Immunohistochemical Analysis with Multiple Antibodies in Search of Prognostic Markers for Clear Cell Renal Cell Carcinoma

Title

Immunohistochemical Analysis with Multiple Antibodies in

Search of Prognostic Markers for Clear Cell Renal Cell

Carcinoma( 内容の要旨(Summary) )

Author(s)

NGUYEN, Ba Phuoc

Report No.(Doctoral

Degree)

博士（医学）甲 第739号

Issue Date

2008-03-25

Type

博士論文

Version

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/23106

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氏名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与要件 学位論文題目

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NGUYEN BA PHUOC(ベトナム) 博 士(医学) 甲第 739 号 平成20年3月 25 日 学位規則第4条第1項該当

ImmunohistochemicaIAnalysis _with Multiple Antibodiesin Search _{of Prognostic} Markers for Clear CeH RenalCellCarcinoma

審 査 委 員 (主査)教授 出 口 隆 (副査)教授 森 秀 樹 教授 吉 田 和 弘 論文内容の要旨 背景と目的 淡明細胞型腎細胞癌(以下ccRCCと略す)は全腎細胞癌の70∼80%を占める｡今日診断される腎細 胞癌の約3分の2は限局癌であるが,その限局性腎細胞癌の50%以上が経過中に再発し死に至る｡ そこで個々の腎細胞癌症例毎に予後を予測して治療戦略をたてることが重要となる｡この予後予測 因子として,多数の抗体や遺伝子マーカーの研究が精力的になされている｡ 我々は7種の抗体,Ki-67(細胞増殖に関連した核蛋白),p53(アポトーシスの誘導蛋白),bcl･2(ア ポトーシスの抑制蛋白),CyClin･Dl(細胞周期調節で重要な役割を持つ酵素),血管内皮増殖因子 (VEGF,血管新生因子),CaVeOlin-1(腎細胞癌の浸潤転移において重要な役割を担う可能性がある caveolaeの主要な構成分子),そしてHER･2(上皮増殖因子ファミリーに属する膜貫通チロシンキナ ーゼ)を用いてccRCCを対象とした免疫組織化学研究を実施した｡CCRCCの予後因子としての有用 性を評価するために,これら7つの抗体による染色結果といろいろな臨床病理因子を検討した｡今 までの報告では,腎細胞癌の組織型を考慮せず,核異型度の高い予後不良群を多数含んだ症例での 分析が多く,また,同じ症例での多数の免疫染色による抗体間の影響を検討した報告は無かった｡ 我々は同一組織型の限局癌の頻度が高くて比較的規模が大きく,一度に多種類の抗体を用いた免疫 染色を実施した｡ 対象と方法 1987年から2003年の間に岐阜大学医学部附属病院でccRCCに対して腎摘除術を実施された119 症例を対象とした｡腎癌の病期分類は1997年UICCのTNM分類を用いた｡核異型度評価は

Fuhrman 異型度表に準拠した｡一般全身状態は Eastern Cooperative Oncology Group

PerformanceScore(ECOG･PS)で評価した｡ 119症例のパラフィン包埋ブロックから癌組織とその近傍に正常な腎組織を含む切ブロックを選 択して,各々3〟m厚の切片を作製しシラン処理スライドに貼り付けた｡免疫染色の前に0.01Mク エン酸バッファー(pH6.0)を用いたオートクレイブ法(120℃,20分)による抗原賦活処理を行った｡ 内因性ペルオキシダーゼ阻害は3%過酸化水素加メタノール浸漬で行い,一次抗体は4℃で16時間 反応させた｡用いた一次抗体はマウスモノクロナール抗体MIBtl(1.6〃g/mL),マウスモノクロナ ール抗p53抗体クローンDO-7(7.8〃g/mL),マウスモノクロナール抗体bcl･2(4FLg/mL),マウスモ ノクロナール抗体VEGFクローンVGl(4〃g/mL),ウサギポリクロナール抗体HER-2(5Jlg/mL), ウサギポリクロナール抗体cyclin･DlクローンSP4(5〝g/mL),そしてウサギポリクロナール抗体

