食肉およびヒトの便から分離した Campylobacter jejuni ! coli の 薬剤感受性試験並びに耐性遺伝子変異の検討
福岡県保健環境研究所
大石 明 村上 光一 江藤 良樹 世良 暢之 堀川 和美
（平成 26 年 2 月 13 日受付）
（平成 26 年 10 月 6 日受理）
Key words : Campylobacter jejuni, drug-resistance, mutation, DNA gyrase 要 旨
Campylobacter jejuni!coliの福岡県における薬剤耐性状況を把握するため，2011 年から 2013 年の間に分離
した食肉由来株 55 株およびヒト由来株 64 株の計 119 株（C. jejuni 98 株，C. coli 21 株）を用いて，寒天平 板希釈法により薬剤感受性試験を行った．また，キノロン系抗菌剤耐性株およびテトラサイクリン系抗菌剤 耐性株の耐性遺伝子の変異等を検討した．
実施した 11 薬剤（セファレキシン，セフォキシチン，ナリジクス酸（NA），シプロフロキサシン（CPFX），
レボフロキサシン（LVFX），テトラサイクリ，ミノサイクリン，アンピシリン，ストレプトマイシン，カ ナマイシンおよびエリスロマイシン）に対して，C. jejuni!coliの株はいずれかの薬剤に耐性を示し，キノロ ン系 3 抗菌剤への耐性率は，NA 43.7％，CPFX 41.2％ および LVFX 40.3％ であった．また全ての株が多剤 耐性株であった．食肉由来株とヒト由来株では，キノロン系 3 抗菌剤への耐性率では，食肉由来株（32.7％〜
34.5％）よりヒト由来株（46.9％〜51.6％）の方がやや高い傾向を示した．耐性遺伝子の確認では，キノロ ン系抗菌剤 3 剤のいずれかに耐性を示した 50 株のうち 44 株（88.0％）のキノロン耐性決定領域の遺伝子変 異（ACA→ATA 又は ACT→ATT），それに伴うアミノ酸置換（Thr-86→Ile）が認められた．また，C. jejuni 4 株にて Thr-86→Ile を含まず，かつ，Ser-22→Gly を含むアミノ酸置換のあらたな組み合わせ（Ser22Gly- Asn203Ser-Ala206Val および Ser22Gly-Asn203）が確認された．さらに，これら 4 菌株のcmeABCの遺伝子 の変異を確認した．今回の結果，福岡県内のカンピロバクターのキノロン系抗菌剤に対する耐性率は，依然 高率であることが判明し，gyrAにおいて C257T 変異を含まないアミノ酸置換の組み合わせが確認されるな ど耐性機序も多様化しており，看過できない状況であることが分かった．
〔感染症誌 89：244〜253，2015〕
序 文
Campylobacter jejuni!coliは食中毒の病因物質として 重要であり，サルモネラや腸炎ビブリオに代わり平成 15 年から平成 24 年まで細菌性食中毒の中で最も事例 数が多いものとなっている１）．カンピロバクター腸炎 に対する選択抗菌剤の一つであるキノロン系抗菌剤に 対する耐性株が，近年増加し問題となっている２）．カ ンピロバクター腸炎患者および食肉から分離した株の 薬剤耐性状況を把握しておくことは，腸炎患者の抗菌 剤治療において重要である．川森ら３）は，1997 年から
2001 年に分離したヒト由来カンピロバクター株と 1998 年から 2000 年に分離したトリ，ウシおよびブタ 由来の株を用いて薬剤感受性試験を行い，ナリジクス 酸（NA）へは 30.1％，シプロフロキサシン（CPFX）
へは 28.4％ の菌株が耐性を示したと報告している．ま た，柿本ら４）は 2002 年から 2006 年に分離したヒト由 来株と 2005 年に分離したトリ由来株において NA へ は 40.6％，CPFX へは 39.4％ と川森らの報告３）よりも 高率に耐性を認めている．しかし近年，カンピロバク ターの薬剤耐性のデータは少なく，耐性状況を把握す る必要がある．そこで今回，福岡県におけるカンピロ バクターの薬剤耐性状況を把握することを目的とし 原 著
別刷請求先：（〒812―8577）福岡市博多区東公園 7―7
福岡県健康増進課母子保健係 大石 明
て，2011 年から 2013 年の間にヒトの便および市販鶏 肉等から分離した菌株の薬剤感受性試験を行った．さ らに，キノロン系抗菌剤耐性の機序を明らかにするこ とを目的にgyrA遺伝子上のキノロン耐性決定領域
（QRDR）の遺伝子変異あるいは，多剤排出システム
CmeABCの遺伝子変異の検出を試みた．また，テト
ラサイクリン抗菌剤に耐性を示した菌株は耐性遺伝子 を同定するためtet遺伝子の有無を検討した．
対象と方法 1．対象株
2011 年から 2013 年の間に，福岡県（北九州市，福 岡市，久留米市および大牟田市を除く）で販売されて いた食肉（鶏肉 52 件，牛レバー 3 件）から分離され た 55 株（C. jejuni 48 株，C. coli 7 株）と同県内のヒ トの下痢便から分離された 64 株（C. jejuni食中毒事 例 8 事例 50 株，C. coli食中毒事 例 3 事 例 14 株），計 119 株（C. jejuni 98 株，C. coli 21 株）を用いた．菌 株はいずれも当所で分離した．分離培地は，スキロー 改良培地（栄研化学）および modified charcoal cefo- perazone desoxycholate agar（mCCDA）培地（Oxoid）
