薬剤耐性菌感染症治療薬の探索研究

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緒 論

肺 炎 、結 核 、胃 腸 感 染 な ど 、病 原 菌 が 体 内 に 侵 入 す る こ と で 起 こ る 感 染 症 は 、古 来 よ り 多 く の ヒ ト が 命 を 落 と す 原 因 と な り 、 感 染 症 に よ る 死 亡 率 は 高 か っ た 。 し か し 、 1940年 代 に 、 ペ ニ シ リ ン が 発 見 さ れ て 以 来 、 多 く の 抗 菌 薬 が 開 発 さ れ 、 感 染 症 の 治 療 に 使 用 さ れ る よ う に な る と 、感 染 症 に よ る 死 亡 率 は 低 下 し た1。そ れ に 伴 い 、平 均 寿 命 も 延 長 し 、 現 在 、 日 本 は 世 界 で も 有 数 の 長 寿 国 と な っ た2。 一 方 、 高 齢 化 社 会 に 伴 い 、 高 齢 者 の 肺 炎 が 増 加 し 、 2011年 に は 肺 炎 は 死 亡 原 因 の 第 3位 と な っ て い る3。 高 齢 化 社 会 が 進 行 す る に 伴 い 、今 後 益 々 、感 染 症 治 療 は 医 療 現 場 で 重 要 性 が 増 す と 考 え ら れ る 。 し か し 、 既 存 の 抗 菌 薬 に 対 し て 耐 性 を 獲 得 し て い る 薬 剤 耐 性 菌 が 報 告 さ れ て お り 、 今 後 、薬 剤 耐 性 菌 に 対 し て 有 効 な 薬 剤 が 必 要 と 考 え ら れ る4。著 者 は 、薬 剤 耐 性 菌 の 中 で も 、 医 療 現 場 で 最 も 検 出 頻 度 が 高 い 、 メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 （Methicillin

resistant staphylococcus aureus; MRSA）5,6、 お よ び 治 療 が 困 難 な こ と が 多 い 多 剤 耐 性 緑 膿 菌 （multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa; MDRP)を 含 む 薬 剤 耐 性 緑 膿 菌7に 着 目 し て 、 こ れ ら の 薬 剤 耐 性 菌 に よ る 感 染 症 の 治 療 に 有 効 な 薬 剤 の 探 索 研 究 に 取 り 組 ん だ 。 以 下 にMRSAお よ び MDRPを 含 む 耐 性 緑 膿 菌 感 染 症 の 現 状 を 述 べ る 。

黄 色 ブ ド ウ 球 菌 感 染 症 の 現 状 と 治 療 薬

黄 色 ブ ド ウ 球 菌 は 、グ ラ ム 陽 性 球 菌 で あ り 、ヒ ト の 皮 膚 な ど に 存 在 す る 細 菌 で あ る 。 通 常 は 、 無 害 で あ る が 、 免 疫 力 の 低 下 し た 患 者 で は 、 肺 炎 、 敗 血 症 、 髄 膜 炎 な ど の 感 染 症 の 原 因 菌 と な り 、 重 症 化 す る 場 合 も 多 い 8。1940 年 代 に 見 出 さ れ た ペ ニ シ リ ン G は 、 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 に 良 好 な 抗 菌 活 性 を 示 す こ と か ら 、 感 染 症 の 治 療 に 使 用 さ れ て き た 。 そ の 後 、 ペ ニ シ リ ナ ー ゼ を 産 生 す る 耐 性 菌 が 検 出 さ れ 、 ペ ニ シ リ ナ ー ゼ に 安 定 な メ チ シ リ ン や オ キ サ シ リ ン が 開 発 さ れ た 1。 し か し 、1980 年 代 よ り 医 療 機 関 で メ チ シ

リ ン に 耐 性 を 示 す MRSA が 検 出 さ れ 、 問 題 と な っ た 5。MRSA は mecA 遺 伝 子 を 有 し

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薬 は 、 他 の 系 統 の 抗 菌 薬 よ り も 感 受 性 菌 の 割 合 が 比 較 的 高 く 、 耐 性 化 が 進 ん で い な い こ と を う か が わ せ る 。

Table 1. Resistance mechanisms of P. aeruginosa against antimicrobial agents

薬 剤 系 統 薬 剤 耐 性 メ カ ニ ズ ム カ ル バ ペ ネ ム 系 薬 薬 剤 の 不 活 化 メ タ ロ β-ラ ク タ マ ー ゼ 産 生 AmpCβ -ラ ク タ マ ー ゼ 過 剰 産 生 OXA 型 β -ラ ク タ マ ー ゼ 産 生 薬 剤 蓄 積 量 減 少 OprD 減 少 排 出 シ ス テ ム 亢 進 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 薬 薬 剤 の 不 活 化 修 飾 酵 素 産 生 薬 剤 蓄 積 量 減 少 排 出 シ ス テ ム 亢 進 作 用 部 位 の 変 異 16S rRNA メ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ キ ノ ロ ン 系 薬 作 用 部 位 の 変 異 Ｄ Ｎ Ａ ジ ャ イ レ ー ス の 変 異 ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ Ⅳ 変 異 薬 剤 蓄 積 量 減 少 排 出 シ ス テ ム 亢 進

MDRP を 含 む 薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 感 染 症 に 対 す る 治 療 の 現 状

薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 の 各 抗 菌 薬 に 対 す る 耐 性 化 率 は 、 各 々 の 菌 株 が 獲 得 し て い る 耐 性 メ カ ニ ズ ム に よ り 異 な る 。そ の た め 、現 状 で は MDRP 感 染 症 の 治 療 に は 、単 剤 に よ る 治 療 は 必 ず し も 効 果 的 で な く 、複 数 の 抗 菌 薬 の 併 用 に 頼 ら な け れ ば な ら な い 状 況 で あ る 。

す な わ ち 、Breakpoint Checkerboard Plate(BC-Plate）16_{な ど を 用 い て 、 有 効 な 抗 菌}

4 O H₃C H3CHN _HO NH2 O O H2N NHR2 O H2N OH OH R1 H で 緑 膿 菌 に よ る 感 染 症 を 適 応 症 と し て い る 薬 剤 は 、 カ ナ マ イ シ ン （KM） 誘 導 体 、 ゲ ン タ マ イ シ ン （GM） 類 、 イ セ パ マ イ シ ン （ ISP） の 6 種 類 で あ る 。 こ れ ら の ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 化 学 構 造 式 を Fig. 1 に 示 す 。 O OH HO H2N _HO R1 NH2 O O R2 R3 R4 NH₂ O HN OH ゲ ン タ マ イ シ ン(GM) 混 合 物 （ R1=CH3 or H, R2=CH3 or H） O H3C H₃CHN HO NH2 O O H2N NHR2 O HN OH OH OH OH H2N O HO イ セ パ マ イ シ ン （ISP）

Fig. 1. Structures of aminoglycoside antibiotic used for P. aeruginosa

上 記 の 抗 菌 薬 以 外 に 、 緑 膿 菌 感 染 症 に 適 応 症 は 有 さ な い が 、 抗 緑 膿 菌 活 性 を 有 す る ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 と し て ア ル ベ カ シ ン(ABK)が あ る （ Fig. 2）。 O OH HO H₂N HO NH₂ O O H₂N NH2 O OH HN O H2N HO

Fig. 2. Structure of Arbekacin (ABK)

5 ABK は 、ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 中 で 唯 一 、MRSA に よ る 感 染 症 を 適 応 症 と し て お り 、抗 MRSA 薬 と し て 臨 床 上 使 用 さ れ て い る 薬 剤 で あ る 19。MRSA は ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 に 対 し 一 般 に 耐 性 を 示 す が 、こ れ は MRSA の 産 生 す る ア ミ ノ グ リ コ シ ド 修 飾 酵 素 に よ り 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド の ヒ ド ロ キ シ 基 や ア ミ ノ 基 が ア セ チ ル 化 、 リ ン 酸 化 な ど を 受 け る た め で あ る 20。 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 修 飾 酵 素 と し て は ア ミ ノ グ リ コ シ ド ア セ チ ル 基 転 移 酵 素 （AAC）、ア ミ ノ グ リ コ シ ド ア デ ニ ル 基 転 移 酵 素（ AAD）、ア ミ ノ グ リ コ シ ド リ ン 酸 基 転 移 酵 素 （APH） な ど が 知 ら れ て い る¶_{。 ま た MRSA は ２ つ の}