caveolin･1(12.2FLg/mL)であった｡一次抗体の視認化にはDako Envision Systemを用いた｡核染

-43-にはへマトキシリンを用いた｡内部コントロールには癌組織近傍の正常腎組織を用いた｡陰性コン トロールには一次抗体の代わりにPBSまたは正常ウサギ免疫グロブリン分画液を用いた｡過去の論 文を参考に染色結果の評価には以下の手順で行った｡まず最も陽性に染まった癌組織の領域を400 倍で観察し,最低100個の癌細胞を計測した｡陽性細胞数が10%以上を高染色群と判定し,10%未 満を低染色群と判定した｡ただし,CaVeOlin-1のみは50%で分けた｡ 観察期間は手術日を起点とし死亡日または最後の受診日までとした｡癌特異的生存期間をこの研 究のエンドポイントとした｡因子問の関連を評価するにはFisher's _{exact試験を,生存率曲線は} Kaplan-Meier法で,2群間の生存率曲線の差はlog･rank試験で評価した｡多変量解析はCox比例 ハザードモデルを用いた｡p<0.05の場合,有意差ありと判断した｡

結果と考秦

ccRCCではKi-67,P53,CyClin･Dlは核,CaVeOlin-1とVEGFは細胞膜および細胞質,bcl-2は 細胞質,HER-2は細胞膜が染色された｡11･9例での各抗体の高染色群の比率はKi-67が56%,P53 が54%,bcl･2が76.5%,CaVeOlin-1が55.5%,CyClin･Dlが64%,VEGFが79%,HER-2が83% であった｡ Ki-67(p<0.0001),P53(p=0.0029),VEGF(p=0.0062),CaVeOlin･1(p=0.00396)の高染色群では生 存率が短縮し,bcl-2(p<0.0001)とcyclin-Dl(p=0.0002)の高染色群では生存率が延長した｡これは 今までの報告と同様であった｡一方,HER･2の染色性と生存率との間には有意な関連は認めなか った｡癌特異的生存率に関する多変量解析では,手術時の転移の有無(p=0.0001),p53(p=0.0059) とbcl･2(p=0.0413)の高染色群が独立した予後因子であった｡ 核異型度が1と2の115例を対象とした場合,単変量解析では転移の有無(p<0.0001),腫瘍径 (p<0.0001),ECOG-PS(p<0.0001),Ki-67(p<0.0001),CyClin-Dl(p=0.0009),bcl-2(p=0.0035), p53(p=0.0047),VEGF(p=0.0112),年齢(p=0.0128)が癌特異的生存率に寄与していた｡これらを対 象とした多変量解析では,転移の有無(p=0.0013),ECOG･PS(p=0.0426),腫瘍径(p=0.0425), bcl-2(p=0.0227),P53(p=0.0043)が独立した予後因子となった｡核異型度が1と2のccRCCを対象 とした分析は過去に報告されていない｡ 手術時に転移の無かった96例を対象とした場合,癌特異生存率に関する単変量解析では核異型 度(p<0.0001),腫瘍径(p<0.0001),ECOG-PS(p=0.0038),Ki-67(p=0.0045),bcl-2(p=0.0014), p53(p=0.0467),年齢(p=0.0037)が予後因子となったが,多変量解析では予後因子は見つからなかっ た｡手術時に転移のあった23例を対象とした場合,P53のみが予後予測因子となった(log-rank試 験でp=0.0152,Cox解析でp=0.0207)｡ 論文審査の結果 の要 旨 申請者 NguyenBaPhuocは,CCRCCの多数例の腎摘除標本組織において,多種類の分子生物 的マー･･一カー･･一を対象とする免疫染色を実施し,p53とbcl-2の発現が癌特異的生存率に関与する予後 因子であることを明らかにした｡この研究結果は,個々のccRCC患者の予後の予測とともに治療方 針決定に･も有用であり､泌尿器科学および臨床腫瘍学の進歩に少なからず寄与するものと認められ る｡ [主論文公表誌] ImmunohistochemicalAnalysiswithMultipleAntibodiesinSearchofPrognosticMarkersfor ClearCellRenalCellCarcinoma Urology _{69,843-848(2007).}