を使用し，各増菌液を塗抹後，42˚C で 48 時間微好気 培養した．いずれかの培地でカンピロバクターを疑う 集落があった場合には，その集落を馬血液寒天培地（日 水製薬）に純培養し，生化学性状，形態および遺伝子 検査法によりカンピロバクターの同定を行った．
2．薬剤感受性試験 1）使用薬剤
抗菌剤感受性試験に使用した薬剤は，βラクタム系 の セ フ ォ キ シ チ ン（CF：sigma），ア ン ピ シ リ ン
（ABPC：和光純薬工業），アミノグリコシド系のカナ マイシン（KM：和光純薬工業），ストレプトマイシ ン（SM：和光純薬工業），テトラサイクリン系のテト ラサイクリン（TC：和光純薬工業），ミノサイクリン
（MIN：sigma），セフェム系のセファレキシン（CEX：
和光純薬工業），キノロン系の NA（和光純薬工業），
CPFX（和光純薬工業），レボフロキサシン（LVFX：
和光純薬工業）およびマクロライド系のエリスロマイ シン（EM：和光純薬工業）の計 11 薬剤を用いた．
2）薬剤感受性試験
Clinical and Laboratory Standards Institute
（CLSI）５）の寒天希釈法に準拠し，C. jejuniとC. coliの 最小発育阻止濃度（MIC）を測定した．感受性測定用 血液寒天培地は，Muller-Hinton agar II（Oxoid）に 緬羊脱繊維血液（溶血済み）（日本バイオテスト研究 所）を 5％ 加え，各抗菌剤を添加し作製した．各抗菌 剤は 2 倍段階希釈により 256μg!mL から最終濃度の 0.01μg!mL に調製した．菌液は，滅菌生理食塩水で McFarland 0.5 に調製し，各感受性測定培地に 1μL 接
種し，微好気で 42℃，24 時間培養した．判定は，完 全に発育が阻止された最小濃度を MIC とした．
3．菌体 DNA の抽出
供試菌株を Muller Hinton broth（Oxoid）に接種し，
微好気培養で 37℃，48 時間培養し，培養した菌液を QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen）および QIAcube
（Qiagen）を用い操作説明書に従って DNA 抽出した．
4．薬剤耐性遺伝子変異確認
サイクルシークエンス法に用いた対象株は，キノロ ン系 3 抗菌剤（NA，CPFX，LVFX）のい ず れ か に 耐性を示した 50 株およびいずれにも耐性を示さな か っ た 10 株 の 計 60 株 で あ る．QRDR 遺 伝 子 上 の C257T 変異等を確認するため，サイクルシークエン ス法でgyrA遺伝子上の QRDR の変異を確認した．サ イクルシークエンス法に用いた PCR プライマーを Table 1に示した．
増 幅 を 確 認 し た PCR 産 物 を illustra ExoProStar
（GE ヘルスケア）で精製し，Big Dye Terminator v3.1
（Applied Biosystems）でサイクルシークエンスを行っ た．得られたシークエンス反応物を Big Dye XTermi- nator Purification Kit（Applied Biosystems）で精製 し，シークエンサー（3500 Genetic Analyzer，Applied Biosystems）を用いて塩基配列を確認した．また，多 剤排出システムCmeABCの遺伝子変異の確認はキノ ロン系抗菌剤に耐性を示したにもかかわらず，サイク ル シ ー ク エ ン ス でgyrA遺 伝 子 上 の QRDR 上 に C257T 遺伝子変異が見られなかった 4 株について，
Lin ら６）の方法に準拠してCmeABCの遺伝子変異の確 認を行った．Table 1に示す PCR プライマーを用いて 増幅した PCR 産物を 1％ アガロースゲルで 100V，30 分間電気泳動後，エチジウムブロマイドで 30 分間染 色，30 分間脱色した後，紫外線照射下で増幅（約 6kbp）
を確認した．増幅が確認された PCR 産物を前出のサ イクルシークエンスにて塩基配列を確認した．プライ マーは約 450〜550bp の増幅を考慮し，遺伝子データ ベースに登録されている AB575956，AB575957，AB 575958 の遺伝子から，比較的 G!C 比が高い部分を約 20 塩基抽出し新たに 28 本作成した（Table 1）．なお，
得られた遺伝子配列は，C. jejuni基準株 ATCC33560T と比較した．C. jejuni 4 株と ATCC33560Tの系統樹は MEGA5 ソ フ ト ウ エ ア７）を 用 い neighbor-joining method にて作製した．
TC 耐性遺伝子領域の確認は TC に耐性を示した 32 株について，Table 1に示している標的領域の有無を PCR にて確認した８）９）．
結 果 1．薬剤感受性試験
119 株の各薬剤に対する MIC 分布を Table 2に示し
Table 1 PCR primers for detection and sequencing, and expected amplicon sizes.
