低 親 和 性IgGレ
セ プ ター(FcγRII)を
介 す る
ヒ ト好 塩 基 球 の活 性 化機 序 に関 す る研 究
-フ
ロ ー サ イ ト メ ー タ ー に よ る カ ル シ ウ ム 動 態 の 解
析-岡 山大学 医 学部 第二 内科 学教 室(指 導:木 村 郁郎 教 授)
洲
脇
俊
充
(平成6年3月28日
受 稿)
Key words: basophils, FcƒÁRII, fluo-3, Ca2+ mobilization
緒 言 ヒ ト好 塩 基 球 は,全 白血 球 の0.5∼1.0%を 占 め る に す ぎ な い が,木 村 ら が 臨 床 ア レ ル ギ ー と の 関 係 を報 告 し1), Ishizakaら がIgEの 標 的 細 胞 で あ る こ と を明 らか に して 以 来2),肥 満 細 胞 と と も に 気 管 支 喘 息 をは じめ と す る 多 くの ア レ ル ギ ー 疾 患 に 関 与 す る こ と が 知 られ て い る.さ ら に,好 塩 基 球 は,肥 満 細 胞 と共 に,そ の 膜 表 面 上 でIgEのFc部 分 に 対 す る 高 親 和 性 レ セ プ タ ー(FcεRI)を 介 し てIgEと 結 合 し,多 価 ア レ ル ゲ ン が 膜 表 面IgEに 結 合 し てFcεRIが cross-linkingさ れ る と,細 胞 内 顆 粒 に 貯 蔵 さ れ て い た ヒ ス タ ミン等 の 化 学 伝 達 物 質 が 放 出 され あ る い は ロ イ コ ト リエ ン 等 の 脂 質 代 謝 産 物 の 新 た な 合 成,放 出 が 誘 導 さ れ る.ま た,最 近,イ ン タ ー ロ イ キ ンー3(IL-3)で プ ラ イ ム す る こ と に よ り,好 塩 基 球 がIL-4を 産 生 す る3)こ と も報 告 さ れ て お り, FcεRIを 介 して 種 々 の 免 疫 ・ア レ ル ギ ー 反 応 に 深 く関 与 して い る こ とが 明 らか に さ れ つ つ あ る. 一 方,ア トピー 型 の 小 児 喘 息 を代 表 とす るI 型 ア レ ル ギ ー 反 応 で はIgE反 応 系 が 基 本 で あ る が,非 ア トピ ー 型,特 に,木 村 の 提 唱 す る 中 高 年 発 症 型 難 治 性 喘 息4)では, IgEの 関 与 は 少 な く, む し ろIII型, IV型 ア レ ル ギ ー 反 応 に よ る細 胞 反 応 型 ア レ ル ギ ー5)の 関 与 が 想 定 され て い る.ま た, 近 年,木 村6), Itoら7)は 遅 発 型 気 道 反 応(LAR) がIgG1抗 体 に よ り惹 起 さ れ る こ と を 報 告 し て お り,好 塩 基 球 系 の 細 胞 反 応 は ア ト ピー 型 喘 息 症 例 の み で な く,非 ア ト ピー 型,特 に,中 高 年 発 症 型 難 治 性 喘 息 で も認 め られ,こ れ ら の 喘 息 病 態 で はIgEよ り も む し ろIgGの 関 与 が 想 定 さ れ る.ま た,好 塩 基 球 膜 表 面 に は, IgGのFc 部 分 に 対 す る 低 親 和 性 レ セ プ タ ー(FcγRII= CD32w)も 存 在 す る こ とが 明 らか と な っ て い る が8-11),そ の 免 疫 ・ア レル ギ ー 反 応 に お け る役 割 に つ い て は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い. 以 上 よ り,好 塩 基 球 に お け るFcγRIIの 重 要 性 が 示 唆 され るが,こ れ ま で の と こ ろ 詳 細 な 検 討 は 少 な い.か か る観 点 か ら,教 室 のTanimoto ら12)は,フ ロー サ イ トメ ー ター を用 い,ネ ガ テ ィ ブ セ レ ク シ ョ ン法 に て 好 塩 基 球 を 精 製 す る方 法 を 確 立 し, Takahashiら8)は,こ の 方 法 を 応 用 して 好 塩 基 球 のFCγRIIを は じめ とす る表 面 マ ー カー に つ い て 検 討 し た.さ ら に今 回 著 者 は, FcγRIIのcross-linkingに よ る好 塩 基 球 の 活 性 化 機 構 を解 明 す る 目的 で, phycoerythrin(PE) 標 識 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 との 二 重 蛍 光 染 色 に よ り末 梢 血 か ら 比 重 遠 沈 法 に よ っ て 部 分 精 製 した 好 塩 基 球 を用 い て, Ca2+指 示 薬 のfluo-3に よ る細 胞 内Ca2+濃 度 の 測 定 に 応 用 し た. 対 象 と 方 法 1.対 象 健 常 成 人6例 を 対 象 と し た.年 齢 は30歳 ∼38 歳(平 均32.0歳)で,性 別 は 男5例,女1例 で あ っ た. 847
2.方 法 1)好 塩 基 球 の 部 分 精 製(比 重 遠 沈 法) 末 梢 血 好 塩 基 球 の 部 分 精 製 は, Leonardら の 方 法13)に従 い 比 重 遠 沈 法 に よ り行 った.す な わ ち, EDTA加 末 梢 血 を 等 張Percoll(Pharmacia 社)の 不 連 続 勾 配(d=l.079及 びd=1.070) の 上 に 重 層 し,室 温, 700×g, 15分 間 遠 沈 し, 1.070と1.079の 間 に 形 成 さ れ る単 核 球 層 を採 取
