＡＨＧＩＧＦＧ Frog ＡＲＴＱＧＰＹＤＶＶＶＬＰＧＧＮＬＧＡＱＮＬＳＥＳＰＶＶＫＥＶＬＫＥＱＥＡＫＫＧＬＩＡＡＩＣＡＧＰＴＡＬＴＶＨＧＶＧＩＧ Fly ＶＴＲ−ＧＤＹＤＶＶＶＬＰＧＧＬＡＧＮＫＡＬＭＮＳＳＡＶＧＤＶＬＲＣＱＥＳＫＧＧＬＩＡＡＩＣＡＡＰＴＡＬＡＫＨＧＩＧＫＧ ＊ ＊＊＊：＊＊＊＊＊ ＊ ： ＊ ：＊・ ＊ ：：＊： ＊＊ ： ＊＊＊＊＊＊＊＊・＊＊＊＊ ＊ ：＊ ＊ 121 180 human ＳＫＶＴＴＨＰＬＡＫＤＫＭＭＮＧＧＨＹＴＹＳＥＮＲＶＥＫＤＧＬＩＬＴＳＲＧＰＧＴＳＦＥＦＡＬＡＩＶＥＡＬＮＧＫＥＶＡＡＱ mouse ＣＫＶＴＴＨＰＬＡＫＤＫＭＭＮＧＳＨＹＳＹＳＥＳＲＶＥＫＤＧＬＩＬＴＳＲＧＰＧＴＳＦＥＦＡＬＡＩＶＥＡＬＶＧＫＤＭＡＮＱ chicken ＳＫＶＩＴＨＰＬＡＫＤＫＭＭＮＧＡＨＹＣＹＳＥＳＲＶＥＫＤＧＮＩＬＴＳＲＧＰＧＴＳＦＥＦＧＬＡＩＶＥＡＬＭＧＫＥＶＡＥＱ Frog ＫＴＩＴＴＨＰＬＡＫＤＫＩＶＮＰＤＱＹＫＹＳＥＥＲＶＶＫＤＥＮＦＩＴＳＲＧＰＧＴＳＦＥＦＡＬＥＩＶＣＴＬＬＧＫＥＶＡＥＱ Fly ＫＳＩＴＳＨＰＤＭＫＰＱＬＫＥＬＹＣＹＩＤＤＫＴＶＶＱ−ＤＧＮＩＩＴＳＲＧＰＧＴＴＦＤＦＡＬＫＩＴＥＱＬＶＧＡＥＶＡＫＥ ・： ：＊＊ ＊ ：： ： ＊ ・： ＊ ＊ ：：＊＊＊＊＊＊＊：＊：＊・＊ ＊・ ＊ ＊ ：：＊ ： 181 189 human ＶＫＡＰＬＶＬＫＤ mouse ＶＫＡＰＬＶＬＫＤ chicken ＶＫＡＰＬＩＬＫＤ Frog ＶＫＴ−−−−−− Fly ＶＫＴ−−−−−− ＊＊： ＊は生物種間（ヒト，マウス，ニワトリ，アフリカツメガエル，ショウジョウバエ）で共通なアミノ酸， ・および：は類似性の高いアミノ酸を示す。 表 2．家族性パーキンソン病の分類 遺伝子座 遺伝子 遺伝形式 PARK1/4 4q21-22 α-synuclein AD PARK2 6q5-27 Parkin AR PARK3 2p13 unknown AD
PARK5 4p14 UCH-L1 AD（？）
PARK6 1p35-36 PINK1 AR PARK7 1p36.12-13 DJ-1 AR PARK8 12p11.1-q13.1 dardarin/LRRK2 AD PARK9 1p36 unknown AR PARK10 1p32 unknown ？ PARK11 2q36-37 unknown ？ PARK12 Xq21-q25 unknown ？ PARK13 2p12 Omi/HrA2 ？ AD ：常染色体性優性遺伝 AR ：常染色体性劣性遺伝
細胞に 105から 106分子存在する非常に abun-dant なタンパク質である。我々の DJ-1 のがん 遺伝子としての機能報告ののち，培養臍帯内皮 細胞にパラコート，過酸化水素など酸化ストレ ス曝露により，DJ-1 タンパク質発現誘導が報 告された9,10）。 また，オルニダゾールなどの抗原虫薬，およ びエピクロロヒドリンなどの内分泌かく乱物質 が投与されると，精巣機能障害にともなう精子 数減少・不妊も報告されていた。Wagenfeld ら は，ラットでこれらの化合物投与群と非投与群 間で，精巣で量的変動するタンパク質を検索し ていた。DJ-1 を新規がん遺伝子として報告し た直後，Wagenfeld らが部分的にペプチド配列 を決定していた精巣で顕著に減少（分解）する タンパク質が，DJ-1 のラットホモログである 可能性が高いと連絡を受けた。そこで，我々が 作成した DJ-1 抗体を送付し，精巣組織染色， Western Blot の結果，彼らが検索していたタン パク質は DJ-1 であった3）。DJ-1 タンパク質は精 細管内腔に存在し，化合物投与に従い減少し， それに平行して不妊を示すことが明らかになっ た。 内分泌かく乱物質は，細胞に活性酸素分子種 （ROS: reactive oxygen species）を生成させる
ことが明らかにされており11），精巣機能の酸 化ストレス防御に DJ-1 タンパク質が機能する ことが示唆された。詳細は後述するが，DJ-1 タンパク質は自己酸化することにより ROS を 消去し，過剰酸化型 DJ-1 タンパク質は細胞内 で非常に不安定で直ちに分解される。通常，精 巣で生成された ROS は，DJ-1 タンパク質によ り消去されるが，内分泌かく乱物質などによる 過度な酸化ストレスにより誘発された大量の ROS により，DJ-1 タンパク質は過剰酸化型へ 転換され直ちに分解されることから，DJ-1 タ ンパク質による ROS 消去が不完全となり精巣 に ROS による傷害がもたらされ不妊にいたる と示唆された。 