Target region Primer
Name Sequence (5ʼ-3ʼ)
Expected amplicon sizes
(bp)
Direction Reference
Mutation detection at gyrA
(DNA sequence)
C. jejuni GZgyrA5 ATTTTTAGCAAAGATTCTGAT
NA Forward
GZgyrA6 CCATAAATTATTCCACCTGT Reverse 11)
C. coli GZgyrAcoli3F TATGAGCGTTATTATCGGTC
NA Forward
GZgyrAcoli4R GTCCATCTACAAGCTCGTTA Reverse 12)
tetA
tetA-F GTAATTCTGAGCACTGTCGC
210
Forward
tetA-R1 CTGCCTGGACAACATTGCTT Reverse 7)
tetA-R2 GTGCAACGGGAATTTGAAG Reverse
tetA-R3 GGCATAGGCCTATCGTTTCCA Reverse
tetB tetB-F TTGGTTAGGGGCAAGTTTTG
659 Forward
tetB-R GTAATGGGCCAATAACACCG Reverse 8)
tetE tetE-F GTGATGATGGCACTGGTCAT
278 Forward
tetE-R CTCTGCTGTACATCGCTCTT Reverse 7)
tetK tetK-F TCGATAGGAACAGCAGTA
169 Forward
tetK-R CAGCAGATCCTACTCCTT Reverse 8)
tetL tetL-F TCGTTAGCGTGCTGTCATTC
267 Forward
tetL-R GTATCCCACCAATGTAGCCG Reverse 8)
tetM tetM-F GTGGACAAAGGTACAACGAG
406 Forward
tetM-R CGGTAAAGTTCGTCACACAC Reverse 8)
tetO tetO-F AACTTAGGCATTCTGGCTCAC
515 Forward
tetO-R TCCCACTGTTCCATATCGTCA Reverse 7)
CmeABC efflux system CmeABC-F TCATCTTAATGTTTTAATTAACGCTCC
−6,000 Forward
CmeABC-R GGCTTATGAAATTACAGATGCAGA Reverse 6)
CmeABC efflux system (DNA sequencing)
Cme Seq1-1 TCAATGGATCCAAAGCTTAAAAA
NA
Forward
This study
Cme Seq1-2 AATCCTTGCTTGCATTTTCG Reverse
Cme Seq2-1 AGTGTTGATTCGGCTTACGG Forward
Cme Seq2-2 TTTGCCTTGAACGGTTTCTC Reverse
Cme Seq3-1 TCCGCAATACTCAAAGTGGA Forward
Cme Seq3-2 TTGCAACAACTGAAGCAAAAA Reverse
Cme Seq4-1 CGAAAGACCTGTTTTTGCTTC Forward
Cme Seq4-2 CCAACTCCTGGAACCCTTTT Reverse
Cme Seq5-1 TGATGGCTCAATGAGTGCAG Forward
Cme Seq5-2 CTGCTGTATGCAATGCGTTT Reverse
Cme Seq6-1 GGCAATGATGCAGTTCCAAT Forward
Cme Seq6-2 ACTTCTTGCATCGCTTGGAT Reverse
Cme Seq7-1 GCTATAGGGATTGTTGTAGAT Forward
Cme Seq7-2 TGGCTTATGTGATCAACCTCTG Reverse
Cme Seq8-1 TCCTTCAGCTTCAGCACTCC Forward
Cme Seq8-2 TGCCTATAGTTGCATTCATCG Reverse
Cme Seq9-1 CACGATGAATGCAACTATAGGC Forward
Cme Seq9-2 AAATACCGCAAAAGGCACAG Reverse
Cme Seq10-1 CTGTGCCTTTTGCGGTATTT Forward
Cme Seq10-2 TGGACTTAAAGAGCAAGCTGAA Reverse
Cme Seq11-1 TTCAATTAGCGCTATAGCAAGTTTT Forward
Cme Seq11-2 GATTTTGAGGCGCGATATGT Reverse
Cme Seq12-1 GAAATCGATCTTTGGGGAAA Forward
Cme Seq12-2 GGACGTTGAAGCAAGATGGT Reverse
Cme Seq13-1 CATCTTGCTTCAACGTCCAG Forward
Cme Seq13-2 AAGCCAATTTTGACGTGCTT Reverse
Cme Seq14-1 TACGATAATGCACAAGCAAG Forward
Cme Seq14-2 GGCTTATGAAATTACAGATG Reverse
た．ブレイクポイントは，TC，CPFX および EM は CLSI１０）が示している 16μg!mL，4μg!mL および 32μg! mL をそれぞれ用いた．その他の抗菌剤は，それぞれ
の抗菌剤に耐性を示した株をプロットし，2 峰性以上 の分布をした場合に，各ピーク値の中間値を耐性のブ レイクポイントとした．その結果，CFX 32μg!mL，
Table 2 Minimum inhibitory concentration (MIC) distribution of each antimicrobial drug against Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates from humans and meats.
