Expression of cell competition markers at the interface between p53 signature and normal epithelium in the human fallopian tube

氏 名 ・（本籍） 木藤 正彦（秋田県）

専 攻 分 野 の 名 称 博士（医学）

学 位 記 番 号 医博甲第 918 号 学 位 授 与 の 日 付 平成 28 年 9 月 27 日

学 位 授 与 の 要 件 学位規則第 4 条第 1 項該当 研 究 科 ・ 専 攻 医学系研究科医学専攻

学 位 論 文 題 名 Expression of cell competition markers at the interface between p53 signature and normal epithelium in the human fallopian tube (p53 signature とヒト正常卵管上皮細胞の境界面における

細胞競合マーカーの発現）

論 文 審 査 委 員 （主査） 教授 柴田 浩行

（副査） 教授 大森 泰文 教授 本山 悟

Akita University

学 位 論 文 内 容 要 旨

論 文 題 目 ：

Expression of cell competition markers at the interface between p53 signature and normal epithelium in the human fallopian tube

（ 論 文 題 目 の 和 訳 ）：p53 signature と ヒ ト 正 常 卵 管 上 皮 細 胞 と の 境 界 面 に お け る 細 胞 競 合 マ ー カ ー の 発 現

申 請 者 氏 名 木 藤 正 彦

研 究 目 的

1970 年 代 に シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ を 用 い た 実 験 に よ り 、 変 異 細 胞 と 隣 接 す る 正 常 上 皮 細 胞 が 互 い の 生 存 競 争 の た め に 競 合 し あ う 現 象 が 観 察 さ れ る こ と が 報 告 さ れ 、 こ れ は 細 胞 競 合 (現 象 )と 呼 ば れ て お り 、 現 在 、 様 々 な 分 子 生 物 学 的 手 法 に よ り こ の 現 象 の 検 証 が な さ れ て い る 。 近 年 で は 上 皮 に お け る 発 癌 の 超 早 期 段 階 に こ の 概 念 が 導 入 さ れ 、 周 囲 正 常 細 胞 が 癌 細 胞 を 排 除 す る よ う な 細 胞 競 合 現 象 を 癌 抑 制 機 能 と し て 捉 え ら れ 、2010 年 に は Ras 変 異 細 胞 や Src 変 異 細 胞 を 用 い た 検 証 に よ り 、 周 囲 正 常 細 胞 の 変 異 細 胞 側 に お け る ビ メ ン チ ン や フ ィ ラ ミ ン の 発 現 亢 進 が 報 告 さ れ て い る 。 こ れ ら の 報 告 は 癌 研 究 に と っ て 新 た な 視 点 を 与 え る 有 用 な も の で あ る と 考 え ら れ る が 、 ヒ ト の 組 織 内 で 実 際 に 観 察 さ れ る 現 象 で あ る か の 検 証 は い ま だ な さ れ て い な い 。

我 々 は こ れ ら の 細 胞 競 合 マ ー カ ー と す べ き ビ メ ン チ ン や フ ィ ラ ミ ン A の 発 現 亢 進 が ヒ ト の 組 織 内 で 実 際 に 観 察 さ れ る か ど う か の 検 証 を 目 的 と し て 、 卵 巣 漿 液 性 腺 癌 の 前 駆 病 変 と 推 測 さ れ て い る 、 ヒ ト 卵 管 上 皮 に 観 察 さ れ る p53 signature や 卵 管 漿 液 性 上 皮 内 病 変 (STIL)に 注 目 し た 。p53 signature は 異 型 を 示 さ な い 卵 管 上 皮 細 胞 と し て 観 察 さ れ る 、12 個 以 上 の p53 変 異 細 胞 列 と 定 義 さ れ 、STIL は こ れ よ り 腫 瘍 に 近 い p53 陽 性 上 皮 内 病 変 と さ れ て い る 。 こ れ ら は 免 疫 組 織 学 的 に 同 定 可 能 で あ り 、 ま た 発 癌 の 超 早 期 段 階 モ デ ル と 考 え う る た め 、 こ れ ら の 卵 管 病 変 を 用 い て 細 胞 競 合 現 象 の 検 証 を 行 っ た 。

