腫瘍特性にリンクしたリン酸化蛋白質の解析田中正光

(1)

腫瘍特性にリンクしたリン酸化蛋白質の解析

田中正光

秋田大学大学院医学研究科分子生化学

（平成

21

年

11

月

26

日掲載決定）

Tyrosine phosphorylation mediated signaling in solid tumors Masamitsu Tanaka

Department of Molecular Medicine and Biochemistry, Akita University Graduate School of Medicine, Akita 010

^-

8543, Japan

はじめに

癌治療のうえで最も深刻な問題点である転移，浸潤をいかに阻止するかという課題に対し，シグナル伝達の立場から，治療の標的となる分子を選択するアプローチがよく行われている．蛋白質相互作用による信号伝達の立場から，癌の転移，浸潤過程において特異的に活性化される信号経路を同定し，その経路を遮断するうえで有効な標的蛋白質のツールをデザインする方向性である．癌細胞の正常細胞とは異なった信号経路を探索する目安のひとつとして，蛋白質のチロシンリン酸化レベルの異常が知られている．チロシンリン酸化は蛋白質のリン酸化全体の数

%

であるが，

それが重要であることは，レトロウイルスの腫瘍原性の元となる癌遺伝子産物や増殖因子受容体の多くがチロシンキナーゼである事，細胞の増殖，分化，運動性や接着などに広く関与していることによる．現在知られている多くの分子標的療法は，チロシンキナーゼを標的対象にしているが，その多くは対象の分子特異性が高いと言えず，また酵素活性を持つキナーゼ蛋白質は広範囲の下流分子に影響を及ぼし，正常細胞にも必要な経路もすべて抑制してしまう副作用が問題となる．そこで，キナーゼによりリン酸化を受ける基質蛋

白質を治療標的分子にすることは，より個別の信号経路だけを遮断し，副作用の少ない治療設計が期待できる．本稿では，難治性の癌であるスキルス胃癌に関与するチロシンリン酸化蛋白質の中から，最近同定された

Ossa

と

Eph/ephrin

ファミリーを中心に解説する．

1. スキルス胃癌における

チロシンリン酸化蛋白質の同定

スキルス胃癌は最も予後の悪い胃癌のタイプであり，浸潤性が激しく，胃壁を破った癌細胞が腹腔にこぼれ落ちて，腹膜播種を起こしやすい特徴を有する．

そこでスキルス型癌が腹膜播種してゆく過程で，強くリン酸化されている蛋白質を探索した．ヒトスキルス癌由来の胃癌細胞を用い，ヌードマウスでの腹膜播種組織でリン酸化の亢進した蛋白質を精製し，質量分析による同定を行った．リン酸化蛋白質は，リン酸化チロシンと特異的に結合する

SH2

ドメインによるアフィニティー精製と，抗リン酸化チロシン抗体による二段階の精製を用いた．その結果，細胞の基質接着班の形成や細胞移動にとって重要なことが知られている

p130Cas

や

FAK

などとともに，CDCP1，Ossa/C9orf10 などの蛋白質が同定された（図

1）．このうち CDCP1

は

1

型の細胞膜貫通蛋白質で，Srcの主要な基質蛋白質である．その機能として，CDCP1は

Src

と

PKC δ

の足場蛋白質として働き，Srcによる

PKC δ

のリン酸化を媒介することで，細胞の足場非依存性増殖を促進している

^1）

．CDCP1はスキルス胃癌において，周辺の正常胃粘膜に比較し高い発現がみられ，スキルス胃癌細胞が腹膜播種の過程において腹腔内で浮遊した状態

Corresponcence : Masamitsu Tanaka, M.D.

Department of Molecular Medicine and Biochemistry, Akita University Graduate School of Medicine, 1

^-

1

^-

1 Hondo, Akita 010

^-

8543, Japan

Tel : 81

^-

18

^-

884

^-

6077 Fax : 81

^-

18

^-

884

^-

6078

E

^-

mail : [email protected]

^-

u.ac.jp

※平成

21

年

1

月

9

日新任教授就任講演

(2)