酵 素 機 能 を 併 せ 持 つ 二 機 能 性 酵 素 （bifunctional enzyme） AAC(6')‒APH(2")を 産 生 す る

こ と も 知 ら れ て い る 21。KM に 対 す る ア ミ ノ グ リ コ シ ド 修 飾 酵 素 に よ る 修 飾 部 位 を

Fig. 3 に 示 す 。

Fig. 3. Modification of KM by aminoglycoside modifying enzyme

ABK は こ れ ら の 修 飾 酵 素 に よ る 構 造 変 化 を う け に く く 、 そ の た め 抗 MRSA 薬 と し

て 臨 床 上 使 用 さ れ て い る 22。ま た 、臨 床 の 現 場 で は MRSA と 緑 膿 菌 が 同 時 に 分 離 さ れ

る 場 合 も 多 く 11、 こ れ ら の 細 菌 に 共 通 し て 効 果 の あ る 薬 剤 の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。

し か し 、臨 床 上 使 用 さ れ て い る 抗 MRSA 薬 5 剤 の 中 で 緑 膿 菌（ グ ラ ム 陰 性 菌 ）に も 有

効 な 薬 剤 は ABK だ け で あ る (Table 2)。

Table 2. List of anti MRSA antibiotics used in Japan

6 N O COO -H2O Zn Zn HN COO -O OH Zn Zn 修 飾 を 基 盤 と し 、MRSA と 薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 の 更 な る 向 上 を 目 指 し て 、 新 規 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 探 索 研 究 を 実 施 し た 。第 １ 章 で は 、ABK の 化 学 修 飾 体 の デ ザ イ ン お よ び そ の 合 成 と 抗 菌 活 性 に つ い て 4 節 に 亘 っ て 詳 述 す る 。

メ タ ロ β

-

ラ ク タ マ ー ゼ 阻 害 薬 の 探 索 研 究

緑 膿 菌 の 治 療 に お い て は 、前 述 し た よ う に ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の ほ か に 、カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 も 使 用 さ れ る 。 緑 膿 菌 の 薬 剤 耐 性 メ カ ニ ズ ム に お い て 、 カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 は 主 に β-ラ ク タ マ ー ゼ に よ る β -ラ ク タ ム 環 の 加 水 分 解 に よ り 不 活 化 さ れ る 。β-ラ ク タ マ ー ゼ 阻 害 剤 と カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 と の 併 用 療 法 は 、カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 の 分 解 を 阻 害 し 、 カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 の 抗 菌 活 性 の 保 持 に 貢 献 で き る と 考 え ら れ る 。第 2 章 で は 、薬 剤 の 不 活 化 に 関 与 す る β -ラ ク タ マ ー ゼ 、そ の 中 で も メ タ ロ β-ラ ク タ マ ー ゼ（ MBL）に 着 目 し た 新 規 阻 害 剤 の 開 発 経 緯 を 詳 述 す る 。以 下 に 、MBL の 概 要 と 阻 害 剤 開 発 の 現 状 を 述 べ る 。

メ タ ロ β

－

ラ ク タ マ ー ゼ

(MBL)

β-ラ ク タ マ ー ゼ は 分 子 量 20～ 30kDa の 加 水 分 解 酵 素 で あ る 。 β -ラ ク タ マ ー ゼ は 、 構 成 す る ア ミ ノ 酸 の 一 次 配 列 の 相 同 性 に よ り 、 ク ラ ス A～ D に 分 類 さ れ る 23。 ク ラ ス A お よ び C は 、そ れ ぞ れ 、ペ ニ シ リ ン 系 抗 生 物 質 お よ び セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 抗 生 物 質 の 加 水 分 解 反 応 を 主 に 触 媒 す る 。 ク ラ ス D は オ キ サ シ リ ン ペ ニ シ リ ナ ー ゼ に 相 当 し 、 オ キ サ シ ン の 分 解 反 応 を 触 媒 す る 。 こ れ ら の 酵 素 は 、 い ず れ も 活 性 中 心 に セ リ ン 残 基 を 有 す る セ リ ン β-ラ ク タ マ ー ゼ で あ る 。 一 方 、 ク ラ ス B に 分 類 さ れ る β -ラ ク タ マ ー ゼ は 、 活 性 中 心 に 亜 鉛 （ Zn） を 有 す る た め メ タ ロ β-ラ ク タ マ ー ゼ（ MBL）と 呼 ば れ て い る 。MBL は 、活 性 中 心 の Zn に 結 合 し た 不 安 定 な 水 分 子 に よ り 、 β-ラ ク タ ム 環 を 加 水 分 解 す る （ Fig. 4）。 MBL は ほ ぼ 全 て の β-ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 を 分 解 す る 強 力 な β -ラ ク タ マ ー ゼ で あ る 。 カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 に 対 す る MBL に よ る 耐 性 化 は 、 高 度 化 を 示 す 傾 向 が あ り 、 臨 床 上 問 題 と な る 耐 性 メ カ ニ ズ ム の 一 つ で あ る 。

Fig. 4. Hydrolysis of -lactam ring catalyzed by MBL

MBL は 遺 伝 子 的 に い く つ か の 型 が 知 ら れ て お り 、 国 や 地 域 に よ り 分 離 状 況 が 異 な

る 傾 向 が み ら れ る 。日 本 国 内 で は 、MBL の 中 で も IMP-1 型 が 多 い が 、欧 米 で は VIM-2

7 プ ラ ス ミ ド を 介 し て 菌 種 を 超 え て 伝 達 さ れ る 。 こ の 事 は 、 院 内 感 染 等 の 耐 性 菌 拡 散 の 観 点 で 憂 慮 す べ き 特 性 の 1 つ で あ る 25_。 現 在 、 臨 床 上 β-ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 と の 併 用 で 使 用 さ れ て い る β -ラ ク タ マ ー ゼ 阻 害 剤 と し て 、ク ラ ブ ラ ン 酸 、ス ル バ ク タ ム な ど の 薬 剤 が あ る 26,27_{。こ れ ら の β-ラ ク タ マ} ー ゼ 阻 害 剤 は 、 セ リ ン β-ラ ク タ マ ー ゼ に 対 し て 有 効 で あ る が 、 MBL に 対 し て は 無 効 で あ る 。MBL 阻 害 剤 は 、 カ ル バ ペ ネ ム 系 抗 菌 薬 と の 併 用 に よ り 、 MBL 産 生 緑 膿 菌 な ど に 対 し て 、そ の 感 受 性 を 維 持 す る こ と が 可 能 と な り 、緑 膿 菌 お よ び MDRP 感 染 症 の 治 療 に 大 き く 貢 献 で き る と 考 え ら れ る 。

メ タ ロ β

-ラ ク タ マ ー ゼ 阻 害 剤 研 究 の 現 状

こ れ ま で に 、 い く つ か の 化 合 物 が MBL 阻 害 剤 と し て 報 告 さ れ て い る 2 8 - 3 2（Fig. 5）。 こ れ ら の M B L 阻 害 剤 は 、 酵 素 阻 害 活 性 （ I C5 0） が 約 0 . 0 0 3 ~ 2  M と 強 い も の で あ っ た が 、 現 在 臨 床 で 使 用 さ れ て い な い 。 ま た 、 M B L 阻 害 剤 共 存 下 で の M B L 産 生 緑 膿 菌 に 対 す る β -ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 の 抗 菌 活 性 に つ い て の 報 告 は ほ と ん ど な い 。 H N SH O COOH S N N N N COOH S O O N H O COOH HOOC HS O O F F F F F N HOOC COOH

Fig. 5. Structures of MBL inhibitors

8 に 対 し て 、 抽 出 化 合 物 の 共 存 下 で 、 β - ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 メ ロ ペ ネ ム ( M E P M ) お よ び セ フ タ ジ ジ ム ( C A Z ) の 抗 菌 活 性 を を 評 価 し た と こ ろ 、 抗 菌 活 性 の 保 持 に 有 効 な 4 化 合 物 の 抽 出 に 成 功 し た 。そ の 中 か ら 構 造 展 開 の 可 能 性 、 異 物 排 出 ポ ン プ へ の 抵 抗 性 の 可 能 性 を 加 味 し て 、 化 合 物 A を リ ー ド 化 合 物 と し て 選 択 し た （ Fig. 6）。 第 2 章 で は 、 H T S の 詳 細 、 リ ー ド 化 合 物 の 構 造 展 開 お よ び 、合 成 誘 導 体 の 活 性 評 価 に つ い て 5 節 に 亘 り 詳 述 す る 。 COOH COOH A

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第 １ 章 新 規 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 探 索

ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 開 発 は 、放 線 菌 Streptomyces kanamyceticus の 培 養 液 中 か ら カ ナ マ イ シ ン （KM） と カ ナ マ イ シ ン B（ KM-B） が 発 見 さ れ た こ と に 端 を 発 し て い る 33。KM は 、2-デ オ キ シ ス ト レ プ タ ミ ン（ A 環 ）を 中 心 に 、4 位 の 位 置 に 6-ア ミ ノ グ ル コ ー ス （B 環 ） と 6 位 の 位 置 に 3-ア ミ ノ グ ル コ ー ス （ C 環 ） を 配 し た 構 造 を 有 し て い る （Fig. 7）。 KM お よ び KM-B の 発 見 以 来 、 耐 性 機 構 の 解 明 お よ び 耐 性 菌 に 有 効 な 誘 導 体 の 開 発 を 目 的 に 、B 環 お よ び C 環 の ヒ ド ロ キ シ 基 や ア ミ ノ 基 の 化 学 修 飾 体 が 多 数 合 成 さ れ 、 構 造 活 性 相 関 研 究 が 展 開 さ れ て き た 34。

Fig. 7. Structures of Kanamycin and Kanamycin B

こ れ ら の 構 造 活 性 相 関 研 究 に お い て 、KM の B 環 3'位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し た 3'-デ オ キ シ カ ナ マ イ シ ン は 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 修 飾 酵 素 APH(3')に よ る 不 活 化 を 受 け に く く 、 耐 性 菌 の 発 育 を 阻 止 す る こ と が 見 出 さ れ た 。 ま た 、KM-B の B 環 上 の 二 つ の ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し た 3',4'-ジ デ オ キ シ カ ナ マ イ シ ン B（ ジ ベ カ シ ン 、DKB）は 、AAD(4') お よ び APH(3')に 対 す る 安 定 性 が 向 上 す る こ と が 判 明 し て い る 35（Fig. 8）。 O OH HO H2N HO NH₂ O O R2' NH₂ O OH H2N R4' 1 2 3 4 5 6 1" 2" 3" 4" 5" 6" 1' 2' _3' 4' 5' 6' 3'-Deoxykanamycin R2'=R4'=OH Dibekacin (DKB) R2'=NH2, R4'=H

Fig. 8. Structures of 3'-Deoxykanamycin and Dibekacin (DKB)

一 方 、KM お よ び DKB を リ ー ド と す る 化 学 修 飾 に お い て 、A 環 1 位 の ア ミ ノ 基 が

(S)-ア ミ ノ-2-ヒ ド ロ キ シ 酪 酸 （ AHB 側 鎖 ） で ア シ ル 化 さ れ た ア ミ カ シ ン （ AMK） お よ び

ア ル ベ カ シ ン （ABK） が そ れ ぞ れ 合 成 さ れ た 35。AMK お よ び ABK は AAD(2")な ど の

ア ミ ノ グ リ コ シ ド 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性 が 増 強 す る こ と が 明 ら か と さ れ た 。 こ の 結 果 は 、A 環 1 位 の ア ミ ノ 基 に AHB 側 鎖 を 導 入 す る と 、 AAD(2")に 対 す る C 環 2"位 の

10 O OH HO H2N NH₂ O O R2' NH₂ O OH HN O H2N HO HO R3' R4'

Amikacin (AMK) R2'=R3'=R4'=OH Arbekacin (ABK) R2'=NH2, R3'=R4'=H Fig. 9. Structure of Amikacin and Arbekacin

ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 作 用 機 序

ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 と rRNA と の 結 合 様 式 に つ い て は 、 ト ブ ラ マ イ シ ン （TOB）36、 ゲ ン タ マ イ シ ン （GM）37、 ア ミ カ シ ン （AMK）38と の 共 結 晶 の X 線 結 晶 構 造 解 析 結 果 が そ れ ぞ れ 報 告 さ れ て い る 。 こ れ ら の 報 告 に よ る と ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の A 環 、B 環 お よ び C 環 上 の ヒ ド ロ キ シ 基 お よ び ア ミ ノ 基 の 一 部 は rRNA の A サ イ ト に 位 置 す る 核 酸 塩 基 由 来 の 窒 素 原 子 、 酸 素 原 子 と 直 接 相 互 作 用 を し て い る こ と が 判 明 し て い る 。 さ ら に 、AMK で は 、 AHB 側 鎖 の 末 端 ア ミ ノ 基 が A サ イ ト と の 結 合 に 関 与 す る こ と が 明 ら か と さ れ て い る 38。Fig. 10 に 、 rRNA の ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗

菌 薬 の 結 合 部 位 と 、AMK の rRNA と 直 接 相 互 作 用 し て い る 官 能 基 を 示 す 。ABK と rRNA

と の 共 結 晶 の X 線 結 晶 構 造 解 析 の 報 告 は な い が 、 ABK と rRNA と の 相 互 作 用 は AMK

の そ れ と ほ ぼ 同 じ で あ る と 推 定 さ れ る 。

11 を 維 持 し 、rRNA と の 結 合 を 保 持 す る 。 ② rRNA と の 結 合 に 関 与 し な い A 環 か ら C 環 上 の 置 換 基 に 注 目 し 、 化 学 修 飾 を 試 み 高 い 抗 菌 活 性 と 、 修 飾 酵 素 に 対 す る 高 い 安 定 性 を 有 す る ABK 類 縁 体 の 創 製 を 目 的 と し た 。

新 規

ABK 誘 導 体 の デ ザ イ ン

AMK お よ び ABK の 耐 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 お よ び 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性 の 研 究 か ら 、 こ れ ら の 抗 菌 薬 は MRSA の 産 生 す る AAC(6')-APH(2")に よ り 不 活 化 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ て い る 39。 前 述 し た と お り 、C 環 2"位 の ヒ ド ロ キ シ ル 基 の 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性 は A 環 1 位 の ア ミ ノ 基 に AHB 側 鎖 を 導 入 す る こ と に よ り 、向 上 で き る 。 し か し 、AAC(6')-APH(2")を 大 量 に 産 生 す る 高 度 耐 性 株 で は 、こ の 修 飾 酵 素 に よ る 不 活 化 が 報 告 さ れ て い る 22。 そ こ で 、 著 者 は AAC(6')-APH(2")に 対 す る 安 定 性 を さ ら に 高 め る た め に 、 AMK と rRNA と の 共 結 晶 の X 線 結 晶 構 造 解 析 情 報 を 踏 ま え 、 A 環 上 の 5 位 の ヒ ド ロ キ シ 基 に 着 目 し た 。前 述 し た よ う に 、AMK の 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 は 、rRNA と の 結 合 に は 直 接 関 与 し て お ら ず 、ABK の 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 も rRNA と の 結 合 に は 直 接 関 与 し て い な い こ と が 推 測 さ れ る （Fig. 11）。 著 者 は 、以 上 の 構 造 情 報 を 踏 ま え て 、は じ め に 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 の 近 傍 の 化 学 修 飾 を 検 討 し た 。す な わ ち 、ABK を リ ー ド 化 合 物 と し て エ ク ア ト リ ア ル 配 置 の 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 保 持 し て 、そ の 付 け 根 炭 素 か ら 種 々 の 置 換 基（Rax）を ア ク シ ャ ル 配 置 に 導 入 し た 類 縁 体 を デ ザ イ ン し た （Fig. 11）。 AMK O HONH2 HO OH O NH2 HN NH2 O HO HOO O NH2 OH OH O H 5 2" O HONH2 HO OH O NH2 HN NH₂ O HO R5 eq O O NH2 H2N 5 2" R5ax 新規ABK類縁体デザイン (ABK:R5 eq=OH, R5ax=H) W 赤字:rRNAと直接相互作用あり 4" 4"

Fig. 11. Design of new ABK derivatives

5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に 導 入 さ れ た 置 換 基 は 空 間 的 に 2"位 ヒ ド ロ キ シ 基 の 近 傍 に 位 置

す る こ と が 可 能 と な り 、MRSA が 産 生 す る AAC(6’)-APH(2”)と の 親 和 性 を 弱 め 、 修 飾

酵 素 に 対 す る 安 定 性 を 高 め る 効 果 が 期 待 さ れ た 。第 １ 節 で は 、ABK の 5 位 ヒ ド ロ キ シ

12 と 抗 菌 活 性 に つ い て 検 討 し た 結 果 を 詳 述 す る 。

一 方 、 社 内 の 先 行 研 究 に お い て 、ABK の 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し た 5-デ オ キ シ