Species Druga) MIC range
(μg/mL) MIC50
(μg/mL) MIC90
(μg/mL) Resistance No. of strains %
Total C. jejuni
CFX 8-＞256 256 256 94 95.9
ABPC 2-128 8 64 15 15.3
KM 2-128 4 8 1 1.0
SM 0.5-128 1 2 5 5.1
TC 0.25-128 0.5 64 18 18.4
MINO 0.125-32 0.25 16 16 16.3
CPFX 0.125-32 0.25 16 37 37.8
LVFX 0.06-8 0.25 8 37 37.8
CEX 2-＞256 256 ＞256 97 99.0
NA 1-256 16 128 39 39.8
EM 0.25-128 1 2 1 1.0
Meat C. jejuni
CFX 16-＞256 256 256 47 97.9
ABPC 1-＞256 8 64 8 16.7
KM 2-128 4 8 1 2.1
SM 0.5-128 1 2 3 6.3
TC 0.5-64 0.5 64 7 14.6
MINO 0.125-32 0.25 16 7 14.6
CPFX 0.03-16 0.25 8 16 33.3
LVFX 0.06-8 0.25 8 16 33.3
CEX 32-＞256 ＞256 ＞256 48 100.0
NA 1-256 16 256 16 33.3
EM 0.25-2 1 2 0 0.0
Human C. jejuni
CFX 8-256 128 256 47 94.0
ABPC 0.5-64 8 32 7 14.0
KM 4-16 4 8 0 0.0
SM 1-16 2 2 2 4.0
TC 0.25-128 0.5 64 11 22.0
MINO 0.125-16 0.25 16 9 18.0
CPFX 0.125-32 0.25 16 21 42.0
LVFX 0.125-8 0.25 8 21 42.0
CEX 2-＞256 128 256 49 98.0
NA 4-256 16 128 23 46.0
EM 0.25-128 1 2 1 2.0
Total C. coli
CFX 32-64 128 256 21 100.0
ABPC 2-64 16 16 1 4.8
KM 4-＞256 8 ＞256 6 28.6
SM 1-＞256 2 8 9 42.9
TC 0.5-256 128 256 14 66.7
MINO 0.125-32 32 32 14 66.7
CPFX 0.125-16 8 16 12 57.1
LVFX 0.06-8 4 8 11 52.4
CEX 128-＞256 ＞256 ＞256 21 100.0
NA 8-128 128 128 13 61.9
EM 0.25-＞256 2 32 3 14.3
Meat C. coli
CFX 32-256 128 256 7 100.0
ABPC 4-64 16 64 1 14.3
KM 4-＞256 ＞256 ＞256 6 85.7
SM 2-＞256 4 ＞256 4 57.1
TC 2-128 128 128 5 71.4
MINO 0.5-32 32 32 5 71.4
CPFX 0.125-8 0.25 8 3 42.9
LVFX 0.125-8 0.25 8 2 28.6
CEX -＞256 ＞256 ＞256 7 100.0
NA 8-128 16 128 3 42.9
EM 2-＞256 4 ＞256 3 42.9
Human C. coli
CFX 2-16 128 256 14 100.0
ABPC 64-256 8 16 0 0.0
KM 4-16 4 8 0 0.0
SM 1-8 2 8 5 35.7
TC 0.5-256 128 256 9 64.3
MINO 0.125-32 16 32 9 64.3
CPFX 0.125-16 8 16 9 64.3
LVFX 0.06-8 4 8 9 64.3
CEX 128-＞256 128 ＞256 14 100.0
NA 8-128 128 128 10 71.4
EM 0.25-2 0.5 2 0 0.0
a)Abbreviations: ABPC, ampicillin; CEX, cephalexin; CFX, cefoxitin; CPFX, ciprofloxacin; EM, erythromycin;
KM, kanamycin; LVFX, levofloxacin; MINO, minocycline; NA, nalidixic acid; SM, streptomycin; TC, tetracy- cline.