し, basophil-enriched mononuclear cells (MNCs)を 得, Cat+, Mg2+を 含 ま な いHanks' balanced salt solution(HBSS)(S量gma社)+
10mM EDTA(Sigma社)+0.1% BSA(Sigma 社)(以 下HBSS-EDTA-BSA)に て 洗 浄 し た. 赤 血 球 が 混 在 した 場 合 に は 蒸 留 水 に て 溶 血 させ (hypotonic lysis),同 量 の1.8%食 塩 水 で 等 張 と し, HBSS-EDTA-BSAに て 洗 浄 した.こ の 時 点 に お け る 好 塩 基 球 の 純 度 は7-12%で,混 在 す る細 胞 は 殆 どが リ ン パ 球 で あ り他 の 顆 粒 球 の 混 在 は 認 め な か っ た.な お,好 塩 基 球 の 染 色 に は 好 酸 球 ・好 塩 基 球 同 時 算 定 液1)を 用 い た. 2)好 塩 基 球 以 外 の 細 胞 のPE蛍 光 染 色 と fluo-3の 封 入 1)で 作 成 したbasophil-enriched MNCsの う ち,好 塩 基 球 以 外 の 細 胞 を染 色 す る 目的 で, 各 細 胞 群 に 比 較 的 特 異 的 な下 記 のPE標 識 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体(リ ュ ウ シ リー ズ, Beckton-Dickinson社)を 加 え,ま ず4℃,暗 所 で30分 反 応 させ た. (1) CD2(Leu-5B): T細 胞 (2) CD14(Leu-M3):単 球 (3) CD16(Leu-11B): NK細 胞,好 中 球 (4) CD19(Leu-12): B細 胞 次 に, Ca2+指 示 薬 と してfluo-3(Dojindo社) を最 終 濃 度 が4μMと な る よ うに 加 え,室 温,暗 所 で さ ら に40分 反 応 させ, Ca2+, Mg2+を 含 む HBSSに て2回 洗 浄 後, 1×106cells/mlの 細 胞 浮 遊 液 と した.こ の 段 階 に お け る ト リパ ン ブ ル ー 染 色 に よ る生 細 胞 率 は90%以 上 で あ っ た. 3)細 胞 内Ca2+濃 度 の 測 定 細 胞 内Ca2+濃 度 の 測 定 は, FACStarフ ロー サ イ トメ ー タ ー(Beckton-Dickinson社)を 用 い,二 重 蛍 光 染 色 を行 っ た ,蛍 光 色 素 の 励 起 は ア ル ゴ ン イ オ ン レー ザ ー を 使 用 し,波 長488nm, 400mWで 測 定 し た. 515nmの ロ ン グパ ス フ イ ル タ ー で ア ル ゴ ン イ オ ン レー ザ ー 光 を カ ッ トし, 560nmの ダ イ ク ロ イ ッ ク ブ イ ル ター を使 用 して そ れ ぞ れ の 蛍 光 を分 離 後, 525nmバ ン ドパ ス フ イ ル ター でfluo-3の 蛍 光 を 測 定 した. FSC, SSC,
FL-1はlinearscale, FL-2はlog scaleで 表
示 し, FSC閾 値 を調 節 して デ ブ リス を カ ッ ト し た.好 塩 基基球 分 画 は, Fig. 1の 如 くFSCとFL -2画 面 上 でPE非 染 色 細 胞 と して 同 定 可 能 で あ っ た.従 っ て,か か るFig. 1に 示 した 好 塩 基 球 分 画 に つ い て, FSC, FL-1画 面 上 で 各 刺 激 に 対 す る細 胞 内Ca2+濃 度 を経 時 的 に 解 析 した. 細 胞 内Ca2+濃 度 の 測 定 は,カ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ アA23187(10μM, Sigma社)添 加 時 の 平 均 蛍 光 強 度 を最 大 値Fmaxと し14), 2mM MnCl2を カ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ ア処 理 した 細 胞 に 添 加 し た 際 の 平 均 蛍 光 強 度(FMnCl2)よ り,最 小 値Fminを 算 出15)し て,各 実 験 ご と に 較 正 を行 い, fluo-3の 平 均 蛍 光 強 度 か ら,次 に 示 す 計 算 式 に て 算 出 し た16). [Ca2+]i(nM)=Kd×[F-Fmin]/[Fmax-F] Kd: Fluo-3の 解 離 定 数(400nM) F:検 体 のfluo-3平 均 蛍 光 強 度 Fmax:カ ル シ ウ ム イ オ ノフ ォ アA23187(10 μM)刺 激 後 の 蛍 光 強 度 Fm;n: 1.25×FMnCl2-0.25×Fmax
Fig. 1 Basophil-enrichedmononuclear cellsの サ イ ト グ ラ ム
4) Heat aggregated IgG(agg. IgG)の 作 成