での生存を助けていることなどが示唆された

^2）

．

2. Ossa/C9orf10

Ossa（Oxidative^-

stress associated Src activator）は，

酸化ストレスに伴う

Src

の新規活性化因子として命名した

^3）

．癌細胞は生体のなかで，虚血や血流再開，炎症，

抗癌剤や光線療法，放射線療法など多くの場面において酸化ストレスに晒されているが，それに抵抗して生き延びる機構を備えている

^4,5）

．その防御機構のひとつに，酸化ストレスに応じて

Src

ファミリーの活性化が誘導され，抗アポトーシスシグナルが生じることが知られているが，そのメカニズムは不明である．Srcはその

C

末のチロシン部位（Y530）がリン酸化を受けると，自身の

SH2

ドメインと結合し，また分子内で

SH3

ドメインとプロリンリッチ配列との結合で折りたたまれるため不活性型となる．一方で，これらの分子内結合が無い状態ではキナーゼドメインが開いているため，エフェクター蛋白質に対してキナーゼ活性を有する活性型となっている．細胞内ではそれらの構造が中間体を含めて平衡状態を保っていると考えられているが，Srcが他の蛋白質と結合し，自己の分子内結合による折りたたみが防がれている状況では，安定的

に

Src

は活性化型となる（図

2）．そこで Ossa

と

Src

の相互作用につき調べてみたところ，Ossaはそのチロシンリン酸化を介して

Src

の

SH2

ドメインと結合し，また

N

末付近のプロリンリッチ配列によって

Src

の

SH3

ドメインと結合能を有していた．この

Ossa

との蛋白質間結合によって

Src

の自己折りたたみが防がれる結果，

Src

キナーゼの活性化が誘導される（図

2）．

Ossa

を発現しているスキルス胃癌細胞に紫外線照射や過酸化水素処理をすると

ROS（Reactive oxygen

図

1. ヌードマウスに腹膜播種した胃癌組織（左図）から精製した，チロシンリン酸化蛋白質（右図）．

同定したいくつかの蛋白質名を記した．

図

2. Src

の活性化機構．分子内結合で折りたたま

れた不活化状態（左）．Ossaとの結合などにより，

分子内結合が阻害され活性化型となった状態（右）．

中央はその中間体を示す．

(3)

species :