ABPC 32μg!mL，KM 64μg!mL，SM 4μg!mL，MINO 4μg!mL，CEX 16μg!mL，LVFX 1μg!mL および NA 32μg!mL を耐性のブレイクポイントとした（これ以 上の値で耐性とした）．C. jejuni!coli両菌種併せての 耐性率は，CEX 99.2％，CFX 96.6％，NA 43.7％，CPFX 41.2％，LVFX 40.3％，TC 26.9％，MINO 25.2％，ABPC 13.4％，SM 11.8％，KM 5.9％ および EM 3.4％ であっ た．食肉由来株とヒト由来株を比較すると，食肉由来 株に対する MIC90は，SM および EM が各 4μg!mL で 最 も 低 く，LVFX が 8μg!mL，CPFX が 16μg!mL，
MINO が 32μg!mL，ABPC および TC が各 64μg!mL，
KM が 128μg!mL，CFX 256μg!mL，NA 256μg!mL および CEX が 512μg!mL の順であった．ヒト由来株 に対する MIC90は，EM が 2μg!mL で最も低く，KM，
SM および LVFX が各 8μg!mL，MINO および CPFX が各 16μg!mL，ABPC が 32μg!mL，NA が 128μg! mL，CFX お よ び TC が 各 256μg!mL，さ ら に CEX が 512μg!mL の順であった．TC では MIC90がヒト由 来株で 256μg!mL，食肉由来株で 64μg!mL と他の抗 菌剤に比べ由来間にて明らかな差が認められた．
また薬剤耐性パターンの比較を Table 3に示した．
食肉由来株 55 株中 24 株（43.6％）およびヒト由来株 64 株 中 25 株（39.1％）と も に CEX お よ び CFX の 2 薬剤のみ（CEX!CFX と表記，以下同様）に耐性を示 す株が最も多かった．次に，食肉由来株では，CFX! CEX!NA!CPFX!LVFX に 耐 性 を 示 す 株 が 9 株
（16.4％），ABPC!CFX!CEX に 耐 性 を 示 す 株 が 7 株
（12.7％）の順であった．ヒト由来株では，CFX!CEX!
MINO!TC!NA!CPFX!LVFX に 耐 性 を 示 す 株 が 11 株（17.2％），ABPC!CFX!CEX!NA!CPFX!LVFX に耐性を示す株が 9 株（14.1％）であった．全ての株 が多剤耐性を示し，単独耐性は認められなかった．
次にC. jejuniとC. coliを比較 す る とC. jejuniの 耐 性率は，CFX 95.9％，ABPC 15.3％，KM 1.0％，SM 5.1％，TC 18.4％，MINO 16.3％，CEX 99.0％，CPFX 37.8％，LVFX 37.8％，NA 39.8％ および EM 1.0％
であった．C. coliでは，CFX 100％，ABPC 4.8％，KM 28.6％，SM 42.9％，TC 66.7％，MINO 66.7％，CEX 100％，CPFX 57.1％，LVFX 52.4％，NA 61.9％ およ び EM 14.3％ と ABPC を除きC. coliの耐性率がC.
jejuniより高い傾向がみられた．
2．gyrA遺伝子上のキノロン耐性決定領域の遺伝子 変異
サイクルシークエンスを行い確認した遺伝子の変異 を Table 4に示した．キノロン系 3 抗菌剤（NA，CPFX，
LVFX）の い ず れ か に 耐 性 を 示 し た 50 株 中 44 株
（88.0％）において，gyrA遺伝子上の QRDR で C257T 変 異（C. jejuniで は ACT→ATA，C. coliで は ACT
→ATT）が確認された．この変異は，アミノ酸では 86 位のトレオニン（Thr）→イソロイシン（Ile）の置 換（Thr-86→Ile）を示すものであった．
こ れ ら の Thr-86→Ile 置 換 を 持 っ た 44 株 の う ち，
Thr-86→Ile 以外のアミノ酸の置換があったものは，
Ser-22→Gly が 22 株，Asn-203→Ser が 16 株，Ala-206
→Thr が 4 株，同 じ Ala-206→Val が 2 株 で あ り，全
てC. jejuni株において認められた．なお，キノロン
系抗菌剤に耐性を示さなかった 10 株については全て QRDR においてC. jejuni基準株 ATCC33560Tと比較 して変異を認めなかった．これらの 10 株に対する NA の MIC は 1μg!mL から 16μg!mL の値を示した．
一方，キノロン系抗菌剤耐性が認められたにもかか わらず C257T 変異が確認されなかった 6 株はC. je- juni 4 株およびC. coli 2 株であった．C. jejuniの 4 株 のうち 2 株は，Ser-22→Gly，Asn-203→Ser の 2 カ所 の置換を認め，他の 2 株は上記の 2 カ所の置換と Ala- 206→Val の置換が認められた．このうちC. coliの 2 株は，CPFX および LVFX に耐性は認めず NA のみ に耐性を示した株であり，NA，CPFX，LVFX の 3 薬剤に耐性を示した株とは耐性パターンが異なってい た．
3．多剤排出システムcmeABCの遺伝子変異の確認 Lin らの報告６）同様に，cmeAの終止コドン TAA と cmeBの開始コドン ATG の A が重なり合い，cmeBと cmeCが同様に 8 塩基が重なり合っていることを確認 した．また，C. jejuni4 株のCmeABC遺伝子における 進化系統樹を Fig. 1に示した．cmeABC遺伝子のうち 5,697bp を基準株のそれと比較したところ，食肉由来 株 20-2，20-3 およびヒト由来株 B-6，B-8 はそれぞれ 116bp，116bp，103bp および 104bp 基準株との相違 があった．
4．TC 耐性遺伝子領域の確認
TC に耐性を示した 32 株中 30 株（93.8％）がtetO 遺伝子のみの保有が確認された．残り 2 株については，