DJ-1 遺伝子が PARK7 原因遺伝子と明らかに なった直後，我々は以下の理由からパーキンソ ン病発症を DJ-1 タンパク質の機能不全による 酸化ストレス傷害と仮説をたてた。 理由 1 ：パーキンソン病の病態が中脳黒質ド パミン神経細胞の変性であること 理由 2 ：パラコートと同様な化学構造をと る MTPT（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 -tetrahydropyridine）が，アストロ グリアでモノアミン酸化酵素 B によ りMPP+（1-methyl-4 -phenylpyridini-um ion）に変換され，選択的に黒 質ドパミン神経に取り込まれミトコ ンドリアを傷害し，パーキンソン病 態を招致すること12,13） そこで，MPP＋および MPP＋と同様にミトコ ンドリアを傷害する Rotenone をヒト網膜芽細 胞腫由来 SH-SY-5Y 細胞に各種濃度で添加し DJ-1 タンパク質の挙動を調べた。その結果，両薬 物ともに sublethal な濃度で最大の DJ-1 タンパ ク質発現誘導が見られた14）。さらに，酸化ス トレスに曝された細胞では，DJ-1 タンパク質 の 47,53,106 番目の 3 つのシステイン残基が自 己酸化することにより，ROS を消去すること が明らかになった15）。システインは，Cyteine
（sulfhydryl），Cystein sulphinic acid, Cystein sul-phonic acid と構造を変え最終的には，システ イン 1 分子で酸素を 3 分子吸収可能である。す なわち，一分子の DJ-1 が 9 分子の酸素を消去 可能で，さらに，DJ-1 タンパク質が細胞に大 量に存在することから，大量の ROS 消去が可 能であることが判明した。非ストレス時におい ても DJ-1 は非常に大量存在するタンパク質で あるが，正常型 DJ-1 タンパク質を恒常的発現 細胞株では，酸化ストレスに対する抵抗性がさ らに増強された。一方，siRNA により内在性 DJ-1 タンパク質をノックダウンした細胞では 酸化ストレスに非常に脆弱になった14）。これ らの事実から DJ-1 タンパク質が，それまでに 知られていた peroxidoredoxin 等の酵素的な ROS 消去機能とは全く異なる ROS 消去機能が 示唆された。
DJ-1 タンパク質の量的変動による ROS 消去 能変動に加え，PARK7 患者で検出された各種 DJ-1 変異体の恒常的発現細胞株でも，ROS 消 去能が低下し，酸化ストレスに脆弱になった16）。 変異体の ROS 消去能低下の理由として構造生 物学的解析から，DJ-1 タンパク質の ROS 消去 能には DJ-1 自身の homodimer 形成が必須であ ることが明らかになった。これらの変異体では homodimer 形成が阻害され，ROS 消去能が低 下する事が推定された。さらに，変異体では， 野生型 DJ-1 が，可溶性タンパク質であるのに 対し，不溶化し凝集体を形成することが明らか となった。実際，孤発性パーキンソン病剖検脳 においても，DJ-1 タンパク質の発現誘導，酸 化型 DJ-1 の増加，変異型 DJ-1 の不溶化が明ら かになり，DJ-1 タンパク質の変異による酸化 ストレス防御機構破綻が，パーキンソン病発症 メカニズムの一つであると考えられた17）。 III DJ-1 タンパク質のドパミン神経保護作用 DJ-1 タンパク質による酸化ストレス防御機 構とパーキンソン病発症を関連して考えると， パーキンソン病では，なぜ中脳黒質ドパミン神 経細胞にのみ選択的な細胞損傷がおこるか疑問 が生じた。そこで，脳各部位での DJ-1 タンパ ク質の存在を調べた。ラットおよびヒトでは， DJ-1 タンパク質は海馬，大脳皮質，黒質，線 条体では恒常的に高い発現が見られるが，黒質 ドパミン神経での発現が低かった18）。そのた め，DJ-1 タンパク質発現量の低さが，ドパミ ン神経の酸化ストレスに対する脆弱性の原因と 示唆された。そこで，6-OHDA（6-hydoroxy-dopamine, MPP＋と同様に ROS を産生し，ミ トコンドリアを傷害し黒質ドパミン神経細胞死 を誘発）を，ラット中脳黒質に注入すると正常 （還元）型および酸化型 DJ-1 タンパク質が減少 し，過剰酸化型 DJ-1 タンパク質が増加した。 このため中脳黒質においても DJ-1 タンパク質 が ROS を消去していることが明らかになった。 