活性酸素）が産生され，これに応答して数分以内に

Src

ファミリーの活性化が誘導される．その時

RNAi

によって

Ossa

の発現を低下させた細胞では

ROS

産生に応じた

Src

の活性化が阻害されていた（図

3）．つまり，酸化ストレス抵抗性としての Src

キナー

ゼの活性化には，Ossaが必要であると考えられた．

Ossa

は

Src

との相互作用により抗アポトーシスシグナルを誘導する

酸化ストレスに応答した，Ossaによる

Src

活性化の意義を調べるため，そのシグナル伝達機構を解析した．

まず

Ossa

は，胃癌組織でチロシンリン酸化の亢進している蛋白質として同定されたように，

Src

ファミリーと結合して

Src

を活性化すると同時に，Srcの基質としてリン酸化を受ける（図

3）．同リン酸化チロシン

部位に対して，PI3キナーゼの

p85

サブユニットが結合することで，結局

Ossa

は

Src

と

PI3

キナーゼと複合体を形成する足場蛋白質となっていた．その結果，

Src

による

PI3

キナーゼの直接的な活性化を経て，PI3 キナーゼの標的蛋白質である

Akt

が活性化される．

Akt

は抗アポトーシス作用を持つ主要な分子であることが知られているが，実際

Ossa

の発現をノックダウンさせた胃癌細胞は，紫外線照射や過酸化水素処理によるアポトーシスが著名に亢進する．また逆に

Ossa

を過剰発現させた細胞では，これらの酸化ストレスによるアポトーシスに対して有意な抵抗性がみられた．

Ossa

は

mRNA

結合蛋白質で

IGFII

の産生を促進する

Ossaのシグナル伝達をさらに検索する過程で，

Ossa

は

IMP

^-

1（IGFII mRNA binding protein

^-

1）と複

合体を形成することが分かったが，その結合は

RNA

を介したものであった．解析の結果，Ossaはその

C

末において

mRNA

との結合能を有しており，その一つとして

IGFII mRNA

と結合し，その

mRNA

の安定性を制御する．実際

Ossa

の過剰発現によって，細胞外に分泌される

IGFII

蛋白質の量も増加していた．

IMP

^-

1

など

IGFII

の産生に関わる他の蛋白質に対する影響や，他にどのような

mRNA

と

Ossa

が結合するかなどが，今後注目される．

Ossaは，Src，PI3キナーゼとの相互作用を介した信号伝達による経路と，C末の

RNA

結合による

IGFII

の産生促進の二つの独立した機序によって癌細胞の生存を助ける抗アポトーシス作用をもつ蛋白質であることが明らかになった（図

4）．ヒトの手術症例で Ossa

の発現分布を検索すると，スキルス胃癌の約

7

割で腫瘍部位に

Ossa

の発現が観察され，また

Ossa

の発現を恒常的に抑制したスキルス胃癌細胞のヌードマウスにおける腫瘍形成を調べてみると，皮下移植腫瘍のサイズや腹腔内接種による腹膜播種が有意に低下しており，治療の分子標的になる可能性が示唆された（図

5）．

たとえば

Ossa

の機能により，抗癌剤による酸化ストレスに対して癌細胞が治療抵抗性を獲得している事などが考えられ，今後の解析対象である．

図

3. 紫外線照射による Src

の活性化には

Ossa

が必要である．UV刺激により

Src

が活性化（Tyr419のリ

ン酸化で判定）され，それにより

Ossa

自身のリン酸化が生じる（左図）．Ossaをノックダウンした細胞では

Src

の活性化が誘導されない（右図）．

(4)

Eph/ephrin

ファミリーの癌における機能

Ephファミリーは受容体型チロシンキナーゼのなかでは最大の分子数をもち，そのリガンドである

ephrin

ファミリーとともに近年腫瘍における機能がクローズアップされている．我々は以前ヒト胃癌組織で高発現している受容体として

EphB2

をクローニングした事から，Eph/ephrinファミリーの解析に携わっている．

Eph/ephrin

の特徴は

ephrin

も細胞膜に固定されているため，Eph発現細胞と

ephrin

発現細胞の細胞間接触により，双方向性のシグナルが誘導されることであ

る

^6,7,8）

．その結果生じる現象として細胞間の反発運動

があげられる（図

6）．Eph/ephrin

は神経細胞で発現量が高いが，たとえば

ephrin

を発現している神経軸索は対応する

Eph

を発現している脳の領域からは反発され，軸索が誤った領域に投射されることを防いでいる．また，小腸などの絨毛では基底側と表層側の領域で，それぞれ

EphB

受容体と

ephrin

^-

B

が発現しているため，その境界領域では反発運動により両者の領域の細胞が入り混じることなく，その絨毛内での位置が規定される．他に，同ファミリーは血管の動静脈の分化や，骨での骨芽細胞・破骨細胞の分化の制御，膵臓ラ氏島でのインシュリンの分泌制御など多彩な機能が知られている

^9,10）

．一方で，自他の報告から

Eph/

ephrin

は多くの腫瘍細胞で発現がみられ，その腫瘍に

おける機能解析が最近進んできている．その中で我々は，上皮細胞における機能や細胞内シグナル経路があまり分かっていなかった

ephrin

^-

B1

の下流シグナルが

癌の進展を促進していることを報告してきた．

Ephrin

^-

B1

のシグナル伝達は癌の進展を促進する Bタイプの

ephrin

の中で

ephrin

^-

B1

や

ephrin

^-

B2

は，

多くの種類の癌において特に浸潤性の高い癌組織で高発現していることが報告されている．実際，ephrin^-

B1

を過剰発現させた膵臓癌細胞は，ヌードマウスの

図

5. 恒常的に Ossa

をノックダウンした胃癌細胞（miOssa）は，コントロール（miLacZ）に比較し，ヌー

ドマウス皮下腫瘍の縮小（左図）や，腸間膜播種の抑制（右図）が観察される．

図

4. Ossa

は

Src

と

PI3

キナーゼの足場蛋白質と

して働き，PI3キナーゼ

/ Akt

の活性化を誘導し，

細胞は酸化ストレス抵抗性を獲得する．その一方で

Ossa

は

IGFII mRNA

と結合し，IGFIIの分泌を促進することでも細胞の生存を促す．

(5)

腹腔内移植した際の腹膜播種が亢進した

^11）

．そのメカニズムとして，ephrin^-

B1

はタイトジャンクションを

構成する

claudin

と相互作用する事で，細胞間接着を

負に制御する

^12）

．また

ephrin

^-

B1

はその

C

末で

di-

shevelled

と結合し，そのシグナル伝達の結果

RhoA

の活性化を誘導することで癌細胞の移動に寄与する

^13）

．さらに

ephrin

^-

B1

の

C

末を介したシグナル伝達は，Arf1の活性化を経て細胞外基質分解酵素であるマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の分泌を亢進することで，癌細胞の浸潤性を増すと考えられた