今回いずれのtet遺伝子も検出されなかった．
な お，今 回 確 認 し た 菌 株 のgyrAの 遺 伝 子 配 列，
cmeABC遺伝子の配列は DNA Date Bank of Japan に登録した．Accession no．はgyrAが AB894251 か ら AB894319，cmeABCが AB894095 から AB894099 である．
考 察
今回，食肉由来とヒト由来のC. jejuniとC. coliを 用いて，薬剤感受性および耐性遺伝子の変異等の検討 を行った．その結果，キノロン系抗菌剤（NA，CPFX，
LVFX）の 耐 性 率 に お い て，食 肉 由 来 株（32.7％〜
34.5％）よりヒト由来株（46.9％〜51.6％）が や や 高 い傾向を示した．このことは，川森ら３）の報告，すな
Table 3 Drug-resistance patterns of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolates from humans and meats.
Origin Drug resistance pattern
No.
resistant isolates
(%)
C. jejuni Meat
ABPC CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 1 2.1
CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 5 10.4
CFX CEX TC NA CPFX LVFX 1 2.1
CFX CEX NA CPFX LVFX 9 18.8
KM SM CEX 1 2.1
ABPC CFX CEX 7 14.6
CFX CEX 24 50.0
Human
CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 6 12.0
ABPC CFX CEX NA CPFX LVFX 9 18.0
CFX CEX TC NA CPFX LVFX 1 2.0
ABPC CEX NA CPFX LVFX 1 2.0
CFX CEX NA CPFX LVFX 2 4.0
CFX SM MINO NA 1 2.0
CFX CEX NA EM 1 2.0
ABPC CFX CEX TC 1 2.0
CFX CEX TC 3 6.0
CEX NA CPFX 2 4.0
CFX CEX 23 46.0
Total
ABPC CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 1 1.0
CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 11 11.2
CFX CEX TC NA CPFX LVFX 2 2.0
ABPC CFX CEX NA CPFX LVFX 9 9.2
CFX CEX NA CPFX LVFX 11 11.2
ABPC CEX NA CPFX LVFX 1 1.0
CFX SM MINO NA 1 1.0
CFX CEX NA EM 1 1.0
ABPC CFX CEX NA 1 1.0
KM SM CEX 1 1.0
ABPC CFX CEX 7 7.1
CFX CEX TC 3 3.1
CEX NA CPFX 2 2.0
CFX CEX 47 48.0
C. coli
Meat
ABPC CFX CEX MINO TC NA CPFX EM 1 14.3
CFX KM SM CEX NA LVFX EM 2 28.6
CFX KM CEX TC 3 42.9
CFX CEX MINO TC 1 14.3
Human
ABPC CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 4 28.6
CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 5 35.7
ABPC CFX CEX NA 1 7.1
ABPC CFX CEX 2 14.3
CFX CEX 2 14.3
Total
ABPC CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 4 19.0
ABPC CFX CEX MINO TC NA CPFX EM 1 4.8
CFX KM SM CEX NA LVFX EM 2 9.5
CFX CEX MINO TC NA CPFX LVFX 5 23.8
CFX KM CEX TC 3 14.3
ABPC CFX CEX NA 1 4.8
CFX CEX MINO TC 1 4.8
ABPC CFX CEX 2 9.5
CFX CEX 2 9.5
ABPC, ampicillin; CFX, cefoxitin; KM, kanamycin; SM, streptomycin; TC, tetracycline; MINO, minocycline; CEX, cephalexin; NA, nalidixic acid;
CPFX, ciprofloxacin; LVFX, levofloxacin; EM, erythromycin.
わちヒト由来株の 44.6％，トリ由来株の 26.1％，ウシ 由来株の 16.7％ が CPFX に，ヒト由来株の 46.2％，ト リ由来株の 27.8％，ウシ由来株の 19.0％ が NA に耐
性を示し，ヒト由来株の方が動物由来株より耐性率が 高かったという報告と一致する．
また，C. jejuni!coliにおけるキノロン系抗菌 剤 の
Table 4 Amino acid changes in gyrA quinolone resistance determining region (QRDR) of quinolone resistant isolates and minimum inhibitory concentration (MIC) of quinolones against those isolates.
