博士（理学） 日野浩嗣 学位論文題名
ホタテガイ精巣におけるRan およびカルシニューリンの 機能に関する研究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
カルシニューリンは、Ca2゛／カルモジュリン依存性のセリン／スレオニン特異的ホ スファターゼである。この 酵素は精巣で多く発現しており、精巣特異的アイソフ オームが存在することが知 られている。カルシニューリンはまた、精細胞の核や 精子の先体後部に局在する ことや、精子形成に伴って発現量が変化することが報 告されている。このため、 カルシニューリンは精子形成に関与すると考えられて いるが、その具体的機能は未解明である。
精巣におけるカルシニュ ーリンの機能を研究する過程で、カルシニューリン結 合タンパク質CaNBP75がホタテガイ精巣より発見された。このタンパク質；ま、C 末 端側 に哺 乳類RanBP3と相同性を示す領域を持つことから、RanBP3のホモログ と 考え られ る。 また 、CaNBP75はカ ルシ ニューリン結合能を持 つのみならず、
RanBP3相 同 領 域 内 にRan結 合 ド メ イ ン が 存 在 し 、Ran結 合 能 を 有 す る 。 Ranは低 分子 量Gタンパク質で、精子完成に伴って精細胞内で の局在が変化す ることが報告されている。 このことから、Ranもまた精 子形成に関与していると 考えられているが、具体的機能は未だ明らかではなぃ。
本研 究で はRan、CaNBP75およびカルシニューリンが精子形成 の過程で協同し て働くことを仮定し、この 仮定を検証することで、精巣におけるRanおよびカル シ ニ ュ ー リ ン の 機 能 解 明 に 向 け た 新 た な 知 見 を 得 る こ と を 目 的 と し た 。 精巣におけるRanおよびカルシニューリンの機能をホ タテガイ精巣を材料に用 い て検 討す るに あた り、 はじ めに ホタ テガ イRanのcDNA塩基配 列を決定した。
推定されたタンパク質一次 構造の比較から、得られたホタテガイRanは多くの生 物種のRanと比較して高度に保存されていることを明ら かにした。次に、ノーザ ン ブロ ツ卜 法に よルホタテガイRan mRNA分子種の検討を行い、 ホタテガイ精巣 には単一の分子種のRanが発現している可能性が高いこ とを明らかにした。さら に 、マ ウス のRanとの比較により、 この分子種はマウスの体細胞型のRanに近い ことも明らかにした。加え て、ホタテガイ精巣からのRanの精製法を確立し、生 化学的解析に必要なミリグ ラム量のRanの精製を可能に するとともに、クローニ
ン グに より 得ら れたcDNAがコ ード するRanと ホタ テガ イ精 巣に 発現 して いる Ranが同一のものであることも示した。
精巣でRan、CaNBP75、カル シニューリンが協同して働く可能性を検証するた め、ホタテガイ精巣におけるRanの生殖周期に応じた発現量変化をノーザンブロ ツ卜法により解析し、これまでに精子完成期に極大となることが明らかになって いるカルシニューリンおよびCaNBP75の発現量変化との比較検討を行った。その 結果、Ranも生殖周期に伴って発現量が変化し、精子完成期に発現が極大になる こと、この変化はCaNBP75やカルシニューリンの発現量変化とも一致することを 明らかにした。これは、Ran、CaNBP75、カルシニューリンが精子形成の同時期 に働くことを示唆するもので あり、CaNBP75のRan、カルシニューリン結合能も 考慮すると、これらのタンパク質が精子形成に協同して働く可能性を示すもので ある。次に、細vitroでのRan、CaNBP75、カルシニューリンの複合体形成能をGST pull‑down法に より 検討 し、Ran、 カル シニ ュー リンがGST融合CaNBP75に同時 に結合しうることを示した。さらに、ホタテガイ精巣抽出液を用いた免疫共沈降 法 によ る複 合体 の検 討より、生理的条件下でもC州BP75がカルシニューリンと Ca2゛依存的に結合していること、RanがCaNBP75を介してカルシニューリンと複 合体を形成することが示唆さ れた。これは、Ran、CaNBP75、カルシニューリン は三元複合体を形成し、精子完成期の精巣で協同して働きうることを示すもので ある。
本研究の結果と、これまで に報告されているRanとカルシニューリンの精子完 成期の局在から、精子形成期の核でのカルシニューリンの機能及び精子先体後部 でのRanおよびカルシニューリンの機能にっいてのモデルを提唱した。これらの 機能は、ホタテガイのみならず、哺乳類でも保存されているものと考えられる。