誘 導 体 は 、AAC(6')-APH(2")を 産 生 す る MRSA 株 に 対 す る 抗 菌 力 に お い て 、 ABK と 同

等 で あ っ た 。 ま た 、5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し 、 さ ら に ア ク シ ャ ル 配 置 に フ ッ 素 を 導 入 し た 誘 導 体 は 、AAC(6’)-APH(2”)に 対 す る 安 定 性 が ABK と 比 較 し て 向 上 し 、抗 菌 活 性 も 高 ま る 傾 向 が 観 察 さ れ て い た 40。 ま た 、 第 １ 節 の 研 究 に お い て 、5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 へ 置 換 基 を 導 入 す る こ と に よ り 、AAC(6’)-APH(2”)に 対 す る 安 定 性 が 向 上 す る こ と が 確 認 さ れ た 。 そ こ で 第 ２ 節 で は 5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に 様 々 な 置 換 基 を 導 入 し た ABK 類 縁 体 2 の 合 成 、 お よ び 構 造 活 性 相 関 に つ い て 検 討 し た 結 果 を 述 べ る 。 ま た 、MRSA で は C 環 4"位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を ア デ ニ ル 化 す る AAD(4',4")を 産 生 す る

株 が 知 ら れ て い る 。こ の 酵 素 を AAC(6’)-APH(2”)と と も に 産 生 す る 菌 で は ABK の MIC

値 が 高 値 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る 22。 こ の 酵 素 に 対 す る 安 定 性 を 高 め る こ と は 、 耐 性 菌 に 対 す る 有 効 な 抗 菌 薬 の 創 製 に つ な が る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 第 3 節 で は 、 第 1 節 お よ び 第 2 節 で 合 成 し た ABK 類 縁 体 の 中 で も 、 抗 菌 活 性 の 強 い 化 合 物 に つ い て4"位 の ヒ ド ロ キ シ ル 基 を 反 転 さ せ た ABK 類 縁 体 3 の 合 成 と 抗 菌 活 性 を 検 討 し た（ Fig. 12）。第 4 節 で は 最 も 抗 菌 活 性 の 高 か っ た 化 合 物 に つ い て 高 次 評 価 を 実 施 し た 結 果 を 述 べ る 。 O OH H2N NH₂ O O H2N NH2 O OH HN O H₂N HO HO HO _O OH H₂N NH2 O O H2N NH₂ O OH HN O H2N HO R HO O OH H₂N NH2 O O H2N NH2 O OH HN O H₂N HO R OH 1 2 3 R

13

第 １ 節

ABK 類縁体１の合成と抗菌活性

第 １ 項

ABK 類 縁 体 1 の 合 成

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5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に 置 換 基 を 有 す る ABK 類 縁 体 1 は 、 大 量 に 入 手 可 能 な ABK か ら Scheme 1 に 示 す ル ー ト に よ り 合 成 し た 。

Scheme 1. Preparation of ABK derivatives 1

Reagents and conditions: (a) PMZ-S, Et3N, IPA, THF-H2O, 60 ºC; (b) BzCl, pyridine, CH2Cl2, r.t.; (c) DMSO, Ac2O, r.t.; (d) CH2N2, MeOH-Et2O, 0ºC; (e) 1M NaOHaq, MeOH, CH2Cl2, r.t.; (f) NaOMe-MeOH, r.t. (for 8), NaN3, DMF, 80 ºC (for 9), CsOAc, DMF, 80 ºC (for 10), MeNH2, EtOH, 80ºC (for 11), NH2(CH2)2NH2, EtOH, 80 ºC (for 12), NH2(CH2)2OH, EtOH, 80 ºC (for 13); (g) 90%TFA, r.t.; (h)H2, 10%Pd-C.

14

的 に 得 ら れ た 。6 は 脱 ベ ン ゾ イ ル （ Bz） 体 7 に 誘 導 後 、 種 々 の 求 核 試 薬 と の 反 応 に よ

り 、 化 合 物 10–13 に 誘 導 し た 。 一 方 、 オ キ シ ラ ン 誘 導 体 6 の オ キ シ ラ ン 開 環 反 応 に よ

り 化 合 物 8 お よ び 9 を 得 た 。 8 お よ び 9 の 脱 Bz 化 に よ り 化 合 物 14 お よ び 15 を 得 た 。

以 上 で 得 ら れ た 10–15 を ト リ フ ル オ ロ 酢 酸（ TFA）で 処 理 し て ABK 類 縁 体 1a–1f に 誘

導 し た 。1f は さ ら に 接 触 還 元 し て 、 ABK 類 縁 体 1g に 変 換 し た 。 得 ら れ た ABK 類 縁 体 1a–1g の 構 造 は 、 高 分 解 能 核 磁 気 共 鳴 ス ペ ク ト ル （ NMR ス ペ ク ト ル ）お よ び 質 量 分 析 ス ペ ク ト ル（MS ス ペ ク ト ル ）を 解 析 し て 、確 認 し た 。ま た 、 化 合 物 1e に つ い て は 、2 次 元 NMR(ROESY)ス ペ ク ト ル の ROE の 解 析 に よ り 、さ ら に 、 そ の 構 造 を 確 認 し た 。 化 合 物 1e の ROE の 結 果 を Fig. 13 に 示 す 。 す な わ ち 、1e の 高 分 解 能 NMR ス ペ ク ト ル (400MHz, D2O+DCl)に お い て 、B 環 お よ び C 環 の ア ノ メ リ ッ ク 位 の 水 素（ 1'-H お よ び 1''-H）は 、そ れ ぞ れ 、=5.76（ d, J=3.2 Hz） お よ び=5.19（ d, J=3.6 Hz） に ダ ブ レ ッ ト で 観 察 さ れ た 。 こ れ ら の カ ッ プ リ ン グ 定 数 は 、 ア ノ メ リ ッ ク 位 の 水 素 が エ ク ア ト リ ア ル に 配 置 さ れ て い る こ と を 示 し て お り 、 ABK か ら の 合 成 過 程 で ア ノ メ リ ッ ク 位 の 立 体 配 置 が 保 持 さ れ て い る こ と を 支 持 す る 。 一 方 、A 環 1 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の 水 素（ 1-H）と 2 位 の エ ク ア ト リ ア ル 配 置 の 水 素 （2-H）お よ び 3 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の 水 素（ 3-H）と の 間 に ROE 相 関 が 観 察 さ れ た 。 ま た 1 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の 水 素 （ 1-H） と 5 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の メ チ レ ン 水 素 （5-CH2） と の 間 に ROE の 相 関 が 確 認 さ れ た 。 さ ら に 、 2 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の 水 素 （2-H）と 4 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の 水 素（ 4-H）お よ び 6 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 の 水 素（ 6-H） と の 間 に ROE の 相 関 が 確 認 さ れ た 。こ れ ら の 結 果 は 、5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 が エ ク ア ト リ ア ル 配 置 で あ る こ と を よ く 支 持 し た(Fig. 13)。

Fig. 13. Selective ROE of ABK derivative 1e

第 ２ 項

ABK 類 縁 体 １ の 抗 菌 活 性

41

抗 菌 活 性 評 価 は 、グ ラ ム 陽 性 菌 と グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 し て 行 っ た 。グ ラ ム 陽 性 菌 と グ ラ ム 陰 性 菌 で は 、 細 胞 壁 の 構 造 が 大 き く 異 な っ て お り 、 一 般 的 に 、 グ ラ ム 陰 性 菌 で は

薬 物 の 細 胞 内 へ の 透 過 性 が 低 い こ と が 知 ら れ て い る 。 そ こ で 、5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に

15

（ S. aureus 209P JC-1 株 、S. aureus MF490(MRSA)株 ）と グ ラ ム 陰 性 菌 2 株（ E. coli NIH JC-2 株 、 P. aeruginosa PAO1 株 ） に 対 す る 最 小 発 育 阻 止 濃 度 （ MIC） を Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)の Agar dilution method に 準 じ 測 定 し て 、 抗 菌 活 性 評 価 を 行 っ た 。 評 価 結 果 を Table 3 に 示 す 。

Table 3. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of ABK derivatives 1a-e and 1g.