Combination of amino acid changes in quinolone resistance
determining region of gyrA (codon number)a
No. of resistant
isolates
MIC (μg/mL)
Grouping NAb CPFXb LVFXb
C. jejuni
Ser22Gly (A64G) 4 ＞128 ＞32 ＞8 Group 1 Thr86Ile (C257T)
Asn203Ser (A608G) Ala206Thr (G616A)
Ser22Gly (A64G) 7 ＞256 ＞16 ＞8 Group 2 Thr86Ile (C257T)
Asn203Ser (A608G)
Ser22Gly (A64G) 7 ＞128 ＞16 ＞8 Group 3 Thr86Ile (C257T)
Thr86Ile (C257T) 1 ＞64 ＞16 ＞8 Group 4 Asn203Ser (A608G)
Ser22Gly (A64G) 2 ＞32 ＞4 ＞8 Group 5 Asn203Ser (A608G)
Ala206Val (C617T)
Ser22Gly (A64G) 2 ＞256 ＞1 ＞0.25 Group 6 Asn203Ser (A608G)
Thr86Ile (C257T) 14 ＞256 ＞16 ＞8 Group 7
C. coli
Thr86Ile (C257T) 11 ＞16 ＞4 ＞4 Not Thr86Ile (C257T) 2 ＞128 ＞0.125 ＞0.125
aSer, serine; Gly, glycine; Thr, threonine; Ile, isoleucine; Asn, asparagine; Ala, alanine; Val, valine.
bNA, nalidixic acid; CPFX, ciprofloxacin; LVFX, levofloxacin.
耐性機序は，gyrA遺伝子上の QRDR 変異（Thr-86→
Ile）１１）１２），あるいは，cmeABC６）の遺伝子変異が関与し ていることが報告されている．今回，NA，CPFX，
LVFX の い ず れ か に 耐 性 を 示 す 株 50 株 中 44 株
（88.0％）では QRDR の C257T 変異が確認されたが，
柿本ら４）の報告では C257T 変異（すなわち Thr-86→Ile 置換）が認められた株が 97.7％ と我々の検討の方が やや低率であった．Ge ら１３）や Sonnevend ら１４）はC. je- juniにおいて，その他の部位 Ser-22→Gly，Asn-203→
Ser，Ala-206→Thr，Ala-206→Val の単独置換あるい はこれらと Thr-86→Ile を含む二重，三重および四重 置換を報告している．今回の結果では Table 4に示す とおり，二重置換が 10 株，三重置換が 9 株，四重置 換が 4 株認められた．さらに興味深いことに，Thr-86
→Ile を含まず，かつ，Ser-22→Gly を含むアミノ酸置 換の組み合わせは（Table 4，group 5 および 6）今ま で報告が少なく１３），新しい知見と思われる．この置換
が耐性にどのように関与しているかの解明は今後の課 題である．今回，Thr-86→Ile を含まないキノロン系 抗菌剤耐性 4 株では，cmeABCの遺伝子変異の存在が 確認されたため，この 4 株の耐性はcmeABCの変異 が関与しているものと考えられる．
TC では MIC90がヒト由来株で 256μg!mL，食肉由 来株で 64μg!mL であり，他の抗菌剤に比べ由来間で 明らかな差が認められた．これは，ヒト由来株では MIC90（256μg!mL）と MIC50（1μg!mL）の差（255μg!
mL）が食肉由来株のそれ（63.5μg!mL）より大きい ため，ヒト由来株は食肉由来株よりも TC により耐性 傾向を示していることからも裏付けられる．TC 系抗 菌剤は家畜で最も多く使用される１５）だけではなく，ヒ トのカンピロバクター腸炎患者の治療に用いられるこ と４）に起因していると推察できる．
また，カンピロバクターの TC 抗菌剤に対する耐性 機序は従来tetO遺伝子が多く関与していることが報
Fig. 1 Phylogenetic tree showing nucleotide sequence clusters for cmeABC from Campylo- bacter jejuni and C. coli both of which are quinolone resistant despite lacking the C257T mutation in the quinolone resistance determining region. The numbers shown in bold- face are isolates from the present study and their sequences are based on an 〜 6 kbp region from the start codon of subunit A to the stop codon of subunit C. Isolates 20-2 and 20-3 both had a serine (Ser) to glycine (Gly) substitution at position 22 of the GyrA protein (Ser22Gly), as well as Asn203Ser and Ala206Val substitutions in GyrA (corre- sponding to Group 5 in Table 4). Isolates B-6 and B-8 also had Ser22Gly and Asn203Ser substitutions (corresponding to Group 6 in Table 4). The numbers on the nodes indicate the bootstrap values from 1,000 replicates. Accession numbers for the reference sequenc- es are in square brackets. The scale bar indicates the number of nucleotide substitutions per site. NA, CPFX, and LVFX represent nalidixic acid, ciprofloxacin and levofloxacin, respectively.