研 究 方 法

2014 年 か ら 2015 年 の 間 に 本 学 附 属 病 院 産 婦 人 科 に て 婦 人 科 疾 患 の た め 卵 管 を 含 ん だ 組 織 摘 出 術 が 施 行 さ れ た 約 100 症 例 に 対 し て 、 卵 管 全 割 全 包 埋 に 準 じ て 切 出 を 行 い 、 既 報 の 卵 管 早 期 病 変 の 診 断 ア ル ゴ リ ズ ム に 従 っ て HE 染 色 や p53、 Ki-67 な ど の 免 疫 組 織 化 学 染 色 を 施 行 し た 。 そ の 過 程 で 同 定 さ れ た 17 ヶ 所 の p53 signature、4 ヶ 所 の STIL を 対 象 に 細 胞 競 合 マ ー カ ー 発 現 の 検 討 を 行 っ た 。具 体 的 に は ビ メ ン チ ン 、 フ ィ ラ ミ ン の 免 疫 組 織 化 学 を 施 行 し た 。 ま た 、 2014 年 に 卵 管 発

癌 モ デ ル マ ウ ス (mogp-Tag mouse)が 報 告 さ れ て お り 、 こ の マ ウ ス の 卵 管 早 期 病 変 に 対 す る 検 討 も お こ な っ て い る 。

細 胞 競 合 マ ー カ ー の 発 現 を 観 察 す る た め 、 各 々 の ヒ ト 卵 管 早 期 病 変 に 対 し 、 免 疫 組 織 学 的 蛍 光 二 重 染 色 を 施 行 し た 。 観 察 は 共 焦 点 顕 微 鏡 を 使 用 し 、 得 ら れ た 各 画 像 の 細 胞 接 合 面 に お け る 細 胞 競 合 マ ー カ ー の 最 高 発 現 強 度 を 測 定 し た 。 測 定 の 対 象 は 、p53 変 異 細 胞 と 非 変 異 細 胞 間 、ま た 背 景 に 観 察 さ れ る 非 変 異 細 胞 同 士 の 接 合 面 と し 、 背 景 に お け る マ ー カ ー の 発 現 強 度 の 平 均 値 か ら 、 細 胞 競 合 面 と す べ き 細 胞 接 合 面 の 発 現 強 度 を 相 対 的 に 算 出 し た 。 次 に 、 各 画 像 か ら 得 ら れ た マ ー カ ー の 相 対 的 な 発 現 強 度 を 統 計 的 に 解 析 し た 。

研 究 成 績

免 疫 組 織 学 的 に 、 各 卵 管 早 期 病 変 を 含 ん だ 上 皮 細 胞 に お い て 、 ビ メ ン チ ン の 発 現 は 観 察 さ れ た が 、フ ィ ラ ミ ン の 発 現 は ほ ぼ 観 察 さ れ な か っ た た め 、 p53、ビ メ ン チ ン を 蛍 光 二 重 染 色 の 対 象 と し た 。

p53 signature に お い て 明 瞭 に 観 察 さ れ た 非 変 異 細 胞 と の 接 合 面 は 48 個 、 STIL の 接 合 面 は 8 個 あ っ た 。 得 ら れ た 各 画 像 に お け る 、 背 景 の 非 変 異 上 皮 細 胞 間 の 平 均 個 数 は p53 signature で は 26.0 個 、 STIL で は 20.2 個 で あ っ た 。 各 接 合 面 と 、 そ の 背 景 に み ら れ る 非 変 異 細 胞 間 の 接 合 面 に お け る ビ メ ン チ ン 強 度 を 測 定 し 統 計 処 理 、p53 signature に お け る 非 変 異 細 胞 と の 接 合 面 で の 相 対 的 な ビ メ ン チ ン 発 現 強 度 は 1.076 (95% 信 頼 区 間 0.9412-1.211) 、 STIL で は 0.9790(95% 信 頼 区 間 0.7206-1.237)で あ っ た 。

mogp-Tag マ ウ ス の 卵 管 病 変 に つ い て は 、 p53 変 異 細 胞 に お い て Ki-67 の 発 現 上 昇 が 観 察 さ れ 、ヒ ト に お け る STIL 相 当 の 病 変 と 考 え ら れ た 。ビ メ ン チ ン 、フ ィ ラ ミ ン の 発 現 に つ い て も 観 察 し た が 、卵 管 上 皮 組 織 に お け る 発 現 は 部 分 的 で あ っ た 。

