博 士 （ 歯 学 ） 亀 山 武 志
学 位 論 文 題 名
チロシ ンホス ファター ゼ PRL ― 3 による p53 の転写活 性制御
学位 論文内容の要旨
癌抑制 遺伝子 産物で あるp53は転写因子として機能し，標的遺伝子のプ□モーター領域に存在するp53結合配 列に結 合する ことで ，150種類 以上の 遺伝子 の発現 を制御 してい ることが 報告されている，通常p53は，MDM2 依存的にユビキチン化を受け，プ□テアソ―ム系により分解されることで発現レ′qレは低く維持されている，しか しp53はDNA損傷を はじめ とする様々なストレスに応答して安定化‑ iS'tf匕されて核内に蓄積し標的遺伝子の 発現を介して細胞周期の停止，DNA修復，アポト―シス，ならびに細胞老化を弓Iき起こし，細胞の癌化を抑制し ている と考えられている，一方，ほとんどの癌でp53遺伝子は変異が認められており，癌患者の生命予後の悪化 と相関 してい ること が多数 報告さ れてい る，p53遺 伝子の 変異は ，主にDNA結合領域を含むコアドメインに認 められており，多くの場合一塩基変異である．このことは発癌抑制の経路において転写因子としてのp53ガ渋ロ何 に重要 であるかが示唆される，p53の転写調節を介した発癌抑制のメカニズムとその破綻としての発癌メカニズ ムの詳 細を知るために，p53を中心とした蛋白質問相互作用ネットワ―クの全容を明らかにすることが必須であ るカ沫 だ不明 な点も 数多い ，本研究では，p53依存的な転写機構の更なる解明を目的に，p53結合タンパク質の 探 索 を 行 い ， 新 規 因 子 と し てprotein phosphatase of regenerating liver‑3 (PRL‑3)を 同定 し た ， PRL‑3（ 遺 伝 子 名PTP4A3)はprotein tyrosine phosphatases (PTP)ス ー パ ーフ ァ ミ リ ―に 属 す るPRL fa milyの1つである，PRL family蛋白質は，二重特異陸ホスフんターゼ機能（セリン・スレオニンおよびチ口シ ンの脱リン酉劉匕を触媒する）に関与するC(X)sR active site motif (PTPドメイン）を蛋白中央部に持ち，C末端 には翻訳後修飾としてフんルネシル化修飾（プレニル基やグラニルグラニル基とチフに匸ーテル結合する）を受け るCAAX boxが 存在す る．― 般的にPRLは細胞 膜のり ン脂質と相互作用するファルネシル化修飾を受けるため膜 上に存 在する と考え られて いるが，PTPドメインとCAAX boxの間には塩基I生アミノ酸がニつの領域に分かれて い るbipartite型 核 局 在 化 シ グ ナ ル(NLS)が 存 在 し て お り ， 核 内 に 局 在 す る と い う 報 告 も あ る ， PRL‑3は，大腸癌，乳癌，肺癌ならびに胃癌において発現の上昇が報告されている．特に，転移1り弸昜癌にお いては非転移t生大腸癌と比較してその発現が著しく上昇していることやその発現の上昇により癌細胞の運動｜陸や 浸潤能が亢進することが知られており，癌の恩陸化因子であることが示唆されてきた．しかし一方で，マウスの系 ではマ イク□ アレイ 法によ りp53．の標的遺伝子としてPrト3が同定され，p53依存的に誘導されたマウスPRL‑3
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は細胞周期の停止を誘導 することが示さ；hているこ とから，現在癌化あるいは癌の悪性化におけるPRL‑3の役割 は明確ではない．
本研究では，p53の新 ま聯畠合蛋白としてのPRLー3に注目し，p53との関係を明らかにすることを目的とした．
は じめ に， 内 在性p53が欠 損し てい るヒ ト 肺癌 細胞 株H1299を用 いて ，p53お よ びPRL‑3を過剰発現させた 後， 免疫 沈降 実 験を 行っ た．PRL‑3は 野生 型p53お よ びp53 R248Q変異体と細胞内で 結合することを確認した が ， 同‑ familyに 属 す るPRL‑1お よ びPRL‑2の結 合は 確認 でき な かっ た， またPRL‑3は 野生 型p53の み なら ずp53 R248Q変異 体に も 結合 する こと を確 認 した ，次 に，PRL‑3とp53の細 胞内 局 在を 調べる目的で，H1299 細胞にPRL‑3およびp53を 遺伝子導入した後，螢光抗 体法による免疫染色を施し， 共焦点レ―ザ一顕微鏡にて観 察した，PRL‑3は細胞膜 周辺と核において染色が認め られた．またp53は主に核に おいて染色され，核に局在す る―部のPRL‑3とp53は共局在することが分かった，