多価IgGと して のagg. IgGは, chromatogra phically purified human IgG(Zymed社)に 63℃, 60分 間 熱 処 理 を 加 え た 後, 10000×g, 10 分 間 遠 沈 し, large aggregatesを 除去 して 作 成 し た. 5)ヒ ス タ ミ ン遊 離 好 塩 基 球 活 性 化 の 一 指 標 と し て,ヒ ス タ ミ ン 遊 離 値 を 測 定 し た.す な わ ち, basophil enriched MNCsを 好 塩 基 球 が1×103cells/mlと な る よ う に 調 節 してCa2+, Mg2+を 含 むHBSSに 浮 遊 させ, IgGレ セ プ ター を介 す る刺 激, anti-lgE(ε) (Kirkegaard & Perry Laboratories社),及 び カ ル シ ウ ム イ オ ノ フ ォ アA23187(1μg/ml) を加 え て37℃, 45分 間 反 応 させ た の ち, 4℃, 400×gで10分 間 遠 沈 し,上 清 中 の ヒ ス タ ミ ン を RIA法 で 測 定 し た.刺 激 物 質 の 代 わ りにHBSS を加 え 同 様 に 反 応 させ て 得 ら れ た もの を 自 然 遊 離 量 と し て 求 め,全 ヒ ス タ ミ ン量 は 細 胞 浮 遊 液 を100℃, 10分 間 熱 処 理 した もの を 遠 沈 後,上 清 を 測 定 に 供 した. RIA法 に よ る 測 定 は す べ て duplicateで 行 い,ヒ ス タ ミン遊 離 率 は,下 記 の 式 に よ り算 出 して 求 め た.な お,自 然 遊 離 量 は 全 ヒ ス タ ミ ン 量 の10%以 下 で あ っ た. ヒ ス タ ミン 遊 離 率(×100%) =
刺 激 に よ る遊 離 量-自 然遊 離 量/
全 ヒ ス タ ミ ン 量-自 然 遊 離 量 6) IL-3の 増 強 効 果 好 塩 基 球 に 対 す るIL-3の 増 強 効 果 を み る た め, basophil-enriched MNCsにrecombinant human IL-3(rhlL-3, Genzyme社)を100U/mlの 濃 度 で加 え て30分 か ら1時 間 反 応 させ た 後, Ca2+動 態 及 び ヒス タ ミン遊 離 に つ い て検 討 した. 結 果 1.好 塩 基 球 分 画 の 構 成 細 胞 ま ず, PE非 染 色 細 胞 と し て 示 した 細 胞 分 画 が 果 た して 好 塩 基 球 と して 妥 当 か ど う か に つ い て 検 討 した. 1) Fig. 1に 示 すPE非 染 色 細 胞 分 画 を FACStarに て ソ ー テ ィ ン グ し, May-Giemsa染 色 を 行 っ た.好 塩 基 球 の 純 度 は78-85%,ト リ パ ン ブ ル ー 染 色 に よ る 生 細 胞 率 は90%以 上 で, 混 在 す る細 胞 は 殆 どが リン パ 球 で あ り,他 の 顆 粒 球 の 混 在 は 認 め られ なか っ た. 2) Basophil enriched MNCsに 対 し て, PE 染 色 と同 時 にFITC標 識anti-IgE(ε)抗 体
(Kirkegaard & Perry Laboratories社)で 染 色 す る と, Fig. 2の サ イ トグ ラ ム に 示 す 如 く,
PE非 染 色 細 胞 群 は 表 面 に 多数 のIgEを 結 合 し
て お り,好 塩 基 球 と し て 妥 当 で あ る こ とが 判 明 し た.
2. 好 塩 基 球 細 胞 内Ca2+動 態 の 解 析
Basophil-enriched MNCsを,ま ずagg. IgG
l00μg/mlで 刺 激 し た際 の 細 胞 内Ca2+動 態 を 検 討 し た.そ の 結 果, Fig. 3の サ イ トグ ラ ム に 示 す 如 く刺 激 前 の 状 態 に 比 し,刺 激 後 約50秒 を ピ ー ク にPE非 染 色 細 胞 す な わ ち好 塩 基 球 のfluo -3蛍 光 強 度 が 右 に 偏 位 して お り,好 塩 基 球 内 Ca2+濃 度 が 増 加 し て い る こ と が 判 明 した. Fig. 4は 同 じデ ー タ を ゲ ー トを か け たPE非 染 色 細 胞 集 団 に つ い て ヒ ス トグ ラ ム 表 示 し た も の で あ る が,刺 激 前 の 状 態 に 比 しagg. IgG刺 激 に よ り明 らか にfluo-3蛍 光 強 度 が 増 加 して い た. Fig. 5は, fluo-3蛍 光 強 度 か ら 算 出 し た 細 胞 内Ca2+ 濃 度 を 経 時 的 に グ ラ フ化 した もの で あ るが,刺 激30秒 後 頃 か ら細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 が 認 め ら れ,約50秒 後 に ピ ー クに 達 した 後,約100秒 後
Fig. 2 PE標 識-anti-CD2, CD14, CDl6, CD19と FITC標 識-anti-IgEに よ る 二 重 蛍 光 染 色
Fig. 3 Agg. IgG(100μg/ml)刺 激 後 のfluo-3蛍 光 強 度 の サ イ ト グ ラ ム
Fig. 4 Agg. IgG(l00μg/ml)刺 激 後 のfluo-3蛍 光 強 度 の ヒ ス トグ ラ ム
Fig. 5 Agg. IgG(100μg/ml)刺 激 に よ る 細 胞 内 Ca2+濃 度 の 経 時 的 変 化
に は 刺 激 前 の 状 態 に戻 っ た. agg. IgGの250㎎/ ml, 500μg/mlの 刺 激 で は,濃 度 の 上 昇 と共 にCa2+ 濃 度 の ピ ー ク は や や 増 加 す る傾 向 が 認 め られ た
方 法 でanti-IgE(ε)抗 体0.1μg/ml刺 激 後 の 細
胞 内Ca2+濃 度 変 化 に つ い て 検 討 した と こ ろ,
Fig. 6に 示 す 如 く従 来 の 報 告17)と 同様,第1相
と第2相 か ら な る2相 性 の 反 応 を示 し た.
