- 61 -
A. 研究目的肺炎は日本人の主な死因となっている疾患で ある。肺炎球菌は成人の市中肺炎の原因菌として 最も頻度の高い細菌であり、しばしば菌血症や髄 膜 炎 な ど の 侵 襲 性 肺 炎 球 菌 感 染 症（invasive pneumococcal disease; IPD）をおこす。そのため、
IPD症例における原因菌の動向調査を行うことを 目的とした細菌学的解析研究が必要である。
肺炎球菌は菌体表層の多糖抗原の違いにより、
100種類近くの血清型に分類される。また、菌体 表層に存在する蛋白抗原の一つに pneumococcal surface protein A（PspA）という蛋白があり、
肺炎球菌の重要な病原因子の一つと考えられて いる。PspA は Family 1、2、3に分類されるが、
ほとんどの菌株は Family 1または Family 2に分 類される。また、Family 1は clade 1と clade 2、
Family 2はclade 3、clade 4、及びclade 5、Family 3はclade 6に分類される。IPD症例から分離され た菌株の細菌学的特徴を把握するうえで、血清型 やPspAの分布を解析することは重要である。本 分担研究では、侵襲性肺炎球菌感染症例から分離 した菌株のPspA蛋白のclade解析を行った。
B. 研究方法
1）
肺炎球菌株2017年 1 月から12月の間に、北海道、山形、
宮城、新潟、三重、奈良、高知、福岡、鹿児島、
沖縄の10道県にて、IPD 症例の血液、髄液また は他の組織から分離された412株の肺炎球菌株を 用いた。
2）
肺炎球菌ゲノムDNA
の精製HighPure PCR Product Purification Kitを用い て、血液寒天培地にて37ºC、5% CO
2下で一晩培 養した肺炎球菌のゲノムDNAを精製した。
3） PspA
遺伝子のPCRとシークエンス解析PspA遺伝子を増幅させるために、各臨床分離 肺炎球菌株のゲノムDNAをテンプレートとして、
LSM12プライマーと SKH2プライマー（
表 1 参照）、Quick TaqTM HS DyeMixを用いてPCRを 行った。PCRは、初回サイクル94℃、2 分、その 後、94℃、30秒、55℃、30秒、68℃、1 分を30サ イクル、その後、68℃、5 分で行った。電気泳動 にて PCR 産物を確認後、精製し、SKH2プライ マーを用いて、PspA 遺伝子シークエンス解析 を行った。
厚生労働科学研究費補助金（新興・再興感染症及び予防接種政策推進研究事業）
分担研究報告書
成人IPD症例分離株のPspA clade分布の解析
研究分担者：
金城 雄樹（国立感染症研究所真菌部）
研究協力者：
常 彬（国立感染症研究所細菌第一部）
大西 真（国立感染症研究所細菌第一部）
研究要旨 肺炎球菌は日本人の主な死因である肺炎の起炎菌として最も頻度が高く、菌血症や髄膜
炎などの侵襲性感染症の起炎菌としても重要である。そのため侵襲性肺炎球菌感染症例から分離し た菌株の細菌学的解析は重要である。本研究では、全ての肺炎球菌に認められる重要な病原因子の 一つである pneumococcal surface protein A（PspA）蛋白に着目し、2017年に成人侵襲性肺炎球 菌感染症例から分離された412株のPspA蛋白のclade解析を行った。PspA蛋白は、Family 1-3に分 類され、Family 1にはclade 1と2、Family 2にはclade 3、4と5、Family 3にはclade 6が存在する。
Clade の内訳は、clade 1が39.6% で最も多く、clade 3が27.2%、clade 2が17.9%、clade 4が14.1%、
clade 5が1.0%、clade 6が0.2%であった。PspAは新しい肺炎球菌ワクチン抗原として有望である。
今回の解析で、Clade 1-4で98.8%を占めることが明らかになった。今後、PspA clade 1-4をカバー
するワクチンを開発することで、幅広い感染防御効果をもたらすことが期待される。
- 62 - 4） PspA clade
判定PspA 蛋 白 の プ ロ リ ン リ ッ チ 領 域 の 上 流 約 400bp の塩基配列（clade 同定領域、
図 1参照）
を family, clade が同定されている参照株の PspA 塩基配列と比較し、同定を行った。
PspA 蛋白の構造と clade 同定領域の模式図を 示した。
（倫理面への配慮）
国立感染症研究所医学研究倫理審査委員会か らの承認を得ている。
C. 研究結果
成人 IPD 症例から分離した412株の PspA 蛋白 の clade 解析を行った。PspA Family の割合は、
family 1が57.5%、family 2が42.3%、family 3が0.2%
であった（
表 2）。Familyの割合は、以前と比較 して大きな違いはなかった。
PspA clade毎の割合は、clade 1が39.6%で最も 多 く、clade 3が27.2%、clade 2が17.9%、clade 4 が14.1%、clade 5が1.0%、clade 6が0.2%であった
（
表 3）。先行研究及び私達のこれまでの PspA
clade分布の解析において、clade 1が最も多いこ とが報告されていたが、2015年またはそれ以前の 菌株の解析結果と比較して、clade 1の割合が低 下していた。