次 にPRL‑3はp53の 転写 活性 を 制御 しているという仮 説を立て，PRL‑3がp53の転写 活性に与える影響をルシ フェ ラー ゼア ッ セイ によ り解 析 した ，H1299，ヒ ト肺 癌細 胞 株A549ならびにヒト骨 肉腫細胞株U20S細胞にお いて，p53結合配列を15回夕ンデムにつないだレポ― 夕ーベクターを用いた解析 から，p53単独発現と比較して PRL−3とp53の共 発現 に よル レポ ―夕 ―活 性 は増 強し た， ま たH1299およびA549細 胞において，p21Waf1およ びMDM2遺 伝子 の プ□ モー 夕― 配 列を 有するレポ―夕一 ベクターを用いてルシフウラ ―ゼアッセイを行った，
p53単独 発現 と比較してPRL‑3とp53の共発現によりそゎ ぞゎのレポー夕―活性は増強 するという結果を得た，
そ し て，H1299細 胞を 用 いてp53標 的 遺伝 子の 発現 の 変化 をRT‑PCR法に よ り解 析し た．p53単独 発現 と 比較 してp53およ びPRL‑3の共 発現 に より ，p53の 標的 遺伝 子で あ るp21WaflのmRNAの発 現量 が顕著に増加した，
し か し な が らp53標 的 遺 伝 子 で あ るp53RFP，p53R2な ら びにBAXのmRNAの 発現 量 に大 きな 差は なか っ た，
発現量の増加が見られたp21Waf1についてウェスタン・ブ□ット角翠析を行ったところ，p53単独発現．と比較して p53およびPRL‑3の共発現により，，約1.5倍の発現の上昇が認められた，
PRL‑3によるp53の転写 活性の増強作用には，PRL‑3のホスファターゼ活l生が寄 与しているのではないかと考 え ，PRL‑3の ホ ス フ ァ タ ― ゼ 欠 損 変 異 体2種(D72Aお よ びC104A PRL‑3)を 作 製 し ，H1299細胞 を用 い てル シフ ウラ ―ゼ アッセイを行 った．p53依存的転写i刮生の 上昇には，野生型PRL‑3と2種の変異型PRL‑3に大きな 差は認められなかった， つまり，p53の転写活I生.の 増強作用には，PRL‑3のホスフんターゼifl!は必要ではない ことが示唆された．．
以上の結果から，PRL‑3はp53と核内で結合し，ホ スファターゼ活I生非依存的 にp53の転写活性を亢進させる ことが示唆された，さら なる研究によりPRL‑3がp53の転写活性を増強するより詳 細なメカニズムを明らかにし ていきたい．これらを解 析することは，p53による遺 伝子の発現調節機構が更に明らかになるだけでなく，発癌 や癌の悪｜噌三イ匕におけるPRL‑3の役割について理解が深まり，癌の診断・治療に応用できる知見が得られることが 期待される．
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査 教授 井上農夫男 副査 教授 進藤正信 副査 教授 鈴木邦明
副査 教授 守内哲也（医学研究科）
学 位 論 文 題 名
チ ロ シ ン ホ ス フ ァ タ ー ゼ PRL ― 3 に よ る p53 の 転 写 活 性 制 御
審 査 は， 審 査 担当 者 全 員の 出 席 の下 に 行わ れた． 最初に申 請者よ り提出論 文の概要 が説 明 さ れ ， その 後 ， 申請 者 に 対し 提 出 論文 と それに 関連した 学科目に っいて 口頭試問 が行わ れ た ． 以 下に ， 論 文の 要 旨 と審 査 の 内容 を 述 べる ．
【論 文の要旨 】
本 研 究 の 目 的 は ， p53 結 合 タ ン パ ク 質 の 新 規 結 合 因 子 と し て protein phosphatase of regenerating liver ー 3(PRL 一 3 ）を同定 し，p53 依存的 な転写瀞 陸に対 するPRL 一3 の効果を 解析 すること である ．
癌抑 制 遺 伝子 産 物 であ る p53 は 転 写因 子 で あり ， 標 的 遺伝 子 の 発現 を 介 して 細 胞周期の 停 止 ， DNA 修復 ， ア ポト ー シ ス， た ら ぴに 細 胞 老化 を 誘 導 する ． ヒ ト癌 で p53 遺 伝子は 50%