次 に, agg. IgGに よ る 刺 激 がFcγRIIを 介 し
た も の か ど う か を 検 討 し た.ま ず, basophil
-enriched MNCsをFcγRIIの モ ノ ク ロ ー ナ ル
抗 体 で あ るIV. 3(Medarex社)と 反 応 させ た
後, 2次 抗 体 と し てgoat anti-mouse IgG
(GAM, TAGO社)を 加 え てFcγRIIをcross
linkingさ せ た 後 の 細 胞 内Ca2+動 態 を測 定 した.
そ の 結 果, Fig. 7に 示 す 如 くagg. IgGと 同様 に 約30秒 後 か ら上 昇 を始 め 約60秒 後 に ピ ー ク に 達 した.ピ ー ク値 はagg. IgGの 場 合 と比 べ て や や 高 く,そ の 後 細 胞 内Ca2+濃 度 は 緩 徐 に 低 下 し た.な お, IV. 3の 前 処 理 無 しでGAMを 加 え た 場 合 は,細 胞 内Ca2+濃 度 の 変 化 は 認 め られ な か っ た. さ らに,あ らか じめIV. 3を 結 合 させ たbaso phil-enriched MNCsをagg. IgG 100μg/mlで 刺 激 し た が, Fig. 8に 示 す 如 く細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 は認 め られ なか った.す な わ ち, agg. IgG 刺 激 はFcγRIIを 介 し て 細 胞 内Ca2+濃 度 を上 昇 させ る こ と が 明 らか と な っ た. ま たIL-3に よ り,細 胞 内Ca2+動 態 が 修 飾 さ れ る か ど う か を検 討 す る 目 的 で,あ らか じめ rhlL-3100U/mlで, 30分 あ るい は1時 間 前 処 理 し たbasophil-enriched MNCsを 用 い てagg.
IgG刺 激, IV. 3+GAM刺 激 を 行 っ た が,細 胞
内Ca2+濃 度 変 化 に は 差 は 認 め ら れ な か っ た. ま た, IL-3単 独 刺 激 で も細 胞 内Ca2+濃 度 の 変 化 は 認 め ら れ な か っ た. 3.ヒ ス タ ミン遊 離 Basophil-enriched MNCsか ら の ヒ ス タ ミン 遊 離 は, Table 1に 示 す 如 くanti-IgE,カ ル シ Fig. 6 Anti-lgE刺 激(0.1μg/ml)に よ る 細 胞 内 Ca2+濃 度 の 変 化
Fig. 7 抗FcγRII抗 体IV. 3前 処 理 後, goat anti-mouse IgG(GAM)でcross-linkingさ せ た 場 合 の 細 胞 内Ca2+濃 度 の 変 化
Fig. 8 抗FcγRII抗 体IV, 3前 処 理 後 のagg . IgG刺 激 に よ る 細 胞 内Caz+濃 度 変 化
Table 1 FcγRIIのcross-linkingに よ る ヒ ス タ ミ ン 遊 離 率(%HR)
ウ ム イ オ ノフ ォ ア刺 激 で は 高 率 で あ っ た が, agg. IgG(100, 250, 500μg/ml)あ るい はIV. 3+GAM
に よ る2種 の 刺 激 で は, IL-3の30分 間 の 前 処 理 の 有 無 に 拘 ら ず,有 意 な ヒ ス タ ミン 遊 離 は 起 こ ら な か っ た. 考 察 好 塩 基 球 は,そ の 膜 表 面 上 に 高 親 和 性IgEレ セ プ ター で あ るFcεRIと 共 に,低 親 和 性IgG レセプ ター のFcγRIIを 有 す るこ とがTakahashi ら の 研 究 に よ り明 ら か とな って い る8-1l)が,そ の 免 疫 ・ア レ ル ギ ー に お け る役 割 に つ い て は 未 だ 十 分 に は 解 明 さ れ て い な い.そ こ で 今 回,ヒ ト 末 梢 血 よ り比 重 遠 沈 法 に て 得 ら れ たbasophil enriched MNCsを 材 料 に,フ ロー サ イ トメー タ ー を 用 い て好 塩 基 球 の 細 胞 内Ca2+濃 度 を測 定 す る方 法 を考 案 し,そ の 上 昇 を指 標 と してFcεR Iの み な らず, FcγRIIを 介 して も好 塩 基 球 が 活 性 化 さ れ る か 否 か を 検 討 し た.そ の 結 果,ヒ ト 好 塩 基 球 はFcεRIだ け で な く, FcγRIIのcross-linkingに よ っ て も活 性 化 さ れ,細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 を 引 き起 こ す こ とが 示 され た.し か し, FcγRII刺 激 で は ヒス タ ミンの 遊 離 は 認 め られ ず, そ れ 以 外 の メ デ イ エ ー ター が 関 与 して い る こ と が 示 唆 さ れ た. Ca2+は 細 胞 外 か らの 情 報 を 細 胞 内 に 伝 達 す る セ カ ン ドメ ッ セ ン ジ ャ ー で あ り,細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 は 多様 な細 胞 内 情 報 伝 達 過 程 の ご く早 期 に 認 め られ る普 遍 的 な 現 象 で,細 胞 活 性 化 の 指 標 と さ れ て い る.