そこで，GST（glutathione S-transferase）融合 ヒト野生型 DJ-1 組換えタンパク質（DJ-1）を 6-OHDA と中脳黒質へ同時，または 12 時間後に 注入し，9 週間後のドパミン神経細胞の生死を チロシン水酸化酵素（TH: tyrosine hydroxylase） の免疫染色で解析した。その結果，6-OHDA 単 独注入に対し，DJ-1 同時注入により有意にド パミン神経細胞死が抑制された（図 1A）。 一方，PARK7 患者で見いだされた，変異体 組換えタンパク質（L166P）および GST タン パク質では，神経細胞死抑制作用は見られなか った（図 1A, 1B）。さらに，6-OHDA 注入 12 時 間後の野生型 DJ-1 タンパク質注入でも，ドパ ミン神経保護作用が見られた（図 1B post-injec-tion）。 また，同時注入群（co-injection），または 6-OHDA 注入 12 時間後に各種タンパク質を注入 したラット（post-injection）の，メタンフェタ ミン誘発性同側性旋回運動数を測定した。その 結果，野生型 DJ-1 を注入した群は，6-OHDA 単独注入，L166P-DJ-1，GST 注入群に比べ顕著 に旋回運動が減少しており，行動（運動）障害 改善が認められた（図 2A, 2B）19）。このような 行動傷害改善作用は，図 1 で示された DJ-1 タ ンパク質によるドパミン神経細胞死抑制作用と 同一の結果であった。 ここで，問題となるのが注入した外来性タン パク質が，ドパミン神経細胞に取り込まれて作 用を発揮するのか，または外来性タンパク質が ドパミン神経細胞の外側で作用を発揮するかで ある。それを知るために，すべての注入タンパ ク質には GST-tag が付加されていることを利用 した。各種タンパク質注入の 24 時間後，中脳 黒質組織切片を抗 GST 抗体で免疫組織染色し 各種タンパク質の存在部位を調べた。同時に生 化学的に細胞分画し，抗 GST 抗体を用いて Western blot 解析により各分画でのタンパク質 の存在を調べた。その結果，外来性各タンパク 質は，何らかの方法でドパミン神経細胞に取り 込まれ，野生型 DJ-1 タンパク質は，ドパミン 神経細胞内で 24 時間安定であるが，L166P 変 異体，GST は直ちに分解され不安定である事
が明らかになった19）。これは，外来性 DJ-1 タ ンパク質が，ドパミン神経細胞内で直接的に細 胞に侵入してきた ROS を消去する，抗酸化ス トレス機能が明らかになった。これらの結果は， DJ-1 タンパク質が，パーキンソン病でのドパ ミン神経細胞死抑制（予防）薬としての可能性 を示し，6-OHDA 注入 12 時間後でも，神経細 胞損傷抑制，運動改善作用が認められることか ら，既に発症されていても症状改善薬としての 機能が期待できる。 さらに，虚血モデルラットにおいても，DJ-1 タンパク質は脳血管障害（脳卒中）による神経 損傷の回避作用が明らかになった。さらに，発 作後 12 時間後投与でもドパミン神経細胞死抑 制作用を示したことから，脳血管障害治療薬と しての可能性も示唆されている20）。 図 1． DJ-1 タンパク質によるドパミン神経保護作用 A ： 6-OHDA（6 mM）を単独，または野生型 DJ-1（DJ-1, 80µM），変異型 DJ-1（L166P, 80µ M），glu-tathione S-transferase （GST, 80µM）と同時に片側（左）の rat 中脳黒質に微量注入（4µL）した。ま た，6-OHDA 注入 12 時間後に野生型 DJ-1（DJ-1, 80µM）を同様に注入した（DJ-1（12 hr））。9 週間後， 脳を摘出・固定後ドパミン神経細胞を抗チロシン水酸化酵素（TH）抗体で免疫組織染色した。スケー ルバーは 1 mm。 B ：チロシン水酸化酵素抗体陽性細胞を定量化した。6-OHDA 単独注入では著しいドパミン神経細胞 死が観察されたが，同時，および 12 時間後に野生型 DJ-1 を注入した場合神経保護作用が見られたが， L166P，GST ではその作用は見られなかった。 ＊＊＊： p ＜ 0.001 vs. 6-OHDA 単独注入群，†††： p ＜ 0.001 vs. DJ-1 注入群
