Title
The conditioned medium of murine and human adipose-derived
stem cells exerts neuroprotective effects against experimental
stroke model( 内容と審査の要旨(Summary) )
Author(s)
江頭, 裕介
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(医学) 甲第925号
Issue Date
2013-03-25
Type
博士論文
Version
none
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/48069
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏名（本籍） 学 位 の 種 類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 審 査 委 員 江 頭 裕 介（福岡県） 博 士（医学） 甲第 925 号 平成 25 年 3 月 25 日 学位規則第４条第１項該当
The conditioned medium of murine and human adipose-derived stem cells exerts neuroprotective effects against experimental stroke model （主査）教授 犬 塚 貴 （副査）教授 柴 田 敏 之 教授 小 倉 真 治 論 文 内 容 の 要 旨 近年，実験的脳梗塞に対する種々の幹細胞を用いた治療の有効性を示す報告が散見されるが，そ の主たるメカニズムは神経再生よりもむしろ分泌因子による神経傷害の軽減によるものであると考 えられている。また近年，成熟脂肪組織より多分化能を有する幹細胞を採取可能であることが明ら かとなり，摘出の際の安全性が高い点や培養効率が良い点から注目されている。そこで今回我々は， 脂肪幹細胞（Adipose stem cell: ASC）分泌因子の神経保護作用に注目し，マウスおよびヒト脂肪 組織由来幹細胞の培養上清（ASC-conditioned medium: ASC-CM）を用い，実験的脳梗塞モデルに対 する保護作用を検討した。 【対象と方法】 マウス ASC は胸腹部皮下脂肪より，ヒト ASC は脳室腹腔シャント術の際に承諾を得て採取した腹部 皮下脂肪より分離した。分離，培養した ASC（4×105細胞）を FBS 不含有ダルベッコ変法イーグル 培地（DMEM）にて 72 時間培養後に培養上清を回収し，濾過後種々の濃度に濃縮し以下の実験に用い た。 実験 1: in vivo での実験には 4 週齢雄性 ddY マウス中大脳動脈 2 時間閉塞再灌流モデルを用いた。 (A)虚血開始 1 時間前に種々の濃度（10，30，100 倍）に濃縮したマウス ASC-CM 2μL を脳室内単回 注入により投与し，Vehicle 群では同量の培地（DMEM）を投与した。虚血 24 時間後の各治療群にお ける脳梗塞面積，脳梗塞体積，脳浮腫を 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)染色によっ て評価し，また神経症状を比較した。 (B) マウス ASC-CM 投与の治療可能時間を検討するため，虚血直後および虚血 2 時間後に 100 倍濃縮 マウス ASC-CM 2μL の脳室内単回投与を行い，虚血 24 時間後の脳梗塞面積，脳梗塞体積，脳浮腫を TTC 染色により Vehicle 群と比較した。 実験 2: in vitro での実験にはヒト神経芽細胞腫細胞株(SH-SY5Y)を用い，glutamate 誘発神経細胞 死に対するマウス ASC-CM の効果を Hoechst 33342 と Propidium Iodine による蛍光染色法により検 討した。マウス ASC-CM は 100 倍濃縮のものを用い，種々の濃度（体積比 1，3，10%）で培養細胞培 地中に添加した。
実験 3: 実験 1 と同様の in vivo 系を用い，虚血 1 時間前 100 倍濃縮ヒト ASC-CM 2μL の脳室内単 回投与を行い，虚血 24 時間後の脳梗塞面積，脳梗塞体積，脳浮腫を TTC 染色により Vehicle 群と比
較した。
【結果】
実験 1 (A): 虚血 1 時間前の ASC-CM の投与は，Vehicle 群と比較し用量依存的に虚血 24 時間後の脳 梗塞面積，脳梗塞体積および脳浮腫を抑制した。また，虚血 24 時間後の神経症状は Vehicle 群と比 較し 10 倍，30 倍濃縮 ASC-CM 投与群で有意に軽減されており，100 倍濃縮 ASC-CM 投与群においても 神経症状が軽減する傾向がみられた。 実験 1 (B): 虚血直後の 100 倍濃縮マウス ASC-CM の投与により虚血 24 時間後の脳梗塞面積，脳梗 塞体積は有意に抑制されたが，虚血 2 時間後の投与では脳梗塞面積，脳梗塞体積および脳浮腫の抑 制効果を認めなかった。 実験 2: ASC-CM 添加により，glutamate 添加により誘発された細胞傷害が抑制された。また，その 抑制効果は濃度依存的であった。 実験 3: 虚血１時間前の 100 倍濃縮ヒト ASC-CM の投与により，マウス ASC-CM 投与と同様に虚血 24 時間後の脳梗塞面積，脳梗塞体積は有意に抑制された。脳浮腫については抑制傾向を認めるものの， 統計学的に有意ではなかった。 【考察】 ASC は他の間葉系幹細胞と比較し，採取が簡便である点，培養効率が良い点などから臨床応用が 有望視される幹細胞である。一方，種々の幹細胞移植の実験的脳卒中に対する有効性については既 に多くの報告がなされているが，急性期から治療効果が発揮される点など，主たる作用は神経再生 よりもむしろ分泌因子による神経保護作用と考えられる。我々は本研究で ASC-CM が実験的脳虚血に 対する抑制作用を有することを初めて示した。ASC の主要分泌因子としては，vascular endothelial growth factor ， hepatocyte growth factor な ど の 血 管 新 生 促 進 因 子 や tissue inhibitor of metalloproteinase-1 や progranulin などの抗炎症作用，神経保護作用が報告されている因子が挙 げられ，これらの複合的な作用により ASC-CM 投与が実験的脳虚血に対する神経保護効果を示した可 能性が示唆された。これらの知見は，ASC-CM もしくは ASC 分泌因子の投与が脳梗塞急性期の新たな 治療手段となり得る可能性を示唆している。 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 申請者 江頭 裕介は，マウスにおける実験的虚血性脳卒中に対し，脂肪組織由来幹細胞培養上 清が神経保護作用を有することを示した。本研究の成果は脂肪組織由来幹細胞分泌因子が急性期虚 血性脳卒中に対する新規治療手段となり得る可能性を示唆しており，脳卒中学および脳神経外科学 の発展に少なからず寄与するものと認める。 ［主論文公表誌］
Yusuke Egashira, Sou Sugitani, Yukiya Suzuki, Keisuke Mishiro, Kazuhiro Tsuruma, Masamitsu Shimazawa, Shinichi Yoshimura, Toru Iwama, Hideaki Hara: The conditioned medium of murine and human adipose-derived stem cells exerts neuroprotective effects against experimental stroke model