好 塩 基 球 に お い て も, IgEレ セ プ タ ー のcross-linkingに よ り,ま ず 細 胞 内 Ca2+濃 度 の 上 昇 が 起 こ る18).引 き 続 い て セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ,メ チ ル トラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ,ア デ ニ レ ー トシ ク ラー ゼ,ボ ス ホ リパ ー ゼC(PLC) な どの 膜 表 面 酵 素 の 活 性 化 が 誘 導 され,特 にPLC に よ りホス フ ァ チ ジル イ ノ シ トー ルが 細 胞 内Ca2+ 反 応 の 基 礎 とな る19, 20)イノ シ トー ル1, 4, 5-三 リ ン 酸 と1, 2-ジ ア シ ル グ リセ ロ ー ル に加 水 分 解 さ れ る. こ れ ま で ヒ ト好 塩 基 球 の 細 胞 内Ca2+濃 度 の 測 定 に は,デ ジ タ ル ビ デ オ 顕 微 鏡 に て 解 析 す る 顕 微 蛍 光 法18)が主 に 用 い ら れ て き た.し か し,こ の 方 法 は,ま ず 好 塩 基 球 を80%以 上 の 高 純 度 に 精 製 す る 必 要 が あ っ た.今 回 確 立 し た フ ロー サ イ トメー ター に よ る 方 法 で は,好 塩 基 球 を 高 純 度 に 精 製 す る必 要 が な く,末 梢 血 か ら比 重 遠 沈 法 を 用 い て10%程 度 に 精 製 す る だ け で,好 塩 基 球 の 細 胞 内Ca2+濃 度 を測 定 す る こ とが 可 能 と な っ た.ま た,好 塩 基 球 をIgE陽 性 細 胞 と して 同 定 す る方 法21)と異 な り,好 塩 基 球 を非 標 識 細 胞 と して 同 定 す る た め,測 定 前 の 段 階 で 好 塩 基 球 を活 性 化 した り脱 感 作 す る こ と な く,目 的 の 刺 激 で 活 性 化 さ れ る か ど う か を検 討 で き る 利 点 が あ る.一 方,多 数 の 細 胞 に お け るCa2+濃 度 の 平 均 を 測 定 す る た め,最 初 のCa2+濃 度 上 昇 は 同 期 して い る の で 大 き な ピー ク と して 認 め ら れ る が,そ れ 以 後 の 反 復 す る ピ ー クは 必 ず し も同 期 し て い な い の で,単 一 細 胞 レベ ル で 観 察 さ れ る 細 胞 内Ca2+濃 度 の オ シ レー シ ョ ン22)の解 析 が で き な い とい う欠 点 が あ る.ま た1つ の 検 体 に つ い て 一 度 解 析 を 開 始 す る と,メ デ イ エ ー タ ー の 測 定 な どの た め に 同 じ検 体 か ら同 時 に は 上 清 を採 取 で き な い こ と,あ る い は 混 在 す る細 胞 (主 に,小 リ ンパ 球,単 球)の 影 響 が 少 な か ら ず あ る こ と な ど が 問題 点 と考 え ら れ る.し か し, 比 較 的 少 量 の 検 体 を 用 い て 簡 便 に 種 々 の 刺 激 に 対 す る好 塩 基 球 の 細 胞 内Ca2+濃 度 変 化 の パ タ ー ン を解 析 で き る点 で ,有 用 と考 え られ る. ま た, Ca2+指 示 薬 と し て 用 い たfluo-3は, 第3世 代 蛍 光 色 素 と して 開 発 さ れ, Ca2+結 合 に よ る 蛍 光 強 度 の 増 加 が, quin-2(第l世 代), indo -1, fura-2(第2世 代)に 比 べ て 強 く,ま た励 起 波 長480∼500nM,蛍 光 波 長530nMで ア ル ゴ ン レー ザ ー フ ロ ー サ イ ト メー ター を用 い て 細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 を 決 定 で き る と い う利 点 が あ る23).カ ル ボ キ シ ル 基 を脂 溶 性 の ア セ トキ シ メ チ ル エ ス テ ル体 に し たfluo-3AMは,疎 水 性 で 細 胞 膜 を通 過 し て 細 胞 質 へ 入 っ た 後,非 特 異 的 な エ ス テ ル 水 解 酵 素 に よ っ て 加 水 分 解 され るた め,容 易 に 細 胞 内 へ 封 入 す る こ と が で き る.以 上 よ り, fluo-3とPE標 識 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た 二 重 蛍 光 染 色 に よ り,ア ル ゴ ン レ ー ザ ー フ ロー サ イ トメ ー ター を 用 い て細 胞 内Ca2+濃 度 を 測 定 す る こ とが 可 能 と な っ た. こ の 方 法 を用 い て, anti-lgE(ε)に よ る細 胞 内Ca2+動 態 を検 討 し た と こ ろ, Fig. 6に 示 す
如 く,こ れ まで の 報 告 同 様24,25)第1相 と第2相 か らな る2相 性 のパ ター ン を示 し た.一 方, agg. IgG 刺 激 で は, C5a24)や 血 小 板 活 性 化 因 子(PAF)26) 類 似 の 一 相 性 パ タ ー ン を示 し た.ま た, IV. 3+
GAMに よ る 刺 激 で は, agg. IgG刺 激 と比 べ て