IV 過剰酸化型 DJ-1 タンパク質，変異型タン パク質の細胞毒性作用 通常 DJ-1 タンパク質は，細胞内では核およ び細胞質（特にミトコンドリア）に分布してい る。それに対し，変異型（L166P）および過剰 酸化型 DJ-1 タンパク質は，不溶性となり，ミ トコンドリアに凝集して存在する。ミトコンド リアは ATP 産生のため常に ROS に曝されてい るオルガネラであり，MPP＋および Rotenone は，ミトコンドリア電子伝達系酵素複合体 I （Complex I）を標的として障害する。酸化ス トレス曝露により Complex I が損傷されると ATP 産生低下，膜電位の低下がもたらされミ トコンドリアが傷害を受け，細胞死が誘導され る21）。DJ-1 の ROS 消去能力による神経細胞死 保護機能に加え，酸化変異した DJ-1 タンパク 質がもたらす細胞毒性が推定された。 DJ-1 タンパク質は，正常（還元）型 → 酸化 型 → 過剰酸化型の過程をとる（図 3 上段）。非 酸化ストレス時においては，過剰酸化型は見い だされず，正常（還元）型と酸化型がほぼ同じ 割合で存在する。DJ-1 タンパク質は，ミトコ ンドリア内膜に結合し，産生された ROS によ るミトコンドリ傷害を回避していると考えられ るが，変異型 DJ-1 タンパク質のみならず過剰 酸化型 DJ-1 タンパク質もミトコンドリア上に 凝集し神経変性疾患特有の凝集体を形成し，電 子伝達系を阻害し細胞毒性を与えていることが 明らかとなった。パーキンソン病患者脳でも， 家族性，孤発性共通して脳内で過剰酸化型 DJ-1 タンパク質の不溶化した蓄積・凝集が認めら れる22）。また，in vitro 解析の結果ではあるが， DJ-1 タンパク質はパーキンソン病に特徴的な Lewy 小体の構成タンパク質α-synuclein の凝集 を 阻 害 す る シ ャ ペ ロ ン 活 性 が 明 ら か と さ れ た23）。このシャペロン活性においては，酸化型 が活性型であり，正常（還元）型および過剰酸 化型は非活性型である（図 3 下段左）。 酸化型がシャペロン活性を維持し，過剰酸化 型が異常凝集による細胞毒性を示すことから， 何らかの化合物により DJ-1 タンパク質を酸化 型で酸化を停止させ，過剰酸化型の産生を抑制 することが出来れば，不溶化阻止，凝集体形成 図 2． メタンフェタミン誘発性旋回運動の DJ-1 タンパク質による改善作用 A ：図 1A と同様に 6-OHDA 単独，または野生型（DJ-1），変異型（L166P），GST を同時注入から 1, 3, 5 週間後にメタンフェタミン（2.5 mg/kg）投与後 70 分間のメタンフェタミン誘発性旋回運動数を 測定した。野生型（DJ-1）注入群に異常運動改善作用が認められた。
B ： 6-OHDA と DJ-1, L166P,GST タンパク質同時注入群（co-injection），6-OHDA 注入 12 時間後にタ ンパク質注入群（post-injection（12 hr）で A と同様にメタンフェタミン誘発性旋回運動数を測定し た。野生型（DJ-1）は 12 時間後でも運動改善作用が認められた。
＊＊ p ＜ 0.01, ＊＊＊ p ＜ 0.001 vs. 6-OHDA 単独注入群，
阻止によりミトコンドリア傷害抑制，神経保護 （細胞死抑制）作用が維持され，神経損傷を最 小限に抑制可能ではないかと仮定した。 DJ-1 タンパク質は X 線回折により詳細な立 体構造が明らかになっている5）。また，酸化部 位（システイン部位）も明らかであるため，こ の周辺のタンパク質立体構造をもとに，この部 位に特異的に結合する化合物をコンピューター 上で検索した（Virtual Screening）。その結果， 分子量 400 前後の化合物数種が，酸化型 DJ-1 タンパク質に特異的に結合し，過剰酸化型産生 抑制が期待された。そこで，これら化合物を細 胞培地に添加し，MPP＋および Rotenone への 耐性を検討したところ，過剰酸化型の生成が抑 制され，酸化ストレスによる細胞死を有意に抑 制した24）。上述したように，パーキンソン病 患者では，正常（還元）型 DJ-1 が欠如し，過 剰酸化型が蓄積している。このような過剰酸化 型 DJ-1 の異常蓄積はパーキンソン病に限らず， ア ル ツ ハ イ マ ー 病 ， 筋 萎 縮 性 側 索 硬 化 症 （ALS: amyotrophic lateral sclerosis）において
も観察され8,17），酸化ストレス傷害に対する神 経変性疾患に共通な現象と考えられる。検索さ れた化合物は低分子量であり，ラットでは，経 口投与により血液脳関門を通過することも確認 された。今後，細胞毒性，薬物動態，送達方法 など多くの課題が残るが，これらの低分子化合 物が，パーキンソン病のみならず酸化ストレス による神経変性疾患治療薬への可能性が期待さ れる。 多くの神経変性疾患では異常変性タンパク質 の凝集体形成がみられる。これらの凝集体が細 胞毒性を示す事から，凝集体をリフォールディ ングさせるシャペロン機能を利用する方法があ る。DJ-1 のシャペロン機能をこれらの疾患改 善に利用するために，DJ-1 のシャペロン活性 図 3． DJ-1 の酸化状態と生物活性（酸化制御による創薬開発） 上段：システインの段階的酸化，下段左： DJ-1 の酸化状態と生物活性，下段右： DJ-1 機能と創薬開 発