ま た、PspA clade1-4の 合 計 は98.8% で あ り
（
表 4）、成人IPD由来菌株のほとんどがclade 1-4 に分類されるという特徴があることが明らかに なった。
D. 考察
今年度は、2017年 1 月から12月に成人IPD症例 から分離された412株のPspA蛋白のclade解析を 行った。その結果、family 1が57.5%、family 2が 42.3%、family 3が0.2%であった（
表 2）。海外の 報告では、Family 1と Family 2の比率は、半々 であるという報告、Family 1の方が多い、または Family 2が多いという報告があるが、何れの報告 も極端な違いはない。これまでの私達の解析で も、Family 1が Family 2よりも少し多いという 結果であり、大きな変化を認めなかった。また、
clade 1が最も多いということは、先行研究及び これまでの解析結果と一致した所見であるが、こ れまでの結果と比べて、clade 1の占める割合が 低下していた。
小児での PCV13定期接種導入に伴い、成人の
clade 5、Family 3 は clade 6 に分類さ れる。IPD 症例から分離された菌株の細 菌学的特徴を把握するうえで、血清型や PspA の分布を解析することは重要であ る。本分担研究では、侵襲性肺炎球菌感 染症例から分離した菌株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。
Ｂ．研究方法
1）肺炎球菌株：
2017 年 1 月から 12 月の間に、北海道、
山形、宮城、新潟、三重、奈良、高知、
福岡、鹿児島、沖縄の 10 道県にて、IPD 症例の血液、髄液または他の組織から分 離された 412 株の肺炎球菌株を用いた。
2）肺炎球菌ゲノム DNA の精製：
HighPure PCR Product Purification Kit を用いて、血液寒天培地にて 37ºC、5% CO
2下 で 一 晩 培 養 し た 肺 炎 球 菌 の ゲ ノ ム DNA を精製した。
3）PspA 遺伝子の PCR とシークエンス解 析：
PspA 遺伝子を増幅させるために、各臨床 分離肺炎球菌株のゲノム DNA をテンプレ ートとして、LSM12 プライマーと SKH2 プ ライマー（表 1 参照）、Quick TaqTM HS DyeMix を用いて PCR を行った。PCR は、
初回サイクル 94℃、2 分、その後、94℃、
30 秒、55℃、30 秒、68℃、1 分を 30 サ イクル、その後、68℃、5 分で行った。
電気泳動にて PCR 産物を確認後、 精製し、
SKH2 プライマーを用いて、PspA 遺伝子 シークエンス解析を行った。
表 1．PspA の PCR で使用したプライマー
4）PspA clade 判定：
PspA 蛋白のプロリンリッチ領域の上流 約 400bp の塩基配列（clade 同定領域、
図 1 参照）を family, clade が同定され ている参照株の PspA 塩基配列と比較し、
同定を行った。
図 1．PspA 蛋白の模式図
PspA 蛋白の構造と clade 同定領域の模式図を 示した。
（倫理面への配慮）
国立感染症研究所医学研究倫理審査委 員会からの承認を得ている。
C. 研究結果
成人 IPD 症例から分離した 412 株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。PspA Family の割合は、family 1 が 57.5%、
family 2 が 42.3%、family 3 が 0.2%で あった（表 2）。Family の割合は、以前 と比較して大きな違いはなかった。
表 1. PspAのPCRで使用したプライマー
表 2．成人 IPD 由来菌株の PspA Family の内訳
PspA clade 毎の割合は、clade 1 が 39.6%
で最も多く、clade 3 が 27.2%、clade 2 が 17.9%、clade 4 が 14.1%、clade 5 が 1.0%、clade 6 が 0.2%であった（表 3）。
先 行 研 究 及 び 私 達 の こ れ ま で の PspA clade 分布の解析において、clade 1 が 最も多いことが報告されていたが、2015 年またはそれ以前の菌株の解析結果と 比較して、clade 1 の割合が低下してい た。
表 3．成人 IPD 由来菌株の PspA clade の内訳
また、PspA clade1-4 の合計は 98.8%
であり（表 4） 、成人 IPD 由来菌株のほと んどが clade 1-4 に分類されるという特 徴があることが明らかになった。
表 4．成人 IPD 由来菌株の PspA clade 分布の 特徴
D. 考察
今年度は、2017 年 1 月から 12 月に成 人 IPD 症例から分離された 412 株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。その結果、
family 1 が 57.5%、family 2 が 42.3%、
family 3 が 0.2%であった（表 2） 。海外 の報告では、Family 1 と Family 2 の比 率は、半々であるという報告、Family 1 の方が多い、または Family 2 が多いと いう報告があるが、何れの報告も極端な 違いはない。これまでの私達の解析でも、