ピー ク に 達 し た 後 のCa2+濃 度 の低 下 は 緩 徐 で,
10分 以 上 の 経 過 で 刺 激 前 の レベ ル に 戻 っ た.こ れ は, FcγRIIが 低 親 和 性 の レ セ プ ター で あ り,
agg. IgG刺 激 が 免 疫 複 合 体 類 似 で,よ り生 理 的
にFcγRIIをcross-linkingさ せ た の に 対 し,
IV. 3+GAMに よ る刺 激 で は, FcγRIIを 非 生
理 的 にcross-linkingさ せ た 結 果 で あ る と考 え ら れ る.し か し,何 れ の 刺 激 もPAFと 同 様26)に ヒ ス タ ミン遊 離 は 認 め られ な か っ た.こ の こ と は,細 胞 内Ca2+濃 度 の 一 過 性 上 昇 だ け で は 脱 顆 粒 を起 こ す に は 十 分 で な い17)ことを示 唆 してお り,ヒ ス タ ミン と共 に ロ イ コ ト リエ ン を も遊 離 す るFcεRIのcross-linkingと,ヒ ス タ ミン 遊 離 の 見 ら れ な いFcγRIlのcross-1inkingと で はCa2+を 含 め た そ の 後 の 細 胞 内 情 報 伝 達 過 程 に相 違 が あ る と考 え られ る.
ヒ トに お い て, IgG reaginic antibody27)が 存 在 す るか ど うか は 異論 の あ る とこ ろで あ り, Ishiza-kaら は, agg. IgGと125Iで ラ ベ ル したanti-IgG
を一 緒 に 反 応 させ る こ とに よ り,ヒ ト好 塩 基 球 表 面 にIgGが 結 合 し て い る こ とを最 初 に 証 明 し た28).ま た, Takahashiら は フ ロー サ イ トメ ー タ ー と モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を 用 い て,好 塩 基 球 表 面 にIgG,とIgG4が 結 合 し て い る こ と を 報 告 して い る8). IgG4抗 体 に 関 し て は,ヒ ス タ ミ ン が 遊 離 され る とす る報 告29-32)と,こ れ を否 定 す る報 告33-35),あ る い は 減 感 作 療 法 に お い て 遮 断 抗 体 と し て 働 く とい う報 告36,37)もあ り,そ の役 割 に つ い て は 未 だ 一 定 の 見 解 が 得 ら れ て い な い の が 現 状 で あ る.最 近, Lichtensteinら は,ア トピー 患 者 に お け るanti-IgGモ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 に よ る ヒス タ ミン 遊 離 は,好 塩 基 球 上 のFcγR IIに 結 合 したIgG抗 体 に よ る もの では な く, FcεR
Iに 結 合 し たIgEに 対 す るIgG自 己 抗 体 を介
し て 間 接 的 にFcεRIをcross-linkingし た結 果 で あ る と して お り39),好 塩 基 球 のFcγRIIの cross-linkingに よ る ヒ ス タ ミン遊 離 が 認 め られ な か っ た 今 回 の 結 果 と一 致 す る.ま た, IgGlに 関 して,木 村6), Itoら7)はLARがIgG1抗 体 に よ り惹 起 され る と報 告 して い るが,好 塩 基 球 のIgGレ セ プ ター の状 態 を免 疫 走 査 電 顕 法 に よ り検 討 す る と,喘 息 患 者 の 免 疫 グ ロ ブ リ ン 密 度 は 重 症 例 やLARを 呈 す る症 例 に 高 密 度 で あ り40),血 清 中41)や気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中42)のIgG サ ブ ク ラ ス で検 討 す る と抗 原 特 異 的IgG1が 優 位 な症 例 で はLARを 呈 しや す い こ と が 知 られ て い る.以 上 よ り,好 塩 基 球 のFcγRIIを 介 す る活 性 化 に は, IgG,抗 体 が よ り強 く関 与 し て い る と考 え られ る. IL-3は,特 異 的 レ セ プ タ ー を 介 し て43,44,)好塩 基 球 の 増 殖,分 化,遊 走 因 子 と して 機 能 し,さ らに メデ ィ エ ー ター 遊 離 に も関 与 して い る45-47). ま た ヒ ト好 塩 基 球 は, C5a単 独 刺 激 で は ヒ ス タ ミ ン は 遊 離 す るが,ロ イ コ ト リエ ンC4(LTC4) は 産 生 し な い もの の, IL-3で10分 間 前 処 理 す る こ と に よ り, C5aで もLTC,を 産 生 す る よ うに な る と報 告 さ れ て い る45).か か る機 序 を 細 胞 内 Ca2+動 態 の 面 か ら解 析 す る と, C5a単 独 で は2 分 以 内 の 一 過 性 のCa2+濃 度 の 上 昇 しか 来 さ な い が, IL-3で18時 間 前 処 理 す る とfMLPに 類 似 の 持 続 的 なCa2+濃 度 の 上 昇 を示 す よ う に な り,そ れ がLTC、 産 生 に 必 須 の 要 因 と考 え ら れ て い る25).