以 上 の変 異 が 認め ら れ てお り，そ の変異 はp53 の 転写因 子として の機能の 喪失を もたらす ． p53 に よ り 制御 さ れ る遺 伝 子 発現 は 癌 抑制 の 経 路に お い て 中心 的 な 役割 を 担 って おり， そ の 分 子レ ベ ル での 理 解 は発 癌メカ ニズム を理解す る上で 重要であ る．一方 ， PRL‑3 （遺伝子 名 PTP4A3) は，大 腸癌， 乳癌，肺 癌なら ぴに胃癌 におい て発現が り畢する こと， またむぬ tro に お いて PRL − 3 の 発現 の 上 昇に よ り 癌細 胞 の 運動 陸 や浸 潤能が亢 進する ことが報 告され，
近 年 癌の 悪 性 化因 子 で ある こ と が示 唆 さ れて い る ．し かした がら癌化 あるい は癌の悪 性化 にお ける PRL 一 3 の 役割は 未だ不明 な点が 多い．
本研 究 で は， PRL‑3 は p53 と 結合 し 、 p53 の 転 写活 性 を 増強 す る とい う 仮 説の も とに解 析 を行 った．
はじ め に ，免 疫 沈 降法 を 用いて， p53 韜 よぴPRL 一3 の結合性 を調べた ．その 結果， PRL − 3 は 野 生 型 p53 お よ ぴ p53 R248Q 変 異 体 と 細 胞 内 で 結 合 す るこ と を 確認 し た ．PRL‑3 と 同 一
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family に属するPRL‑1 およびPRL‑2 と，p53 との結合は確認できなかった．また，共焦点 レーザー顕微鏡を用いた観察から，PRL 一3 とp53 は核において共局在していることが判明 した．
次に，PRL‑3 がp53 の転写瀞陸に影響を与えるのではという仮説のもと，p53 結合配列が タンデムに15 回繰り返されているレポこターベクターを用いてルシフェラーゼァッセイ を 行っ た．その結果，p53 単独発現と比較してPRL 一3 とp53 の両者の過乗嶢規によりp53 の転写活性が増強するという結果を得た．そしてp21Wan およぴMDM2 レポーターを用いた 実験でも，同様にPRL 一3 とp53 の共発現によりp53 の転写ギ音陸の増強が観察された．また，
p53 標的遺伝子の発現をRT‑PCR 解析およびウェスタンゝブロット法を用いて調べたところ，
PRL 一3 とp53 の共発現により， p21Wafl のmRNA およぴ蛋白の発現量が顕著に増加することが 分かった．
さらにPRL −3 のホスファターゼ活J 陸が p53 の転写活陸の増強を引き起こしているのでは という仮説のもと，PRL‑3 のホスファターゼ活性欠損変異体をf 乍製し，ルシフェラーゼア ッセイを用いて調べた．その結果，PRL ー3 とp53 の両者の過乗嶢現系において，野生型PRL −3 と同様に変異型 PRL 一3 もp53 依存的な転写潛陸を増強さ世た．
以上の結果より本研究では， p53 新規結合蛋白としてPRL 一3 を同定し，PRL 一3 はp53 と核 内で結合すること，ホスファターゼ活´陞夢E 依存的にp53 の転写活性を亢進させることが示 唆された．今後，PRL‑3 がp53 の転写活陸を増強するメカニズムをより詳細に解析するこ とにより，p53 による遺伝子の発現調節機構が更に明らかになるだけでなく，発癌や癌の 悪陞f 匕におけるPRL −3 の役割にっいて理解が深まり，癌の診断・治療に応用できる知見が 得られると考えられる．
【審査の内容】
以上，論文について概要が説明された後，各審査員より，本研究の背景，方法，結果，
考察およぴ関連の研究にっいて質問がなされた．主な質問事項は，◎PRL family のドメ イン構造・機能にっいて，◎PRL‑3 とp53 の結合部位，またその結合する生物学的意義に っいて，◎p53 変異体との結合，局在たらびに生物学的意義にっいて，＠PRL 一3 の局在につ いて，◎PRL‑ −3 の変異体について，ぬどであった．論文提出者はいずれの質問に対しても 明 確 か つ 的 確 に回 答し ，き らに 今後 の研 究に つい ても発 展的 な将 来展 望を 示し た．
試問の結果，本論文はp53 新規結合蛋白として PRL −3 を同定し，PRL ―3 がホスファター ゼ活性非依存的にp53 の転写活性を亢進することを示唆した点において，今後の歯科医学 の発展に大きく貢献するものと評価した．さらに，学位申請者は，本研究を中心とした専 門分野はもとより，関連分野にっいても十づ争な学識を有していることを審査員一同が認め た．
よ っ て ， 学 位 申 請 者 は 博 士 （ 歯 学 ） の 学 位 授 与 に 値 す る も の と 認 め ら れ た ，
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