結 論

本 研 究 で は 卵 巣 癌 に お け る 前 駆 病 変 と さ れ る p53 signature や STIL を 対 象 と し て 、p53 異 常 を 示 す 病 変 部 の 細 胞 と 正 常 細 胞 と の 境 界 部 に お け る 細 胞 競 合 マ ー カ ー の 発 現 を 検 討 し た が 、 背 景 の 正 常 卵 管 上 皮 細 胞 間 の 発 現 と 比 較 し て 有 意 な 強 度 の 上 昇 は 見 ら れ な か っ た 。 す な わ ち 、 ヒ ト 病 理 組 織 検 体 に お い て 細 胞 競 合 現 象 の 実 証 が で き な か っ た 。 し か し 、 こ れ は 対 象 と し た 病 変 が p53 異 常 を 示 す 病 変 で あ っ て 、 既 報 に あ る よ う な Src 異 常 病 変 や Ras 異 常 病 変 で は な か っ た た め か も し れ な い 。 ま た 、 ホ ル マ リ ン 固 定 に よ る 影 響 で 、 生 体 内 で 起 き て い る 細 胞 競 合 現 象 を 再 現 で き な か っ た 可 能 性 も あ る 。

Akita University

学 位 （ 博 士 — 甲 ） 論 文 審 査 結 果 の 要 旨

主 査：柴田浩行 申請者：木藤正彦

論文題名：

Expression of cell competition markers at the interface between p53

signature and normal epithelium in the human fallopian tube

p53 signature

要旨

近年、変異細胞と正常上皮細胞とが生存競争を行う「細胞競合現象」は発癌の超早期 にも見られ、癌細胞を生体から排除する癌抑制機能であると理解されている。

In vitro

Ras

Src

特にビメンチンの発現誘導は、この「細胞競合現象」に必須であるとされている。本研 究では「細胞競合現象」がヒトの臨床的な腫瘍においても起きているかを確認する目的 で手術的に切除された卵管を用いてビメンチンによる「細胞競合現象」を分子病理学的 に解析した。

秋田大学婦人科において手術により卵菅を含む組織摘出を受けた

100

12

p53

p53 signature

STIL

100

17

p53 signature

STIL

この

p53 signature

STIL

フィラミンの発現を調査した。臨床検体ではフィラミンの発現は観察されなかったが、

ビメンチンの発現が確認された。

p53 signature

1.07

95%

: 0.9412 - 1.211

STIL

0.979

95%

信頼区間

: 0.7206 - 1.237

STIL

p53 signature

STIL

1)

ショウジョウバエや

in vitro

2)

本研究は卵管癌の極早期における「細胞競合」をビメンチンの発現から解析しようと 試みた。結果はネガティブであったが、卵管癌の極早期における「細胞競合」はビメン チン非依存性である可能性が示唆された。また、

p53 signature

3)

本研究では各種抗体を用いた免疫組織化学で多数の臨床検体を解析している。また、

卵管癌マウスモデルを用いた実験、データの統計学的処理などは正確に行われたと評価 される。また、臨床検体の解析はガイドラインや倫理指針に則って実施された。

4)

本論文「

Expression of cell competition markers at the interface between p53 signature and normal epithelium in the human fallopian tube

また結果解釈の誇張はなく、データに沿って明瞭に記載されている。本論文は

PlosONE

以上の観点から、本論文は学位を授与するに十分な条件を備えているものと判定された。

Akita University