し か し, IL-3の8分 間 の 前 処 理 で は C5aに よ るLTC4産 生 を 引 き起 こす が, Ca2+濃 度 変 化 に は影 響 しな い とさ れ て お り48),今回 の 実 験 で も好 塩 基 球 に お い て はIL-3そ れ 自 身 がCa2+ 濃 度 を変 化 させ ず,か っFcγRIIのcross-linking に よ るCa2+濃 度 変 化 に は,少 な く と も1時 間 以 内 のIL-3前 処 理 で は 影 響 が み ら れ な か っ た. この こ とは, IL-3の 短 時 間 の プ ライム 効 果 はCa2+ 濃 度 変 化 の 相 違 だ け で は 説 明 で き な い こ と を示 し て お り,ヒ ス タ ミ ン遊 離 の 初 期 相 に お い て は, よ り局 所 的 なCa2+反 応 と かCa2+濃 度 の 上 昇 と平 行 して 起 こ る他 の 活 性 化 機 序 が よ り重 要 で あ る と考 え られ る. ア レ ル ギ ー の 遅 発 型 反 応(LPR)局 所 に は, 好 酸 球 と共 に 好 塩 基 球 が 存 在 す る こ とが,皮 膚49,50),鼻51-53),下気 道54,55)にお い て 認 め られ て い る.こ の こ とは,他 の 炎 症 細 胞 か ら好 塩 基 球 遊 走 因 子 が 出 て い る こ と を 予 想 させ る.実 際, 抗 原 に よ る遅 発 型 皮 膚 反 応 の 皮 膚 生 検 組 織 に は
IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSFのmRNAが56), 喘 息 患 者 の 気 管 支 粘 膜 に はIL-5のmRNA57)が 発 現 して い る こ とがin situ hybridizationに よ っ て 認 め られ て い る.ま た, MasseyはGM-CSF 活 性 が ア レ ル ギ ー 患 者 の 皮 膚LPR局 所 に 存 在 す る こ と を バ イ オ ア ッ セ イ とELISAで 認 め て い る58).従 っ て, LPR局 所 で は,抗 原 に 反 応 し てT細 胞 か ら産 生,放 出 さ れ るIL-3, IL-5, GM-CSFが 好 塩 基 球 に 対 す る遊 走 活 性 を持 っ て い る59,60)ことか ら,組 織 へ の 好 塩 基 球 の 集 積 に 重 要 な 役 割 を 果 た して い る と考 え ら れ る61).一 方, IL-5は 好 塩 基球 に 対 し て は,ヒ ス タ ミン よ り も LTC4の 産 生 を増 強 す る作 用 が認 め られ てお り62), LPR局 所 で の 好 塩 基基球 か らのLTC、 産 生 の 可 能 性 も考 え ら れ る.ま た, FcγRIIは,ト リプ シ ン の 作 用 に よ り高 親 和 性 のFcγRIIと して 働 き 得 る ス タ ン バ イ レ セ プ タ ー で あ り63,64),ヒトの 単 球 に お い て は,プ ロ テ ア ー ゼ 処 理 に よ り高 親 和 性 と な っ たFcγRIIのcross-linkingに よ っ て 腫 瘍 壊 死 因 子(TNF)が 産 生 され る65).か か る 事 実 か ら,プ ロ テ ア ー ゼ の 豊 富 な 炎 症 の 場 に 遊 走 して き た好 塩 基 球 に お い て も, FcγRIIを 介 す る刺 激 が よ り増 強 さ れ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る. 肥 満 細 胞 は, anti-IgE刺 激 に よ り脱 顆 粒 を 起 こす の み な らず,各 種 サ イ トカ イ ン の 遊 離 を 誘 導 す る66,67)が, Paulら は,マ ウ ス の 脾 臓,骨 髄 のnon-B, non-T細 胞 を用 い た 一 連 の 実 験 か ら, non-B, non-T細 胞 がFcεRI,
FcγRIIのcross-linkingに よ りIL-4を 産 生 す る こ と を 報 告 して
い る68).更 に,こ のIL-4産 生non-B, non-T
細 胞 はFcεRI陽 性 で,形 態 学 的 に ほ とん ど が 好 塩 基 球 ま た は 好 塩 基 性 骨 髄 球 で あ り,肥 満 細 胞 よ り もむ し ろ好 塩 基球 が 主 なIL-4産 生 細 胞 で あ る と し て い る69).一 方, Piccinniら は,ヒ ト骨 髄 のnon-B, non-T細 胞 を用 い て 同 様 の 実 験 を行 い, IL-3の 存 在 下 でFcεR, FcγRの