O OH H2N NH2 O O H2N NH2 O OH HN O H2N HO HO HO R 1a:R= OH 1b:R= NHCH3 1c:R= NH(CH)2NH2 1d:R= NH(CH)₂OH 1e:R= OCH3 1g:R= NH2

Test organism 1a 1b 1c 1d 1eb 1gb ABK

Staphylococcus aureus 209P JC-1 0.25 0.13 0.25 0.13 0.20 0.20 0.06

S. aureus MF490 (MRSA)a 32 4 8 8 6.25 12.5 64

Escherichia coli NIHJ JC-2 4 2 8 4 1.56 3.13 1

Pseudomonas aeruginosa PAO1 8 8 8 8 12.5 6.25 2

MIC (μg/mL)

a_{Producing AAC(6')-APH(2") and AAD(4',4").}

b_{日 本 化 学 療 法 学 会 標 準 法 に 準 じ た 寒 天 平 板 希 釈 法 に て 測 定}

2-1 グ ラ ム 陽 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性

は じ め に 、S. aureus 209P JC-1 株 お よ び S. aureus MF490(MRSA)株 に 対 す る 抗 菌 活 性 を 評 価 し た 。 S. aureus 209P JC-1 株 は 、 ABK 感 受 性 株 で あ り 、 こ の 菌 株 に 対 す る MIC

値 は 、ABK 類 縁 体 の 基 本 的 な 抗 菌 力（ rRNA と の 結 合 力 ）を 評 価 で き る と 考 え ら れ る 。

S. aureus MF490(MRSA)株 は 、 AAC(6')-APH(2")お よ び AAD(4',4")を 産 生 し て い る 株 で

あ り 、 こ の 菌 株 に 対 す る MIC 値 は 、 AAC(6')-APH(2")お よ び AAD(4',4")に よ る 影 響 を 評 価 で き る と 考 え ら れ る 。

ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g の S. aureus 209P JC-1 株 に 対 す る MIC 値 （ 0.13~0.25 g/mL） は 、 ABK の MIC 値 （ 0.06 g/mL） と ほ ぼ 同 等 の 値 を 示 し た 。 こ の 結 果 は 、 5

位 ア ク シ ャ ル 配 置 へ の 置 換 基 の 導 入 に よ り 基 本 的 な 抗 菌 力 （rRNA と の 結 合 力 ） は ほ

ぼ 保 持 さ れ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。ま た 、ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g の S. aureus MF490(MRSA)株 に 対 す る MIC 値（ 4~32 g/mL）は 、い ず れ も 、ABK の MIC 値（ 64 g/mL）

よ り も 低 く 、ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g は ABK よ り も 強 い 抗 菌 活 性 を 示 す 傾 向 が 明

ら か と な っ た 。 こ の 結 果 は 、5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 へ の 置 換 基 の 導 入 に よ り 、 著 者 が 予

16

2-2 グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性

次 に 、グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 を 評 価 し た 。E. coli NIH JC-2 株 に 対 す る 抗 菌

活 性 は 、ABK 類 縁 体 1a-e お よ び 1g の グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 基 本 的 抗 菌 活 性 （ rRNA

と の 結 合 力 ） が 評 価 で き る と 考 え ら れ た 。

一 方 、 P. aeruginosa PAO1 株 は 、 グ ラ ム 陰 性 菌 に 属 す る 緑 膿 菌 の 代 表 株 で あ る 。 緑 膿 菌 は 、 グ ラ ム 陰 性 菌 の な か で も 、 細 菌 内 へ の 薬 剤 の 透 過 性 が 低 い こ と が 知 ら れ て お

り 14、 こ の 株 に 対 す る 抗 菌 活 性 は 、ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g の 細 胞 壁 透 過 性 の 評

価 に つ な が る と 考 え ら れ る 。

ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g の E. coli NIH JC-2 株 に 対 す る MIC 値 （ 1.56~8 g/mL）

は ABK の MIC 値（ 1 g/mL）よ り わ ず か に 高 い が 、抗 菌 活 性 は 維 持 し て い る と 判 断 し

た 。 す な わ ち 、5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 へ の 置 換 基 を 導 入 し て も 、 グ ラ ム 陽 性 菌 と 同 様 、

グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 基 本 的 な 抗 菌 力 は ほ ぼ 維 持 し て い る と 考 え ら れ る 。 し か し な が

ら 、ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g の P. aeruginosa PAO1 株 に 対 す る MIC 値 （ 6.25~12.5

g/mL） は 、 ABK の MIC 値 （ 2 g/mL） よ り も 、 す べ て の 化 合 物 で 抗 菌 活 性 が 低 下 す る 傾 向 が み ら れ た 。こ の 結 果 よ り 、ABK 類 縁 体 1a–1e お よ び 1g は ABK と 比 較 し て 緑

膿 菌 菌 体 内 へ の 透 過 性 が 低 下 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。ABK と 比 較 し て 、 ABK 類

縁 体 1a–1e お よ び 1g の 緑 膿 菌 菌 体 内 へ の 透 過 性 が 低 下 し た 要 因 の 一 つ と し て 、５ 位 近 傍 に 極 性 基 が 多 数 存 在 す る こ と に よ り 、 分 子 全 体 の 極 性 が 大 き く 変 化 し た こ と が 考 え

ら れ た 。 そ こ で 、 次 に 、5 位 エ ク ア ト リ ア ル 配 置 の ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し て 、 ア ク シ

17

第 ２ 節

ABK 類縁体 2 の合成と抗菌活性

43 5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に の み に 置 換 基 を 導 入 し た ABK 類 縁 体 に つ い て は 、前 述 し た よ う に 、ABK の 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し 、さ ら に ア ク シ ャ ル 配 置 に フ ッ 素 を 導 入 し た 5-デ オ キ シ -5-エ ピ フ ル オ ロ ABK（ 5-epiF-ABK）の 抗 菌 活 性 が 先 行 研 究 に お い て 評 価 さ れ て い た 41（Fig. 14）。

Fig. 14. Structure of 5-epiF-ABK

こ の 先 行 研 究 に お い て 得 ら れ た 5-epiF-ABK の S. aureus MF490 株 に 対 す る 抗 菌 活 性

（MIC=25 g/mL） は 、 ABK の 抗 菌 活 性 （ MIC＝ 64 g/mL） よ り も 向 上 す る 傾 向 が 観

察 さ れ て い た 。 し か し な が ら 、 フ ル オ ロ 基 以 外 の 置 換 基 を 導 入 し た ABK 類 縁 体 の 抗

菌 活 性 に つ い て は 、 未 検 討 で あ っ た 。 本 節 で は ABK 類 縁 体 2 の 合 成 と 抗 菌 活 性 に つ

い て 検 討 し た 結 果 を 述 べ る 。

第 １ 項

ABK 類 縁 体 2 の 合 成

43

ABK 類 縁 体 2 は 、ABK か ら Scheme 2 に 示 す ル ー ト に よ り 合 成 し た 。す な わ ち 、最

初 に ABK の ５ つ の ア ミ ノ 基 を tert-ブ チ ル カ ル ボ ニ ル 基（ Boc 基 ）で 保 護 し た 。得 ら れ

た 生 成 物 を 精 製 す る こ と な く 無 水 酢 酸 ・ ピ リ ジ ン で 処 理 す る と 、5 位 を 除 く 4 つ の ヒ

ド ロ キ シ 基 が ア セ チ ル 基 で 選 択 的 に 保 護 さ れ た 化 合 物 16 が 得 ら れ た 。 化 合 物 16 は 、

メ タ ン ス ル ホ ナ ー ト 17 に 変 換 後 、 CsOAc、 LiCl、 お よ び NaN3で そ れ ぞ れ 処 理 し て 化

18

Scheme 2. Preparation of ABK derivatives 2

Reagents and conditions:(a) Boc2O, Et3N, DMF-H2O, r.t.; (b) Ac2O, pyridine, r.t.; (c)MsCl, DMAP, CH2Cl2, r.t.; (d) CsOAc, DMF, 80 ºC (for 18), LiCl, DMF, 80°C, (for 19); NaN3, DMF, 80 ºC, (for 20), MeNH2, MeOH, 80°C, (for 22), NH2(CH2)2NH2, 60°C,(for 23); (e)NaOMe, MeOH, CH2Cl2, r.t.; (f) 90%TFA; (g)BnBr, K2CO3, DMF, r.t.; (h) H2, 10%Pd-C, H2O, r.t.