を最大限に発揮させる活性化機構，すなわち DJ-1 タンパク質の正常（還元）型から酸化型 への転換機構の解明と，その転換を制御する薬 物（活性化制御薬）が得られればタンパク質変 性によりもたらされる多くの疾患治療薬開発へ の展開も期待できる（図 3 下段右）。 一方，DJ-1 の病態指標化への応用も期待で きる。病態をもたらすのは過剰酸化型 DJ-1 タ ンパク質の増加である。増加した過剰酸化型 DJ-1 タンパク質は一部が血液，脳髄液に分泌 される。そこで，過剰酸化型を特異的に ELISA などで容易に定量できれば，神経変性疾患病態 判断指標として利用できることが期待できる。 しかしながら，我々が作成した抗体を始め，現 在流通している DJ-1 抗体は，正常（還元）型， 酸化型，過剰酸化型をすべて認識する。そのた め，血清，脳髄液での過剰酸化型の検出・定量 は，試料からアルブミン等のタンパク質を除去 後，煩雑な等電点電気泳動で分離後，Western Blot により三者を別々に定量するしかない。そ こで，簡便・迅速に過剰酸化型を定量可能にす るため過剰酸化型 DJ-1 タンパク質特異抗体の 作 成 を 試 み て い る25）。 そ れ に よ っ て ， 正 常 （還元）型，酸化型，過剰酸化型の量比を検討 することにより，臨床検査試薬メーカーの協力 のもと迅速な病態判断指標化開発を目指してい る。 V 残された課題 このように PARK7 原因遺伝子 DJ-1 の酸化ス トレス防御機構の破綻によりパーキンソン病を 発症することが明らかになってきたが，残され た疑問点が多く存在している。培養細胞を使用 した研究から，DJ-1 タンパク質がパーキンソ ン病発症に関連したタンパク質であると推定で きたが，世界中で DJ-1 遺伝子を欠損したノッ クアウトマウスが作成された。そのマウスの表 現系は，繁殖率の低下，体躯の低下，ドパミン 受容体 D2 の機能低下を示すがパーキンソン病 症状は示さなかった26,27,28,29）。ショウジョウバ エにおいても，1 系統以外は同様に病態を示さ なかった30,31）。しかしながらいずれの個体も酸 化ストレスに対しては極めて脆弱であった。 欠損動物では，病態を示さなかったがヒト PARK7 患者では明らかに DJ-1 遺伝子が変異し ている。DJ-1 はヒトとマウスでは，全アミノ 酸 189 残基のうち 15 アミノ酸が変異している。 PARK7 変異型 DJ-1 が 1 アミノ酸変異のみでさ まざまな機能変異をもたらす事から，この 15 アミノ酸変異により，マウスではヒトとは異な る制御を受ける可能性がある。その一例として， ドパミン産生律速酵素であるヒトのチロシン水 酸化酵素（TH）遺伝子プロモーターには，負 の転写制御因子である PSF（pyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor）が結 合しているが，DJ-1 タンパク質は PSF と結合 しプロモーターから解離させることで TH 遺伝 子を誘導する。しかしながら，マウスなどゲッ 歯類ではこの制御機構が存在しないなど生物種 に よ る 相 違 が 明 ら か に さ れ て い る32）。 ま た 我々も予備的な知見ではあるが，ヒトおよびマ ウス由来のドパミン神経培養細胞に，同生物種 DJ-1 ま た は 異 種 DJ-1 を 強 制 発 現 さ せ た り ， siRNA により内在性 DJ-1 タンパク質をノック ダウンすると，種によりドパミン代謝系応答が 異なる「種差」を見いだしている。DJ-1 は生 物種間で，高度に保存されたタンパク質である が，生物進化過程でそれぞれの生物種特異的な 制御機構を獲得した可能性が示唆される。 このような種差により，ノックアウトマウス で病態が現れない理由と証明するには，生物種 ごとの遺伝子発現制御機構，酵素タンパク質の 安定性（活性化）検討，DJ-1 タンパク質制御 因子の存在などを解明していかなければならな い。 VI 最 後 に DJ-1 タンパク質の酸化ストレス防御因子と しての機能を主にあげてきたが，DJ-1 はこれ ら以外にも非常に多機能なタンパク質である。