cross-linkingに よ るIL-4, IL-5のmRNAの 発 現 を 報 告 して お り70),実 際, IL-3で 前 処 理 す る こ と に よ り,正 常 末 梢 血 好 塩 基 球 がIL-4を 産 生 す る事 も報 告 さ れ て い る3). 以 上 の 如 く,T細 胞 か ら遊 離 さ れ たIL-3, IL -5, GM-CSFに よ り, LPR局 所 に 遊 走 し て き た 好 塩 基 球 は,プ ロ テ ア ー ゼ, IL-3, IL-5な ど に よ っ て よ り活 性 化 さ れ, IgG,免 疫 複 合 体 で FcγRIIが 刺 激 さ れ る こ と に よ り,ヒ ス タ ミン 以 外 の メ デ イ エ ー タ ー,す な わ ちLTC4或 い はIL -4, IL-5な どの サ イ トカ イ ン を 産 生 す る可 能 性 が 示 唆 さ れ,オ ー トク ラ イ ン あ る い は パ ラ ク ラ イ ン の 機 序 に よ る ア レ ル ギ ー 反 応 の 増 幅,あ る い は 他 の 細 胞 群 との 複 雑 な ネ ー トワ ー クの 形 成 に 関 与 して い る こ と が 推 察 され た. 結 論 ヒ ト好 塩 基 球 の 活 性 化 を,細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 を指 標 と し て フ ロ ー サ イ トメ ー ター を用 い て 検 出 す る 方 法 を確 立 し, IgEの み な らずIgG に よ っ て も好 塩 基 球 が 活 性 化 さ れ る か 否 か に つ い て 検 討 し た . 1.ヒ ト好 塩 基 球 に お い て, FcγRIIのcross-linkingに よ り細 胞 内Ca2+濃 度 の 上 昇 が 認 め ら れ た が, IL-3で30分 か ら1時 間 前 処 理 した 細 胞 との 間 に 明 らか な 相 違 は 認 め ら れ な か っ た. 2. FcγRIIのcross-linkingに よ る ヒ ス タ ミ ン 遊 離 は 認 め ら れ な か っ た. 以 上,ヒ ト好 塩 基 球 で は, FcγRIIのcross-linkingに よ りヒ ス タ ミン遊 離 は 認 め られ な か っ た が,セ カ ン ド メ ッ セ ン ジ ャ ー と して の 細 胞 内 Ca2+濃 度 の 上 昇 が 認 め られ た こ と か ら, IgG系 の 刺 激 で は ヒ ス タ ミ ン以 外 の メ デ イ エ ー タ ー が 関 与 して い る こ とが 想 定 さ れ た. 稿 を終 え るに あ た り,終 始 御 指 導 御校 閲 を賜 った 恩 師 木 村 郁 郎教 授 に深 甚 の 謝 意 を表 す る と共 に,直 接 御 指 導 戴 い た 高橋 清 講 師 に 深 謝 致 し ます. 本 論 文 の 要 旨は 第43回 日本 ア レル ギー 学会 総 会 に て発 表 し た. 文 献 1) 木 村郁 郎,守 谷欣 明,西 崎 良知,谷 崎勝 朗:気 管 支 喘 息 に お け る好 塩 基 球 の臨 床 的 意義 .ア レル ギー(1968)
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Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. I. Kimura)
A new method for flow cytometric analysis of calcium mobilization in human peripheral blood basophils without prior purification was developed. The method is based on dual color analysis of centrifugation-enriched mononuclear cell populations using fluo-3 and phycoeryth rin (PE)-conjugated CD2, CD14, CD16, CD19 monoclonal antibodies (mAb) to stain contaminated cells. This technique allows the detection of fluo-3 fluorescence as a measure of an increase in the cytoplasmic free calcium concentration ( [Ca2+] 1) while simultaneously discriminating PE-mAb-unlabelled basophils.
To clarify whether the human peripheral blood basophil is activated through the low affinity IgG receptor, Fc ƒÁ RII, as well as the high affinity IgE receptor, Fe ƒÃ R I, calcium mobilization after Fc ƒÁ RII stimulation was analyzed by this method. After cross-linking of Fc ƒÁ RII, transient [Ca2+] 1 elevation was observed but there was no apparent difference with interleukin-3 (IL-3)-treated cells, and no significant histamine release was observed with or without short pre-incubation of IL-3. These findings suggest that the cross-linking of Fc ƒÁ RII, not only Fc ƒÃ R I, can activate human basophils which may result in mediator release