第 ２ 項

ABK 類 縁 体 2 の 抗 菌 活 性

43

ABK 類 縁 体 2a–2f の 抗 菌 活 性 は 、ABK 類 縁 体 1a–1f の 評 価 に 準 じ て 、グ ラ ム 陽 性 菌 2 種 類 お よ び グ ラ ム 陰 性 菌 2 種 類 に 対 す る MIC で 評 価 し た （ Table 4）。 さ ら に P.

aeruginosa PAO1 の 異 物 排 出 ポ ン プ mexXY 欠 損 株 （ P. aeruginosa N10144） に 対 す る 抗

菌 活 性 に つ い て も 測 定 し た 。P. aeruginosa PAO1 に 対 す る MIC 値 と P. aeruginosa N101

に 対 す る MIC 値 を 比 較 す る こ と に よ り 、 異 物 排 出 ポ ン プ mexXY に よ る 影 響 を 確 認 す

19

Table 4. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of ABK derivatives 2a-f

O OH HO H2N NH2 O O H₂N NH2 O OH HN O H₂N HO a:R=OH b:R=Cl c:R=NH₂ d:R=NHMe e:R=NH(CH2)2NH2 f:R=NHCH2Ph 2 R

Test organism 2a 2bb 2c 2d 2e 2f 5-epiF

ABKbd ABK

Staphylococcus aureus 209P JC-1 0.06 0.1 0.13 0.25 0.13 0.13 0.1 0.06

S.aureus MF490(MRSA)a 2 3.13 2 4 2 8 25 64

Escherichia coli NIHJ JC-2 1 1.56 2 2 4 4 1.56 1

Pseudomonas aeruginosa PAO1 2 2 2 4 2 32 3.13 2

P.aeruginosa N101(mexXY of PAO1) 0.25 0.5 0.5 NTc NTc 1 NTc 0.25

MIC(μg/mL)

a_{Producing AAC(6')-APH(2") and AAD(4',4").}

b_{日 本 化 学 療 法 学 会 標 準 法 に 準 じ た 寒 天 板 希 釈 法 に て 測 定} c_{Not tested} d_{自 社 先 行 研 究 時 の 評 価 結 果}

2-1 グ ラ ム 陽 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性

S. aureus 209P JC-2 株 に 対 す る ABK 類 縁 体 2a–2f の MIC 値 は 、 0.06~0.25 g/mL で

あ り 、ABK の MIC 値 0.06 g/mL と ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。こ の 結 果 よ り ABK 類 縁 体 2a–2f

は 基 本 的 抗 菌 力 （rRNA と の 結 合 力 ） を 維 持 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ABK 類

縁 体 2a–2f の S. aureus MF490（ MRSA） 株 に 対 す る 抗 菌 活 性 （ MIC=2~8 g/mL） は 、

ABK の 抗 菌 活 性 （ MIC=64 g/mL） お よ び 5-epiF-ABK の 抗 菌 活 性 （ MIC=25 g/mL）

よ り も 強 い 傾 向 が 見 ら れ た 。 ま た 、ABK 類 縁 体 1 と 比 較 し て ABK 類 縁 体 2a–2f の 抗

菌 活 性 の 抗 菌 活 性 は 、強 い 傾 向 が 認 め ら れ た 。こ の MRSA 株 は AAC(6')-APH(2") お よ

び AAD(4',4").を 産 生 し て い る こ と か ら 、 ABK 類 縁 体 2a–2f は 、 ABK お よ び ABK 類 縁 体 1 と 比 較 し 、 こ れ ら の 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性 が 高 い と 考 え ら れ る 。

2-2 グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 と 異 物 排 出 ポ ン プ の 影 響

グ ラ ム 陰 性 菌 の 代 表 株 E. coli NIH JC-2 に 対 す る 抗 菌 活 性 は 、 ABK が MIC=1 g/mL

を 示 す の に 対 し て 、ABK 類 縁 体 2a–2f は MIC=1~4 g/mL を 示 し た 。 こ の MIC 値 は 、

ABK 類 縁 体 1 の MIC 値 よ り も 低 濃 度 で あ り 、 ABK 類 縁 体 2a-f は ABK 類 縁 体 1 よ り も 、グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 が 強 い 傾 向 を 示 し た 。P. aeruginosa PAO1 に 対 す る

抗 菌 活 性 は 、ABK 類 縁 体 2f を 除 く す べ て の 類 縁 体 で 、 ABK と ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。

一 方 、ABK 類 縁 体 2f の E. coli NIH JC-2 に 対 す る MIC 値 は 、 ABK 類 縁 体 2a–2e と ほ ぼ 同 等 で あ る に も 関 わ ら ず 、P. aeruginosa PAO1 に 対 す る MIC 値 は 32 g/mL と 大 き

な 値 を 示 し た 。 こ の 結 果 よ り 、ABK 類 縁 体 2f が 他 の 類 縁 体 よ り も 、 緑 膿 菌 菌 体 内 へ

20

緑 膿 菌 菌 体 内 へ の 薬 剤 へ の 透 過 は 、薬 剤 の 流 入 と 、異 物 排 出 ポ ン プ に よ る 薬 剤 の 排 出 の バ ラ ン ス に よ り 制 御 さ れ て い る 。そ こ で 、異 物 排 出 ポ ン プ の 影 響 を 調 べ る た め に 、

P. aeruginosa PAO1 の 異 物 剤 排 出 ポ ン プ の 中 で も 、ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 排 出 に

関 与 す る こ と が 知 ら れ て い る mexXY を 欠 損 し た P. aeruginosa N10144(mexXY)に 対 す

る 抗 菌 活 性 を 測 定 し た 。 こ の 株 に 対 す る ABK お よ び ABK 類 縁 体 2a–2c の 抗 菌 活 性

（MIC=0.25~0.5 g/mL）は 、化 合 物 2f の 抗 菌 活 性（ MIC=1 g/mL）と ほ ぼ 同 等 で あ っ

た 。 す な わ ち 、 P. aeruginosa N101 株 に 対 す る 抗 菌 活 性 と P. aeruginosa PAO1 株 に 対 す

る に 抗 菌 活 性 の 比 を MIC 値 で 比 較 す る と 、ABK お よ び 化 合 物 2a–2c は 、P. aeruginosa

N101 株 に 対 し て 活 性 が 4~8 倍 の 上 昇 に 留 ま っ た 。し か し 、化 合 物 2f の 場 合 に は 32 倍

上 昇 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。こ の 結 果 よ り 、化 合 物 2f は 、異 物 排 出 ポ ン プ に よ る

影 響 が 大 き い こ と が 推 定 さ れ た 。化 合 物 2f は 、構 造 中 に 脂 溶 性 の 高 い フ ェ ニ ル 基 を 有

21

第 ３ 節

ABK 類縁体 3 の合成と抗菌活性

45

第 １ 節 お よ び 第 ２ 節 で 述 べ た 構 造 活 性 相 関 研 究 に お い て 、ABK の ５ 位 ヒ ド ロ キ シ 基

を 除 去 し て 、 ５ 位 の ア ク シ ャ ル 配 置 に 比 較 的 小 さ な 極 性 基 を 導 入 す る と 、 グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 抗 菌 活 性 が 向 上 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 特 に 、 ABK 類 縁 体 2a–2c は 、 AAC(6')-APH(2") お よ び AAD(4',4").を 産 生 す る MRSA 株 に 高

い 抗 菌 活 性 を 示 し た 。 臨 床 で 分 離 さ れ た MRSA の な か に は 、 ABK の C 環 4"位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を ア デ ニ ル 化 す る AAD(4',4")の 酵 素 活 性 が 亢 進 し て い る 株 も 知 ら れ て お り 23、 AAD(4',4")に 対 す る 抵 抗 性 を さ ら に 高 め る こ と は 、 広 範 な ス ペ ク ト ル を 示 す 抗 菌 薬 の 開 発 に 繋 が る と 考 え ら れ る 。 一 般 に 、ア ミ ノ グ リ コ シ ド 修 飾 酵 素 に 対 す る ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 安 定 性 は 、 修 飾 さ れ る 官 能 基 の 除 去 あ る い は 立 体 配 置 の 反 転 な ど に よ り 高 め ら れ る こ と が 自 社 の 先 行 研 究 で 知 ら れ て い た 。 そ こ で 、 著 者 は 、 前 節 の 検 討 で 抗 菌 活 性 お よ び 菌 体 内 の 薬 物 蓄 積 量 な ど で 好 結 果 が 得 ら れ た ABK 類 縁 体 2a–2c に 着 目 し て 、AAD(4',4")に 対 す る 抵 抗 性 を さ ら に 高 め る た め に 、4"位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 反 転 さ せ た ABK 類 縁 体 3a–3c を 設