現在までに明らかにされている機能をあげると 1．受精に必須なタンパク質33,34） 2．肺がん，乳がん，膵臓がんの血中マー カー35,36） 3．脳卒中の血中マーカー37,38） 4．がん抑制遺伝子産物 PTEN（phosphatase and tensin）の制御因子39） 5．amyloidotic polyneuropathy への関与40） 6．SUMO-1 修飾により DJ-1 生物学的機能が 制御される41） ヒトでは，189 アミノ酸残基しかない小さな タンパク質が，酸化ストレス防御，転写因子， 生殖，がん，神経変性疾患などさまざまな生体 機能に関与している。DJ-1 タンパク質はその ホモログが真核生物のみならず，大腸菌などの 原核生物にも存在している。このようなタンパ ク質の代表例は SOD 1（superoxide dismutase 1）であるが，SOD 1 は ALS の原因遺伝子であ ることも興味深い。私はかねてから，DJ-1 タ ンパク質は SOD 1 のように地球上の生物が， 好気的呼吸能力を獲得した際に，同時に獲得し た酸化ストレス防御タンパク質であり，生物進 化の過程でさまざまな機能が新たに加わってき たのではないかと考えている。今後も多様な機 能が明らかにされることにより私の勝手な想像 が立証されることを望んでいる。 VI 謝 辞 Myc タンパク質機能解析の一環として c-Myc 結合タンパク質の検索から，c-c-Myc とは無 関係な False clone として DJ-1 は単離された。 がん遺伝子としての機能が明らかになり，論文 投稿するにあたり当時実際に手を動かしてくれ ていた二人の学生（DAISUKE & JUNKO）の頭 文字をとり DJ-1 という仮の名前を付けた。DJ-1 がヒト由来であったこと，呼びやすく，覚え やすい名前のためか，同時期に公表された他生 物種のホモログ名 RS,CAP-1,SP22 という名が駆 逐され，DJ-1 が世界中ですっかり定着してし まった。仮につけた名前が機能の重要性のため 世界で認められたことは研究者としてうれしい 反面，安易に命名したことに少々後ろめたさも 感じている。実際，国際学会などで，DJ-1 は 日本語でどのような意味があるのか，命名由来 を尋ねられると回答に躊躇してしまう。 しかしながらこの興味深いタンパク質機能を 多くの学生，大学院生とともに解析できたこと を感謝するとともに，当初 False clone であり ながら，研究続行を黙認してくださり，さらに ご指導いただいた有賀寛芳北海道大学薬学研究 院教授，動物実験，分析化学，構造生物学，薬 理学と私の不得手な領域でご指導，ご協力いた だいた多くの共同研究者に感謝いたします。 文 献
1） Nagakubo D, Taira T, Kitaura H, Ikeda M, Iguchi-Ariga SM, Ariga H.: DJ-1, a novel onco-gene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras. Biochem Biophys Res Commun, 231(2): 509–513, 1997.
2） Wagenfeld A, Gromoll J, Cooper TG.: Molecular cloning and expression of rat contraception asso-ciated protein 1 (CAP1), a protein putatively in-volved in fertilization. Biochem Biophys Res Commun, 251(2): 545–549, 2000.
3） Wagenfeld A, Yeung CH, Shivaji S, Sun-dareswaran VR, Ariga H, Cooper TG.: Expres-sion and cellular localization of contraception-as-sociated protein. J Androl, 21(6): 954–963, 2000. 4） Takahashi K, Taira T, Niki T, Seino C,
Iguchi-Ariga SM, Iguchi-Ariga H.: DJ-1 positively regulates the androgen receptor by impairing the binding of PIASx alpha to the receptor. J Biol Chem, 276(40): 37556–37563, 2001.