本研究は、低分子量Gタンパク質Ranと、Ca2十シグナルの中心的役割を果たす タンパク質カルシニューリンが、精子形成において協同して働きうることを初め て示したものである。本研究で得られた知見やアプローチは、今後の精巣内での Ran、 カ ル シ ニ ュ ー リ ン の 機 能 研 究 に 寄 与 す る も の で あ る 。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨
学 位 論 文 題 名
ホタテガイ精巣におけるRan およびカルシニューリンの 機能に関する研究
博 士 学 位 論 文 審 査等 の 結 果 に つ いて （ 報 告 ）
カ ル シ ニ ュ ー リ ン は 、Ca2+/カ ル モ ジ ュ リ ン依 存 性 の セ リン ′ ス レ オ ニン 特 異 的 ホ ス フ ァ タ ー ゼ で 細 胞 内 で 多 彩 な 機 能 を 果 た し て い る 。 こ の 酵 素 は 精 巣 で 多く 発 現 し て おり 、 カ ル シ ニ ュ ー リ ン は 精 子 形 成 に 関 与 す る と 考 え ら れ て い る が 、 そ の 具体 的 機 能 は 未解 明 で あ る 。 先 行 研 究 で カ ル シ ニ ュ ー リ ン 結 合 蛋 白 質CaNBP75が ホ タ テ ガ イ に 精 巣 よ り 単 離 さ れ 、 こ の 蛋 白 質 が ほ 乳 類 のRan結 合 蛋 白 質RanBP3の ホ モ ロ グ でRan、 カ ′ レ シ ニ ユ ー リ ン 双 方 と 結 合 す る こ と が 示 唆 さ れ て い た 。 低 分 子 量G蛋 白 質Ranは 蛋 白 質 の 核 輸 送 や 染 色 体 制 御 に 関 与 し 、 精 子 形 成 に 関 与 す る こ と も 示 唆 さ れ て いた 。 そ こ で 本論 文 で はRan、CaNBP75、 カ ル シ ニ ュ ー リ ン が 精 子 形 成 過 程 で 協 同 し て 機 能 し て い る こ と を 仮 定 し て 、 生 化 学 的 解 析 が 容 易 な ホ タ テ ガ イ を 用 い て そ の 仮 定 の 検 証 を 試 み た 。 ま ず ホ タ テ ガ イ のRanが 未 同 定 で あ っ た こ と か ら 、 ホ タ テ ガ イ 精 巣 か ら のRanの cDNAの 単 離 を お こ な い 、Ran蛋 白 質 の 精 製 法 を 確 立 し た 。 精 子 形 成 過 程 に お け るRan の 発 現 変 化 を 解 析 し た と こ ろ 、 カ ル シ ニ ュ ー リ ン 、CaNBP75と 同 様 に 、 精 子 完 成 期 に 発 現 が 極 大 と な る こ と を 見 い だ し 、 ． こ の 三 者 の 蛋 白 質 が 協 同 し て 働く こ と が 示 唆さ れ た 。 次 にRan、CaNBP75、 カ ル シ ニ ュ ー リ ン の 複 合 体 形 成 能 に つ い て 精 製 蛋 白 質 を 用 い て 面vitroで 検 証 し 、Ran、 カ ル シ ニ ュ ー リ ン がCaNBP75に 同 時 に 結 合 し う る こ と を 示 し た 。 さ ら に ホ タ テ ガ イ 精 巣 抽 出 液 を 用 い た 免 疫 沈 降 実 験 か ら 、 生 理 的 条 件 下 で も 三 者 の 複 合 体 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ れ は 、Ran、CaNBP75、 カ ル シ ニ ユ ー リ ン は 三 元 複 合 体 を 形 成 し 、 精 子 完 成 期 の 精 巣 で 協 同 し て 働 き う る こ と を 示 し て い る 。
こ れ を 要 す る に 、 著 者 はRanと カ ル シ ニ ュ ー リ ン と ぃ う 細 胞 内 で 重 要 な 因 子 が 協 同 し て 働 く 可 能 性 を 初 め て 示 し た 物 で あ り 、 未 知 な 点 の 多 い 精 子 形 成 過 程の 理 解 に 寄 与す る だ け で な く 、 よ り 広 範 な 生 命 現 象 で の 両 蛋 白 質 機 能 を 理 解 す る 上 で も大 き く 貢 献 する こ と が 予 想 さ れ る 。
よ っ て 著 者 は 、 北 海 道 大 学 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と認 め る 。
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