計 し た （Fig. 15）。 ABK 類 縁 体 3a-c の 合 成 と そ の 抗 菌 活 性 に つ い て 以 下 に 述 べ る 。

Fig.15. Structures of ABK derivatives 3a-3c

第 １ 項

ABK 類 縁 体 3a の 合 成

45

22 水 分 解 、 さ ら に 、Boc 基 の 除 去 を 連 続 的 に 行 い 、 目 的 と す る ABK 類 縁 体 3a に 変 換 し た 。 以 上 に 得 ら れ た ABK 類 縁 体 3a の 高 分 解 能 NMR ス ペ ク ト ル お よ び MS ス ペ ク ト ル は 、 そ の 構 造 を 良 く 支 持 し て い た 。 O O BocHN HO NHBoc O O BocHN NHBoc O RO HN O BocHN RO ABK a,b c O d e O O BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN BzO O BzO OAc f,g O HO BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN BzO TrO BzO OAc h,i 28 29 O BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN BzO BzO OAc OTr AcO j,k 31 O H2N NH2 O O H2N NH2 O HN O H2N HO OH OH OH HO O O BocHN MsO NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN BzO O BzO 26:R=H 27:R=Bz 30 3a

Scheme 3. Preparation of ABK derivative 3a

Reagents and conditions: (a) Boc2O, Et3N, DMF-H2O, r.t.; (b) 1,1-dimethoxycyclohexane,

p-TsOH, H2O, DMF, 50°C, 46-48mbar; (c)BzCl, pyridine, r.t.; (d) MsCl, DMAP, CH2Cl2, 0°C

23 Boc 基 お よ び Tri 基 を 順 次 脱 保 護 す る と 、3b お よ び 40 が 得 ら れ た 。40 は 、さ ら に 、5 位 ア ジ ド 基 を 接 触 還 元 す る と 3c に 変 換 さ れ た 。 以 上 に 得 ら れ た ABK 類 縁 体 3b お よ び 3c の 構 造 は 、 高 分 解 能 NMR ス ペ ク ト ル お よ び MS ス ペ ク ト ル を 解 析 し て 、 確 認 し た 。3c に お い て 、 3"位 ア ク シ ャ ル 水 素 （ 3"-H） が 、=3.20（ dd, J=3.2, 11 Hz） で 観 察 さ れ た 。こ れ ら の カ ッ プ リ ン グ 定 数 は 、そ れ ぞ れ 、ア ク シ ャ ル ‒エ ク ア ト リ ア ル 水 素 間 （3.2 Hz） お よ び ア ク シ ャ ル ‒ア ク シ ャ ル 水 素 間 (11 Hz)に 基 づ く も の で あ る 。 従 っ て 、 こ の 結 果 は 4"位 ヒ ド ロ キ シ 基 の 配 置 が ア ク シ ャ ル 配 置 で あ る こ と を 良 く 支 持 し て い る 。 O O BocHN HO NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN AcO 26 a O AcO O BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN AcO AcO OTr HO b,c O BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN AcO AcO OTr AcO MsO O BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN AcO AcO OTr AcO R h,i O H2N NH2 O O H2N NH2 O HN O H2N HO OH OH OH R 34 35 36 37 O BocHN NHBoc O O BocHN NHBoc O HN O BocHN AcO AcO OTr AcO HO HO d,e g 3b:R=Cl 40:R=N3 3c:R=NH2 j f 38:R=Cl 39:R=N3

Scheme 4. Preparation of ABK derivatives 3b and 3c

Reagents and conditions:(a) Ac2O, pyridine, r.t.; (b) 90%TFA, CH2Cl2, MeOH, r.t.; (c) TrCl, pyridine, 60ºC; (d) Tf2O, pyridine, CH2Cl2; (e) CsOAc, DMF, 100ºC; (f) MsCl, DMAP, CH2Cl2, 0ºC; (g)LiCl, 100ºC (for 38), NaN3, 80ºC (for39); (h) NaOMe, MeOH, CH2Cl2, r.t.; (i) 90%TFA, H2O; (j)H2, 10%Pd-C.

第 ３ 項

ABK 類 縁 体 3 の 抗 菌 活 性

45

ABK 類 縁 体 3a-c の 抗 菌 活 性 は 、 ABK 類 縁 体 2a–2f の 評 価 に 準 じ て 、 グ ラ ム 陽 性 菌 2 種 類 お よ び P. aeruginosa PAO1 か ら 異 物 排 出 ポ ン プ （ mexXY） を 欠 損 し た 株 （ P.

24 で 評 価 し た 。 結 果 を Table 5 に 示 す 。

Table 5. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of ABK derivatives 3a-c

O OH H2N NH₂ O O H2N NH2 O OH HN O H2N HO R OH 3a:R=OH 3b:R=Cl 3c:R=NH₂

Test organism 3a 3b 3c ABK

Staphylococcus aureus 209P JC-1 0.06 0.13 0.25 0.06 S.aureus MF490(MRSA)a 1 2 4 64 Escherichia coli NIHJ JC-2 0.5 1 2 1 Pseudomonas aeruginosa PAO1 1 4 4 2 P.aeruginosa N101(mexXY of PAO1) 0.25 0.5 1 0.25

MIC(μg/mL)

aProducing AAC(6')-APH(2") and AAD(4',4").

ABK 類 縁 体 3a-c の S. aureus 209P JC-2 株 に 対 す る MIC 値 は 、4"位 を 反 転 さ せ て い な い 2a–2c の MIC 値 と 同 等 で あ り 、 4"位 ヒ ド ロ キ シ 基 は 基 本 的 な 抗 菌 力 （ rRNA と の 結 合 ） に は 関 与 し て い な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 S. aureus MF490 (MRSA)株 に 対 す

る 抗 菌 力 に お い て 、ABK 類 縁 体 3a お よ び 3b は 4"位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 反 転 し て い な い

2a お よ び 2b と 比 較 し て わ ず か で は あ る が 、 低 い MIC 値 を 示 し た 。 特 に 3a の MIC 値

は 1 g/mL と 、 そ の 抗 菌 力 は ABK と 比 較 す る と 、 64 倍 強 い 活 性 を 示 し た 。

グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 す る 3a–3c の MIC 値 は 、ほ ぼ 同 等 で あ っ た が 、ABK 類 縁 体 3a は 、

2a と 比 較 す る と 、 MIC 値 が 1/2 低 い 濃 度 を 示 し た 。 ま た 、 P. aeruginosa PAO1 か ら 異

物 排 出 ポ ン プ （mexXY） を 欠 損 し た 株 （ P. aeruginosa N101 株 ） に 対 し て 、3a の MIC

値 は 0.25 g/mL あ っ た 。こ れ ら の デ ー タ ー は 、3a が 、2a お よ び ABK と 比 較 し て 、異

25

第 ４ 節

ABK 類縁体 3a の高次評価

前 節 ま で の 検 討 に お い て 、ABK の A 環 5 位 近 傍 お よ び C 環 4"位 の ヒ ド ロ キ シ 基 の 立 体 反 転 な ど の 化 学 修 飾 を 基 盤 と し て 、 グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び グ ラ ム 陰 性 菌 に 有 効 な 数 種

の ABK 類 縁 体 の 創 製 に 成 功 し た 。 中 で も 、 ABK 類 縁 体 3a は ABK よ り も 、 優 れ た 薬

物 プ ロ フ ァ イ ル を 有 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、 本 節 で は 、ABK 類 縁 体 3a

に つ い て 、 １ ） 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性 評 価 、 ２ ） 臨 床 分 離 株 に 対 す る 感 受 性 、 ３ ） 殺 菌 力 な ど の 高 次 評 価 を 詳 細 に 行 い 、 こ れ ら の 高 次 評 価 結 果 を 既 存 の ア ミ ド グ リ コ シ

ド 系 抗 菌 薬 （ABK、 GM、 お よ び KM-B） の そ れ と 比 較 し た 。

第 １ 項 修 飾 酵 素 に 対 す る 安 定 性

第 3 節 で の 検 討 に よ り 、 ABK 類 縁 体 3a は 、 MIC 値 で 比 較 す る と 、 ABK よ り も

AAC(6')-APH(2")産 生 株 （ S. aureus MF490） に 対 す る 抗 菌 活 性 が 64 倍 向 上 し た 。 こ れ よ り 、ABK 類 縁 体 3a は AAC(6')-APH(2")に 対 し て ABK よ り 安 定 で あ る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、ABK 類 縁 体 3a、ABK、GM お よ び KM-B の 4 つ の ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の 安 定 性 に つ い て 以 下 の 検 討 を 行 っ た 。 す な わ ち 、AAC(6')-APH(2")存 在 下 で 、 こ れ ら の 抗 菌 薬 を in vitro で 反 応 さ せ て 、 生 成 す る ア ミ ノ グ リ コ シ ド の 質 量 分 布 を LCMS で 観 察 し た 。 AAC(6')-APH(2")は 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の6'位 の ア ミ ノ 基 お よ び 2"位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を そ れ ぞ れ ア セ チ ル 化 お よ び リ ン 酸 化 す る ば か り か 、 そ の 両 方 の 官 能 基 を 同 時 に ア セ チ ル 化 及 び リ ン 酸 化 す る 二 機 能 性 酵 素 で あ る こ と か ら 、以 上 の 酵 素 反 応 で は 、Fig. 16-1 お よ び Fig. 16-2 に 示 す 官 能 基 修 飾 ア ミ ノ グ リ コ シ ド が 生 成 す る こ と が 予 想 さ れ た 。