5） Honbou K, Suzuki NN, Horiuchi M, Niki T, Taira T, Ariga H, et al.: The crystal structure of DJ-1, a protein related to male fertility and Parkinson’s disease. J Biol Chem, 278(33): 31380–31384, 2003.
6） Bonifati V, Rizzu P, van Baren MJ, Schaap O, Breedveld GJ, Krieger E, Dekker MC, et al.: Muta-tions in the DJ-1 gene associated with autosomal recessive early-onset parkinsonism. Science, 299: 256–259, 2003.
7） Groen JL, Kawarai T, Toulina A, Rivoiro C, Sale-hi-Rad S, Sato C, et al.: Genetic association study of PINK1 coding polymorphisms in Parkinson’s
disease. Neurosci Lett, 372(3): 226–229, 2004. 8） Valente EM, Abou-Sleiman PM, Caputo V, Muqit
MM, Harvey K, Gispert S, et al.: Hereditary early-onset Parkinson’s disease caused by mutations in PINK1. Science, 304: 1158–1160, 2004.
9） Mitsumoto A, Nakagawa Y, Takeuchi A, Okawa K, Iwamatsu A, Takanezawa Y.: Oxidized forms of peroxiredoxins and DJ-1 on two-dimensional gels increased in response to sublethal levels of paraquat. Free Radic Res, 35(3): 301–310, 2001. 10） Mitsumoto A, Nakagawa Y.: DJ-1 is an indicator
for endogenous reactive oxygen species elicited by endotoxin. Free Radic Res, 35(6): 885–893, 2001.
11） Ooe H, Taira T, Iguchi-Ariga SM, Ariga H.: In-duction of reactive oxygen species by bisphenol A and abrogation of bisphenol A-induced cell in-jury by DJ-1. Toxicol Sci, 88(1): 114–126, 2005. 12） Mizuno Y, Sone N, Saitoh T.: Effects of
4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine and 1-methyl-4-phenylpyridinium ion on activities of the en-zymes in the electron transport system in mouse brain. J Neurochem, 48(6): 1787–1793, 1987. 13） Mizuno Y, Saitoh T, Sone N.: Inhibition of
mito-chondrial alpha-ketoglutarate dehydrogenase by 1-methyl-4-phenylpyridinium ion. Biochem Bio-phys Res Commun, 143(3): 971–976, 1987. 14） Taira T, Saito Y, Niki T, Iguchi-Ariga SM,
Taka-hashi K, Ariga H.: DJ-1 has a role in antioxidative stress to prevent cell death. EMBO Rep, 5(2): 213–218, 2004.
15） Kinumi T, Kimata J, Taira T, Ariga H, Niki E.: Cysteine-106 of DJ-1 is the most sensitive cysteine residue to hydrogen peroxide-mediated oxida-tion in vivo in human umbilical vein endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun, 317(3): 722–8, 2004
16） Takahashi-Niki K, Niki T, Taira T, Iguchi-Ariga SM, Ariga H.: Reduced anti-oxidative stress activ-ities of DJ-1 mutants found in Parkinson’s disease patients. Biochem Biophys Res Commun, 320(2): 389–397, 2004.
17） Bandopadhyay R, Kingsbury AE, Cookson MR, Reid AR, Evans IM, Hope AD, et al.: The expres-sion of DJ-1 (PARK7) in normal human CNS and idiopathic Parkinson’s disease. Brain, 127: 420–30, 2004.
18） Yanagida T, Takata K, Inden M, Kitamura Y, Taira T, Ariga H.: Distribution of DJ-1, Parkinson’s dis-ease-related protein PARK7, and its alteration in 6-hydroxydopamine-treated hemiparkinsonian rat brain. J Pharmacol Sci, 102(2): 243–247, 2006.
19） Inden M, Taira T, Kitamura Y, Yanagida T,
Tsuchiya D, Takata K,et al.: PARK7 DJ-1 protects against degeneration of nigral dopaminergic neurons in Parkinson’s disease rat model. Neuro-biol Dis, 24(1): 144–158, 2006.
20） Yanagisawa D, Kitamura Y, Inden M, Takata K, Taniguchi T, Morikawa S, et al.: DJ-1 protects against neurodegeneration caused by focal cere-bral ischemia and reperfusion in rats. J. Cereb. Blood. Flow. Metab, in press. 2007.
21） Mochizuki H, Nakamura N, Nishi K, Mizuno Y. et
al.: Apoptosis is induced by
1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP＋) in ventral mesen-cephalic-striatal co-culture in rat. Neurosci Lett, 170(1): 191–194, 1994.
22） Zhang L, Shimoji M, Thomas B, Moore DJ, Yu SW, Marupudi NI, et al.: Mitochondrial localiza-tion of the Parkinson’s disease related protein DJ-1: implications for pathogenesis. Hum Mol Genet, 14(14): 2063–2073, 2005.