Family 1 が Family 2 よりも少し多いと いう結果であり、大きな変化を認めなか った。また、clade 1 が最も多いという ことは、先行研究及びこれまでの解析結 果と一致した所見であるが、これまでの 結果と比べて、clade 1 の占める割合が 低下していた。
小児での PCV13 定期接種導入に伴い、
成人の侵襲性肺炎球菌症例においても PCV13 に含まれない非 PCV13 血清型が割 合の増加を認め、血清型置換がおきてい
表 2. 成人
IPD
由来菌株のPspA Familyの内訳表 2．成人 IPD 由来菌株の PspA Family の内訳
PspA clade 毎の割合は、clade 1 が 39.6%
で最も多く、clade 3 が 27.2%、clade 2 が 17.9%、clade 4 が 14.1%、clade 5 が 1.0%、clade 6 が 0.2%であった（表 3） 。 先 行 研 究 及 び 私 達 の こ れ ま で の PspA clade 分布の解析において、clade 1 が 最も多いことが報告されていたが、2015 年またはそれ以前の菌株の解析結果と 比較して、clade 1 の割合が低下してい た。
表 3．成人 IPD 由来菌株の PspA clade の内訳
また、PspA clade1-4 の合計は 98.8%
であり（表 4） 、成人 IPD 由来菌株のほと んどが clade 1-4 に分類されるという特 徴があることが明らかになった。
表 4．成人 IPD 由来菌株の PspA clade 分布の 特徴
D. 考察
今年度は、2017 年 1 月から 12 月に成 人 IPD 症例から分離された 412 株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。その結果、
family 1 が 57.5%、family 2 が 42.3%、
family 3 が 0.2%であった（表 2） 。海外 の報告では、Family 1 と Family 2 の比 率は、半々であるという報告、Family 1 の方が多い、または Family 2 が多いと いう報告があるが、何れの報告も極端な 違いはない。これまでの私達の解析でも、
Family 1 が Family 2 よりも少し多いと いう結果であり、大きな変化を認めなか った。また、clade 1 が最も多いという ことは、先行研究及びこれまでの解析結 果と一致した所見であるが、これまでの 結果と比べて、clade 1 の占める割合が 低下していた。
小児での PCV13 定期接種導入に伴い、
成人の侵襲性肺炎球菌症例においても PCV13 に含まれない非 PCV13 血清型が割 合の増加を認め、血清型置換がおきてい
表 3. 成人
IPD由来菌株のPspA clade
の内訳表 2．成人 IPD 由来菌株の PspA Family の内訳
PspA clade 毎の割合は、clade 1 が 39.6%
で最も多く、clade 3 が 27.2%、clade 2 が 17.9%、clade 4 が 14.1%、clade 5 が 1.0%、clade 6 が 0.2%であった（表 3）。 先 行 研 究 及 び 私 達 の こ れ ま で の PspA clade 分布の解析において、clade 1 が 最も多いことが報告されていたが、2015 年またはそれ以前の菌株の解析結果と 比較して、clade 1 の割合が低下してい た。
表 3．成人 IPD 由来菌株の PspA clade の内訳
また、PspA clade1-4 の合計は 98.8%
であり（表 4）、成人 IPD 由来菌株のほと んどが clade 1-4 に分類されるという特 徴があることが明らかになった。
表 4．成人 IPD 由来菌株の PspA clade 分布の 特徴
D. 考察
今年度は、2017 年 1 月から 12 月に成 人 IPD 症例から分離された 412 株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。その結果、
family 1 が 57.5%、family 2 が 42.3%、
family 3 が 0.2%であった（表 2）。海外 の報告では、Family 1 と Family 2 の比 率は、半々であるという報告、Family 1 の方が多い、または Family 2 が多いと いう報告があるが、何れの報告も極端な 違いはない。これまでの私達の解析でも、
Family 1 が Family 2 よりも少し多いと いう結果であり、大きな変化を認めなか った。また、clade 1 が最も多いという ことは、先行研究及びこれまでの解析結 果と一致した所見であるが、これまでの 結果と比べて、clade 1 の占める割合が 低下していた。
小児での PCV13 定期接種導入に伴い、
成人の侵襲性肺炎球菌症例においても PCV13 に含まれない非 PCV13 血清型が割 合の増加を認め、血清型置換がおきてい
表 4. 成人IPD由来菌株のPspA clade分布の特徴
clade 5、Family 3 は clade 6 に分類さ れる。IPD 症例から分離された菌株の細 菌学的特徴を把握するうえで、血清型や PspA の分布を解析することは重要であ る。本分担研究では、侵襲性肺炎球菌感 染症例から分離した菌株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。