告されている７）が，本研究でも 93.8％ の株がtetO遺伝 子を保有しており同様の結果であった．マクロライド 系抗菌剤である EM は，カンピロバクター腸炎に対 する第一選択剤として用いられており，この抗菌剤に 対する耐性率は今回の結果も他の抗菌剤に比べ低いも のとなっており，その有効性が裏付けられた１６）．また，
EM 耐性 4 株のうち 3 株が食肉由来株のC. coli，1 株 がヒト由来株のC. jejuniであり，Ishihara ら１７）の報告 と同様に食肉由来株からC. jejuniの EM 耐性株は認 めなかった．
C. jejuniおよびC. coliの比較では，ABPC 以外の抗 菌剤耐性率はC. coliの方がC. jejuniより高かったが，
Ishihara ら１８）もC. jejuniの ABPC 耐 性 率 はC. coliよ り唯一高率であったと報告しており，同様の結果であ ると考えられた．
本研究で，福岡県におけるキノロン系抗菌剤の NA および CPFX に対する耐性率（43.7％ および 41.2％）
は，川森ら３）の報告（30.1％ お よ び 28.4％，2004）や 柿本ら４）の報告（40.6％ および 39.4％，2007）よりや や高率に認められた．また，Bywater ら１９）の報告では，
トリから分離された株の NA と CPFX の耐性がフラ ンスやオランダで 30％ 以上，イギリスで 6％ 以上で あり，福岡県で分離された株はそれより高率であった．
今回の結果では，C. jejuni!coliの耐性パターンが全て の株で 2 薬剤以上の耐性株であり，キノロン系抗菌剤
に高い耐性を示した．また，gyrAにおいて C257T 変 異を含まない新しいアミノ酸置換の組み合わせが確認 され，看過できない状態であることが分かった．ヒト の医療現場においてもカンピロバクター腸炎患者にキ ノロン系抗菌剤が処方される場合もあるため４），今後 ともカンピロバクターに対する耐性状況を把握し，十 分に監視することが必要である．
謝辞：本研究で検査材料の採取等にご協力頂きまし た福岡県保健医療介護部保健衛生課，福岡県各保健福 祉（環境）事務所の職員の皆様，またご指導頂きまし た福岡県保健環境研究所 平田輝昭所長，千々和勝己 副所長，岡元冬樹博士，前田詠里子研究員に深謝致し ます．
なお，本研究は平成 25 年度厚生労働科学研究費補 助金（食品の安全確保推進研究事業）H25―食品―一般−
014 により実施した．
利益相反自己申告：申告すべきものなし 文 献
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Antimicrobial Susceptibility and Resistance Mutations inCampylobacter jejuniandC. coli Isolates from Human and Meat Sources
Akira OISHI, Koichi MURAKAMI, Yoshiki ETOH, Nobuyuki SERA & Kazumi HORIKAWA Department of Health Science, Fukuoka Institute of Health and Environmental Sciences
Recently, there has been a marked increase in the number of reports of fluoroquinolone-resistantCam- pylobacter jejuniandCampylobacter coli. The aim of this study was to evaluate the prevalence of antimicrobial resistance and its genetic determinants in Campylobacterspecies isolated from meat and human subjects in Fukuoka Prefecture, Japan. Between 2011 and 2013, 55 and 64 isolates were collected from meat (chicken meat and beef liver) and humans, respectively, in this prefecture. Antimicrobial susceptibility tests were conducted using the agar dilution method in accordance with the Clinical and Laboratory Standards Insti- tute guidelines, using the following 11 antimicrobial agents：cephalexin, cefoxitin, nalidixic acid, ciprofloxacin, levofloxacin, tetracycline, minocycline, ampicillin, streptomycin, kanamycin and erythromycin.
The susceptibility rates of the isolates to three quinolones (nalidixic acid, ciprofloxacin, levofloxacin) were 43.7%, 41.2%, 40.3%, respectively. All the isolates were multidrug resistant. Whereas 46.9%-51.6% of the hu- man isolates were resistant to one or more of the quinolones, only 32.7%-34.5% of the meat isolates were re- sistant to one or more of the drugs. DNA sequencing showed that of the 50 quinolone resistant isolates 44 had position 86 isoleucine (Ile) substituted for threonine (Thr) in the GyrA protein (Thr86Ile). This amino acid substitution resulted from ACA to ATA and ACT to ATT mutations of codon 86 in C. jejuni andC.
coli, respectively. Furthermore, two of the fourC. jejuniisolates lacking the Thr86Ile mutation had combined Ser22Gly-Asn203Ser substitutions, while the remaining two isolates had combined Ser22Gly-Asn203Ser-Ala 206Val substitutions. These four isolates also hadcmeABCsequences that differed from the quinolone sensi- tiveC. jejuniATCC33560Tstrain. In conclusion,C. jejuniandC. colihave relatively high quinolone resistance, and are resistant to other antibiotics. The new combination of amino acid substitutions in the GyrA protein could pose a potential threat to public health in Japan.