23） Zhou W, Zhu M, Wilson MA, Petsko GA, Fink AL.: The oxidation state of DJ-1 regulates its chaperone activity toward alpha-synuclein. J Mol Biol, 356(4): 1036–1048, 2006.
24） 宮崎ほか投稿準備中
25） Ooe H, Iguchi-Ariga SM, Ariga H.: Establishment of specific antibodies that recognize C106-oxi-dized DJ-1. Neurosci Lett, 404(1–2): 166–169, 2006.
26） Kim RH, Smith PD, Aleyasin H, Hayley S, Mount MP, Pownall S, et al.: Hypersensitivity of DJ-1-defi-cient mice to 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahy-dropyrindine (MPTP) and oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA, 102(14): 5215–5220, 2005. 27） Chen L, Cagniard B, Mathews T, Jones S, Koh
HC, Ding Y, et al,; Age-dependent motor deficits and dopaminergic dysfunction in DJ-1 null mice. J Biol Chem, 280(22): 21418–21426, 2005. 28） Goldberg MS, Pisani A, Haburcak M, Vortherms
TA, Kitada T, Costa C, et al.: Nigrostriatal dopaminergic deficits and hypokinesia caused by inactivation of the familial Parkinsonism-linked gene DJ-1. Neuron, 45(4): 489–496, 2005 29） Borrelli E.: Without DJ-1, the D2 receptor
does-n’t play. Neuron, 45(4): 479–481, 2005.
30） Park J, Kim SY, Cha GH, Lee SB, Kim S, Chung J.: Drosophila DJ-1 mutants show oxidative stress-sensitive locomotive dysfunction. Gene, 361: 133–139, 2005.
31） Yang Y, Gehrke S, Haque ME, Imai Y, Kosek J, Yang L, et al.: Inactivation of Drosophila DJ-1 leads to impairments of oxidative stress response and phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling. Proc Natl Acad Sci USA, 102(38): 13670–13675, 2005.
32） Zhong N, Kim CY, Rizzu P, Geula C, Porter DR, Pothos EN, et al.: DJ-1 transcriptionally up-regu-lates the human tyrosine hydroxylase by inhibit-ing the sumoylation of pyrimidine tract-bindinhibit-ing protein-associated splicing factor. J Biol Chem, 281(30): 20940–20948, 2006.
33） Okada M, Matsumoto K, Niki T, Taira T, Iguchi-Ariga SM, Iguchi-Ariga H.: DJ-1, a target protein for an endocrine disrupter, participates in the fertiliza-tion in mice. Biol Pharm Bull, 25(7): 853–856, 2002.
34） Yoshida K, Sato Y, Yoshiike M, Nozawa S, Ariga H, Iwamoto T.: Immunocytochemical localiza-tion of DJ-1 in human male reproductive tissue. Mol Reprod Dev, 66(4): 391–397, 2003.
35） Le Naour F, Misek DE, Krause MC, Deneux L, Giordano TJ, Scholl S,et al.: Proteomics-based identification of RS/DJ-1 as a novel circulating tumor antigen in breast cancer. Clin Cancer Res, 7(11): 3328–3335, 2001
36） Melle C, Ernst G, Escher N, Hartmann D, Schim-mel B, Bleul A, et al.: Protein profiling of mi-crodissected pancreas carcinoma and
identifica-tion of HSP27 as a potential serum marker. Clin Chem, 53(4): 629–635, 2007.
37） Hill MD.: Diagnostic biomarkers for stroke: a stroke neurologist’s perspective. Clin Chem, 51(11): 2001–2002, 2005.
38） Allard L, Burkhard PR, Lescuyer P, Burgess JA, Walter N, Hochstrasser DF, et al.: PARK7 and nu-cleoside diphosphate kinase A as plasma markers for the early diagnosis of stroke. Clin Chem, 51(11): 2043–2051, 2005
39） Kim RH, Peters M, Jang Y, Shi W, Pintilie M, Fletcher GC, et al.: DJ-1, a novel regulator of the tumor suppressor PTEN. Cancer Cell, 7(3): 263–273, 2005.
40） Koide-Yoshida S, Niki T, Ueda M, Himeno S, Taira T, Ariga H, et al.: DJ-1 degrades transthyretin and an inactive form of DJ-1 is se-creted in familial amyloidotic polyneuropathy. Int J Mol Med, 19(6): 885–893, 2007.
41） Shinbo Y, Niki T, Taira T, Ooe H, Takahashi-Niki K, Maita C, et al.: SUMO-1 conjugation is essen-tial to DJ-1 to exert its full activities. Cell Death Differ, 13(1): 96–108, 2006.