Ｂ．研究方法
1）肺炎球菌株：
2017 年 1 月から 12 月の間に、北海道、
山形、宮城、新潟、三重、奈良、高知、
福岡、鹿児島、沖縄の 10 道県にて、IPD 症例の血液、髄液または他の組織から分 離された 412 株の肺炎球菌株を用いた。
2）肺炎球菌ゲノム DNA の精製：
HighPure PCR Product Purification Kit を用いて、血液寒天培地にて 37ºC、5% CO
2下 で 一 晩 培 養 し た 肺 炎 球 菌 の ゲ ノ ム DNA を精製した。
3）PspA 遺伝子の PCR とシークエンス解 析：
PspA 遺伝子を増幅させるために、各臨床 分離肺炎球菌株のゲノム DNA をテンプレ ートとして、LSM12 プライマーと SKH2 プ ライマー（表 1 参照）、Quick TaqTM HS DyeMix を用いて PCR を行った。PCR は、
初回サイクル 94℃、2 分、その後、94℃、
30 秒、55℃、30 秒、68℃、1 分を 30 サ イクル、その後、68℃、5 分で行った。
電気泳動にて PCR 産物を確認後、 精製し、
SKH2 プライマーを用いて、PspA 遺伝子 シークエンス解析を行った。
表 1．PspA の PCR で使用したプライマー
4）PspA clade 判定：
PspA 蛋白のプロリンリッチ領域の上流 約 400bp の塩基配列（clade 同定領域、
図 1 参照）を family, clade が同定され ている参照株の PspA 塩基配列と比較し、
同定を行った。
図 1．PspA 蛋白の模式図
PspA 蛋白の構造と clade 同定領域の模式図を 示した。
（倫理面への配慮）
国立感染症研究所医学研究倫理審査委 員会からの承認を得ている。
C. 研究結果
成人 IPD 症例から分離した 412 株の PspA 蛋白の clade 解析を行った。PspA Family の割合は、family 1 が 57.5%、
family 2 が 42.3%、family 3 が 0.2%で あった（表 2）。Family の割合は、以前 と比較して大きな違いはなかった。
図 1. PspA蛋白の模式図
- 63 - 侵襲性肺炎球菌症例においても PCV13に含まれ ない非 PCV13血清型が割合の増加を認め、血清 型置換が起きている。今回の解析にて、血清型の みならず、PspA clade 分布も変化がおきている ことが示唆された。
PspAは新規ワクチンの抗原として有望である。
本研究にて、PspA の 6 つの clade の中で、clade 1-4が98.8%を占めることが明らかになった。この 結果は、PspA ワクチンの開発において、clade 1-4をカバーすることで、大部分の肺炎球菌に有 効なワクチンになることが期待されることを示 唆している。そのため、将来のワクチン行政に有 用な資料となるものと考えられる。
E. 結論
本研究では、2017年に成人IPD症例から分離さ れた412株を用いて、PspA 蛋白の clade 解析を 行った。PspA clade毎の割合は、clade 1が39.6%
で 最 も 多 く、clade 3が27.2%、clade 2が17.9%、
clade 4が14.1%、clade 5が1.0%、clade 6が0.2%
であった。Clade 1が最も多いということは、先 行研究及びこれまでの解析結果と一致した所見 であるが、これまでの結果と比べて、clade 1の 割合が低くなっていた。小児での PCV 定期接種 導入に伴い、成人の侵襲性肺炎球菌症例において 血清型置換のみならず、PspA clade にも大きな 変化がおきていることが示唆され、今後も推移を 注視する必要がある。
PspAは新規肺炎球菌ワクチンの有望な抗原で
ある。本研究にて、PspAの 6 つのcladeの中で、
clade 1-4が98.8% を占めていることが明らかに なった。この結果は、PspAワクチンの開発にお いて、clade 1-4をカバーすることで、大部分の肺 炎球菌に有効なワクチンになることが期待され ることを示唆している。
F. 研究発表 1. 論文発表
1） Kinjo Y, Takatsuka S, Kitano N, Kawakubo S, Abe M, Ueno K, Miyazaki Y. Functions of CD1d-restricted invariant natural killer T cells in antimicrobial immunity and potential applications for infection control. Front Immunol, 9: 1266, 2018.
2） Ueno K, Urai M, Izawa K, Otani Y, Yanagihara N, Kataoka M, Takatsuka S, Abe M, Hasegawa H, Shimizu K, Kitamura T, Kitaura J, Miyazaki Y, Kinjo Y. Mouse LIMR3/CD300f is a negative regulator of the antimicrobial activity of neutrophils. Sci Rep, 8: 17406, 2018.
2. 学会発表
なし
G. 知的所有権の取得状況
