Title
The effect of p53 gene expression on the inhibition of cell
proliferation by paclitaxel( 内容の要旨(Summary) )
Author(s)
坂下, 文夫
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）乙 第1434号
Issue Date
2008-11-19
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/25311
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氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目 坂 下 文 夫 (岐阜県) 博 士(医学) 乙第 1434 号 平成 20 年11月 19 日 学位規則第4条第2項該当
The effect of p53 gene expression on theinhibition of celI
PrOliferation by pacIitaxel 審査委員 (主査)教授 森 脇 久
怪
(副査)教授 原 明 教授 伊 藤 善 規 論文内容の要旨 【緒言】 胃癌による本邦年間死亡数は約5万人にのぼり,悪性腫瘍の中で2番目に多いという現状ではあ るが,新規抗癌剤の登場により再発･切除不能胃癌の治療成績は徐々に向上してきている｡特に Paclitaxel(PTX)は胃癌の再発形式の中で半数以上を占めるとされる腹膜播種に対する効果が期待 されている薬剤である｡ 今回PTXに関する基礎研究として,p53発現状態の相違にもとづく培養胃癌細胞に対するアポト ーシス誘導機序に注目し検討を行った｡ 【方法と研究機材】 1.細胞株と培養環境 1)細胞株:ヒト胃癌細胞株MKN45(p53野生株),MKN28(p53変異株)を使用｡ 2)培養環境:10%FBS+RPMI1640培地にて37℃,5%CO2+95%air下で培養｡ 2.MTT assay:各濃度(0.001-1JJM)PTX添加後,24時間から72時間でMTT溶液と反応させ540nM の波長で吸光度を測定｡PTX O〃M(コントロール)の吸光度からの比率を解析する｡3.Apoptosis assay:Chamber slideで培養後にPTXを24時間接触し,Hoechst33342で染色,蛍
光顕微鏡で観察｡ 4.Flowcytometry:PTX添加24時間後に70%エタノールで固定し,RNaseと反応,PropidiumIodide で染色後にFlow cytometerで細胞周期分布を算出する｡ 5.Westernblotting:PTX添加･反応後にRIPAbufferで溶解,電気泳動後にニトロセルロース膜 にtransfer｡次いで一次抗体(caspaseT3,CyClin Bl,CyClin Dl),二次抗体の順に反応｡ 【結果】 1.MTT assay:PTXにより両細胞とも濃度,時間依存性に細胞増殖が抑制されたが,MKN28に一層 強い抗腫瘍効果がみられた｡ 2.Apoptosis assay:PTXにより核の断片化,染色体凝集,apOptOSis小体の出現が確認され apoptosisの形態的な観察が可能であった｡ 3.Flowcytometry:PTXによる細胞周期分布への影響では,MKN45ではsub-Gl期の割合が増加し, MKN28ではG2川期の増加が顕著であり,両群間に明らかな相違が確認された｡ 4.Western blotting:MKN45ではPTXによるcaspase-3の活性化がみられた一方,MKN28では
ー73-cyclin Blの発現が増強した｡p53inhibitor(pifithrin-α)の添加により,MKN45における caspase-3の発現抑制が確認された｡ 【考察】 p53は本来癌抑制遺伝子であり,細胞周期制御,アポトーシス制御,DNA修復,血管新生抑制によ って癌化を抑制しているが,癌腫によっては50%以上でその変異が存在する｡今回の実験ではp53 野生型のMKN45とp53変異型のMKN28を使用し,新規抗癌剤であるPTXによる抗腫瘍効果,さらに はアポトーシス誘導機序発現の相違について検討した｡ PTXは微小管脱重合を阻害することによって細胞周期をGl期あるいはG2/M期で停止させアポト ーシスを引き起こすことが知られている｡さらに,PTXによるアポトーシスの経路にはp53が関与 する経路と関与しない経路の両者が存在する｡今回の実験で,PTXはp53のstatusに関係なく胃癌 細胞の増殖を抑制したが,p53変異株の方がより強い抗腫瘍効果を示した｡ PTXは低濃度ではRaf-1が関与しないシグナル伝達によって異常な核分裂を引き起こし,高濃度 ではRaト1が関与するシグナル伝達によってG2川での細胞周期停止を引き起こし細胞死に至らせる と言われている｡今回,低濃度のPTXではp53のstatusに関わらずsub-Gl期の割合が増えた｡一 方,p53変異株では高濃度のPTXによってG2/M期の割合が増加した｡従って,p53変異株における 細胞周期停止からアポトーシスへの経路にはRaf-1が関与していると推察される｡ MKN28ではPTXによってcyclin Blの発現が増強した｡CyClin Blは細胞周期G2/M期を調節する 蛋白で,この蛋白の蓄積は細胞周期G2/M期でのブロックを意味する｡一方,MKN45ではPTXによる caspase-3の活性化がみられ,これはp53inhibitor(pifithrin-α)の添加によって抑制された｡よ って,p53野生株胃癌細胞MKN45のPTXによるアポトーシスにはcaspase-3が関与し,p53変異株胃 癌細胞MKN28のPTXによるアポトーシスにはRaf-1が関与していることが示唆される｡ 【結論】 paclitaxelによるアポトーシス誘導経路はp53のstatusによって異なっている｡p53変異型であり 細胞周期G2/M期で制御される癌腫,すなわちcyclin Blの発現が高い癌腫に対してpaclitaxelは より強い抗腫瘍効果を発揮するのではないかと推察する｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 坂下文夫は,ヒト胃癌細胞株を用いて,paClitaxelによるアポトーシス誘導経路がp53 のstatusによって異なっていることを明らかにし,さらに,p53変異株であり細胞周期G2/M期で 制御される癌腫,すなわちcyclinBlの発現が高い癌腫に対してpaclitaxelがより強い抗腫瘍効果 を発揮する可能性を示唆した｡以上により本研究は,腫瘍外科学ならびに,胃癌化学療法の発展に 少なからず寄与するものと考えられる｡ [主論文公表誌]
Fumio Sakashita,ShinjiOsada,Masao Takemura,HisashiImai,HiroyukiTomita,Kenichi
Nonaka,･Takao Takahashi,Mitsuru Seishima:The effect of p53 gene expression on the inhibition of cellproliferation by paclitaxel
Cancer Chemother Pharmaco162,379-385(2008).
