論文の内容の要旨

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論文の内容の要旨

１申請者

防衛医科大学校伊藤桂

２論文題目

筋小胞体Ca²⁺ ATPase2 Cys674Ser knock-inマウスにおける心室性不整脈発生に関する検討

３論文の内容の要旨

（１）目的

心筋細胞において、筋小胞体 Ca²⁺ ATPase2（SERCA2）は収縮期に細胞質内に放出された Ca²⁺を、拡張期に能動的に筋小胞体内へ取り込むことで細

胞質内 Ca²⁺濃度の恒常性を維持する重要な Ca²⁺トランスポーターである。

心不全では SERCA2 の機能が低下し、筋小胞体内 Ca²⁺が枯渇し、細胞内 Ca²⁺過負荷が起こり種々の障害をもたらす事が知られている。その一つとして細胞質内 Ca²⁺過負荷は撃発活動を引き起こすことで心室性不整脈の原因となりうるが、SERCA2 の異常と心室性不整脈の関連については十分に解明されていない。また、心不全患者で認められる SERCA2 Cystein674 の亜硫酸化は不可逆的な SERCA2 の機能異常を起こすことが過去に報告されている。

そこで今回我々は、SERCA2 Cystein674 を Serine674 に変異させた、 SERCA2 の亜硫酸化を模倣したSERCA2 Cys674Ser knock-in（SKI）マウスを用い、アンギオテンシンⅡ（ANG II）負荷による心負荷モデルを作成し、

このマウスモデルにおける SERCA2 異常が心室性不整脈の誘発性および心筋細胞内 Ca²⁺動態に与える影響について検討した。

（２）対象並びに方法

14-20 週齢の雄の野生型（control）マウスと SKI マウスに 1週間の ANG II

（3 mg/kg/日）もしくは蒸留水の持続皮下投与を行い、vehicle群と ANG II 群を作成した。収縮期血圧、マッソン・トリクローム染色による心筋線維化の程度、心エコー図の評価を行った。また、心電図検査および不整脈の誘発、

オプティカルマッピング法による活動電位持続時間の評価、心臓の mRNA 量の測定、単離心筋細胞での Ca²⁺トランジェントの測定を行った。

（３）成績

ANG II 群では controlマウス、SKI マウスで同等に血圧が上昇し、同等の心肥大と心室の線維化を認めた。心エコー図では ANG II 群は controlマウス、SKI マウスとも左室壁厚の増大を認めたが、左室収縮能は 4群間で差を認めなかった。心電図検査では SKI マウスは vehicle 群、ANG II 群ともに

controlマウスと比較し QT間隔の延長を認めた。カテコラミン投与下の不整

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脈誘発性を vehicle群で比較したところ、SKIマウスでは controlマウスと比較し有意に高い心室性不整脈の誘発を認めた。活動電位持続時間は vehicle 群の SKI マウスにおいて有意に延長していた。カテコラミン非投与下での誘発試験では、ANG II群の SKIマウスでのみ心室性不整脈が誘発された。

心筋の mRNA 発現は control 群の SKI マウスで Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II （CaMK II）の発現が亢進していた。ANGII 群は control、

SKIマウスともに CaMK II、Na⁺/Ca²⁺exchanger、ryanodine receptor（RyR）の発現が亢進していたが、SERCA2 の発現は 4群間で差を認めなかった。

Ca²⁺トランジェント測定では、SKI マウスは vehicle 群で収縮期のピークの Ca²⁺振幅（F/F0）が有意に低下し、拡張早期の主にSERCA2機能を反映するとされるCa²⁺の最大振幅から50%減衰までの時間（Time to 50% relaxation : RT50）が延長していた。ANG II 群では両群とも同等に F/F0 が低下したが、RT50

は ANG II 投与による変化は認めなかった。カフェイン投与による筋小胞体

からの Ca²⁺放出量は SKI マウスで著明に低下していた。また、SKI マウスは Ca²⁺スパーク頻度が有意に増加しており、特に ANG II群の SKI マウスにおいて著明な Ca²⁺スパークの増加を認めた。

RyR からの Ca²⁺リークを抑制するダントロレンを投与すると、ANG II 群の SKI マウスで認めた心室性不整脈の誘発性が有意に低下した。Ca²⁺トラン

ジェントにおいては低下した F/F0が改善し、カフェインによる筋小胞体からの Ca²⁺放出量が増加し、Ca²⁺スパーク頻度が低下した。

（４）考察

SKI マウスは左室収縮能や心筋線維化に変化がないにも関わらず、カテコラミン急性負荷や ANG II 慢性負荷下で高い心室性不整脈の誘発を認めた。

SKI マウスは SERCA2 の機能低下により拡張期の筋小胞体への Ca²⁺取り込

みが低下し筋小胞体 Ca²⁺貯蔵の低下・細胞内 Ca²⁺濃度の増加を来たしていると考えられた。細胞内 Ca²⁺濃度の増加に RyR を介した Ca²⁺リークの増加が報告されている。SKI マウスのRyR からの Ca²⁺リークは control群で増大しており、ANG II慢性負荷下で更に増加した。ダントロレンによる RyRからの Ca²⁺リークの抑制は SKI で認めた不整脈誘発性と Ca²⁺ハンドリング異常を改善させた。これらの結果から、心負荷下での RyR からの Ca²⁺リーク

に SERCA2 の機能低下が加わることが、Ca²⁺ハンドリング異常による心室

性不整脈の原因になり得ると考えられた。

（５）結論

SERCA2 Cys674Ser knock-in マウスは、SERCA2の機能低下により心筋細胞内 Ca²⁺ハンドリング異常を来し、ANG II による心負荷下で高い心室性不整脈の誘発性を示した。筋小胞体の Ca²⁺リークの抑制は Ca²⁺ハンドリングを改善させ、本モデルにおける心室性不整脈を抑制した。心室性不整脈に対して筋小胞体への介入は有効であると考えられ、今後、SERCA2を含めた筋小胞体の Ca²⁺ハンドリングを標的とすることは新たな不整脈治療戦略になりうるものと考えられた。