^11）

（図

7）．この時 ephrin

^-

B1

を発現している癌細胞に対して，EphB受容体による細胞外刺激が加わると，

MMP

の分泌がより促進される．では実際の癌組織でも，このような

EphB

受容体を発現している細胞との接触がみられるのか

? 例えば腹膜播種の過程では癌

細胞が腹膜に生着するが，その表面を覆っている中皮細胞では実際，EphB2や

EphB4

の高い発現が認められる．このような場面では

EphB/ephrin

^-

B1

の相互作用が癌の微小環境を規定して，ephrin^-

B1

を発現している癌細胞の局所浸潤を高めているのではないかと考えている（図

8）．

癌の治療標的分子としての

Ephrin

^-

B1

Ephrin^-

B1

を発現している癌細胞の進展を抑制する

図

6. Eph

受容体と

ephrin

との相互作用による反

発作用．細胞自体の移動や，神経軸索の投射，腸管の上皮細胞の位置の制御などに関っている．

図

7. Ephrin

^-

B1

の腫瘍細胞における機能．1Ephrin^-

B1

を導入した膵臓癌細胞は，ヌードマウスにおける腹

膜播種が促進する．2 RhoAの活性化などを介して，細胞移動を制御している．3 メタロプロテアーゼの細胞外分泌過程を促進する．4 細胞間接着を負に制御する．

(6)

ため，

ephrin

^-

B1

の信号伝達を阻害する試みをおこなっている．まず，Ephrin^-

B1

の

C

末を介したシグナルを阻害するために，同部位のアミノ酸配列に

HIV

の細胞膜透過シグナルを付加した合成ペプチドを用いた

^14）

．この

ephrin

^-

B1 C

末ペプチド（EFNB1^-

C）を培

養細胞の培地中に添加すると，上記

dishevelled

との

結合や

RhoA・Arf1

の活性化が阻害され，また

MMP

の分泌促進作用も抑制され，ephrin^-

B1

の

C

末に依存するシグナル伝達を効率よく阻害できた．そこで

in vivo

における効果を調べるため，ephrin^-

B1

を発現しているスキルス胃癌細胞をヌードマウス腹腔内に接種し，その後連日

EFNB1

^-

C

ペプチドを同じく腹腔内に投与して腹膜播種に対する影響を判定した．その結果，

EFNB1

^-

C

ペプチド処理群では対照群に比較して，ス

キルス胃癌細胞の腸間膜や大網への播種，また直腸近傍への播種が，腫瘍結節のサイズ，数いずれにおいても低下していた．一方で，ephrin^-

B1

は対応する

EphB

受容体による刺激によって，細胞内領域のチロシンリン酸化が生じる．この

ephrin

^-

B1

のチロシンリン酸化を介したシグナル伝達を遮断する

ephrin

^-

B1

変

異体の過剰発現においても，やはりスキルス胃癌細胞の腹膜播種の抑制を認めている

^15）

．これらの事から，

ephrin

^-

B1

の

C

末を介したシグナルと，チロシンリン酸化を介したシグナルの両方を遮断する事で

ephrin

^-

B1

を発現する癌細胞の進展をより効率よく阻害できるのではないかと示唆された．

おわりに

以上，我々の報告してきた癌組織におけるチロシンリン酸化蛋白質の解析の中から

Ossa，ephrin

^-

B1

を中心に解説した．今後の取り組みのひとつとして，このようなリン酸化蛋白質を治療標的とした検索，基礎解析を播種型の腫瘍組織を中心に広げてゆこうとしている．治療応用にあたっては，これらの実験で用いた

ephrin

^-

B1

の

C

末ペプチドなどの正常細胞に対する影響の検索が，今後の課題としてあげられる．

図

8. 腹膜播種の形成過程（左図）．Ephrin

^-

B1

を発現している癌細胞が，対応する

EphB

受容体を発現し

ている腸間膜の中皮細胞などと接触すると，ephrin^-

B1

のシグナル伝達により癌細胞の浸潤が亢進するモデル図（右）．

(7)

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腫瘍特性にリンクしたリン酸化蛋白質の解析 田 中 正 光