26 O OH HO H₂N HO NH2 O O H2N NHX O OY H₂N OH OH 2" 1' 5' 6' Kanamycin B (KM-B): X=Y=H KM-B-Ac: X=Ac. Y=H

KM-B-PO₃H₂: X=H, Y=PO₃H₂ KM-B-Ac-PO3H2: X=Ac, Y=PO3H2

O H3C H3CHN HO NH2 O O H2N NHX O H2N OY OH Gentamicin(GM): X=Y=H GM-Ac: X=Ac, Y=H GM-PO₃H₂: X=H, X=PO₃H₂ GM-Ac-PO3H2: X=Ac, X=PO3H2

Fig. 16-2. Estimated aminoglycosides from AAC(6')-APH(2")-catalyzed acetylation and phosphorylation of aminoglycoside antibiotics (continued)

そ こ で 、S. aureus RN4220/pMF490 由 来 の AAC(6’)-APH(2”)の 濃 度 を 3 段 階（ 0.1、0.3、 1.0 mg protein/mL） に 変 化 さ せ て 、 ABK 類 縁 体 3a、 ABK、 GM お よ び KM-B と の 酵 素

反 応 を 行 い 、酵 素 反 応 に よ り 生 成 し た ア ミ ノ グ リ コ シ ド の 生 成 量 を LCMS で 分 析 し た 。

ま た 、 上 記 の 酵 素 反 応 の 前 後 で 、 そ れ ぞ れ の 抗 菌 薬 が 示 す 抗 菌 活 性 を 百 分 率 で 比 較 す

る バ イ オ ア ッ セ イ 試 験 を 実 施 し た 。 こ れ ら の 結 果 を Fig. 17 に 示 す 。

Fig. 17. (a) Distribution of modified aminoglycosides by AAC(6')-APH(2'')-catalyzed reactions. (b) Residual activities of 3a and antibiotics (ABK, GM, and KM-B).

a

27

Fig. 17(a) に 示 す よ う に 、 酵 素 濃 度 が 0.1 mg protein/mL の 酵 素 反 応 に お い て 、 3a か ら 官 能 基 修 飾 ア ミ ノ グ リ コ シ ド（3a-Ac, 3a-PO3H2, 3a-Ac-PO3H2）の 生 成 は 認 め ら れ な

か っ た 。 し か し な が ら 、ABK、 GM、 お よ び KM-B の 酵 素 反 応 で は 、 対 応 す る 6'-ア セ

チ ル 化 体（ABK-Ac、GM-Ac、KM-B-Ac）お よ び 2''-リ ン 酸 化 体（ ABK-PO3H2、GM-PO3H2，

KM-B-PO3H2）の 生 成 が 認 め ら れ た 。さ ら に 、GM の 酵 素 反 応 で は 、6'位 と 2''位 が 共 に

修 飾 を 受 け た GM-Ac-PO3H2が 僅 か に 観 測 さ れ た 。

酵 素 濃 度 を 0.3 mg protein/mL に 高 め て も 、 3a は 修 飾 酵 素 AAC(6')-APH(2'')の 作 用 を

受 け な か っ た 。し か し な が ら 、GM お よ び KM-B は す べ て 、6'-ア セ チ ル 化 体（ GM-Ac、

KM-B-Ac）お よ び 2''-リ ン 酸 化 体（ GM-PO3H2，KM-B-PO3H2）に 変 換 さ れ た 。さ ら に 、

こ れ ら の 酵 素 反 応 で は 、6'位 と 2''位 が そ れ ぞ れ ア セ チ ル 化 お よ び リ ン 酸 化 を 受 け た

GM-Ac-PO3H2お よ び KM-B-Ac-PO3H2も 生 成 し た 。

酵 素 濃 度 を さ ら に 高 濃 度 （1.0 mg protein/mL） に す る と 、 こ の 傾 向 は 強 ま り 、 ABK

は 、6'-ア セ チ ル 化 体（ ABK-Ac ）お よ び 2''-リ ン 酸 化 体（ ABK -PO3H2）に 変 換 さ れ た 。

ま た 、GM お よ び KM-B と の 反 応 で は 、 6'位 と 2''位 が そ れ ぞ れ ア セ チ ル 化 お よ び リ ン

酸 化 を 受 け た GM-Ac-PO3H2お よ び KM-B-Ac-POP3H2の 生 成 量 が 40%～ 60%に 増 加 す

る こ と が 明 ら か と な っ た 。し か し な が ら 、3a と の 反 応 で は 、2''-リ ン 酸 化 体（ 3a-PO3H2）

が 約 20%生 成 す る に と ど ま っ た 。

一 方 、LCMS 分 析 （ Fig. 17(a)） と バ イ オ ア ッ セ イ 試 験 （ Fig. 17(b)） を 比 較 す る と 、

3a、ABK、GM お よ び KM-B の 残 存 抗 菌 活 性 は 、い ず れ も 、AAC(6’)-APH(2”)に よ り 修 飾 を 受 け た 抗 菌 薬 の 質 量 分 布 が 増 加 す る と パ ラ レ ル に 減 弱 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 し か し な が ら 、3a の 残 存 抗 菌 活 性 の 低 下 率 は 、明 ら か に 他 の 抗 菌 薬 の そ れ よ り も 、小 さ か っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、ABK の 5 位 お よ び 4''位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を ア ク シ ャ ル 配 置 に 変 換 す る と 、AAC(6’)-APH(2”)に 対 す る 6 位 お よ び 2''位 の ヒ ド ロ キ シ 基 の 安 定 性 が 上 昇 し 、 抗 菌 活 性 も 保 持 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。

第 ２ 項 臨 床 分 離 株 に 対 す る 感 受 性 分 布 試 験

次 に 、3a に つ い て 、臨 床 分 離 株（ 241 株 ）に 対 す る 抗 菌 活 性 を 測 定 し た 。こ の 分 離 株 の 内 訳 は 、 グ ラ ム 陽 性 菌 と し て 、MRSA(54 株 ）、 MRCNS（ 53 株 ）、 E. faesium（ 29

株 ）、 グ ラ ム 陰 性 菌 と し て E. coli（ 26 株 ）、 K. pneumoniae（ 25 株 ）、 P. aeruginosa（ 54 株 ） で あ る 。 ま た 、 各 菌 種 に 対 し て 臨 床 上 一 般 的 に 使 用 さ れ る 各 種 抗 菌 薬 に つ い て も

抗 菌 活 性 を 測 定 し た 。Table 6 に MIC 値 の Range、 50%最 小 発 育 阻 止 濃 度 （ MIC50） お

よ び 90%最 小 発 育 阻 止 濃 度 （ MIC90） の 値 を 示 す 。

MRSA に 対 し て 、 化 合 物 3a は MIC50＝0.25 g/mL お よ び MIC90＝0.25 g/mL を 示

し た 。現 在 臨 床 で 使 用 さ れ て い る 抗 MRSA 薬 の MIC50お よ び MIC90の 値 と 比 較 す る と 、

化 合 物 3a が こ れ ら の 抗 MRSA 薬 よ り も 強 い 抗 菌 活 性 を 示 し て い る こ と が 判 明 し た 。

28

3a は 、MIC50お よ び MIC90が そ れ ぞ れ 0.12 g/mL と 強 い 抗 菌 活 性 を 維 持 し て い た 。一 方 、 E.faesium に 対 し て 、 MIC50お よ び MIC90は 、 他 の ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 と 同 等 の 値 を 示 し た 。 E. coli に 対 す る 化 合 物 3a の MIC50お よ び MIC90は 、 共 に 1 g/mL で あ り 、ABK の そ れ と 同 等 で あ っ た 。ま た 、化 合 物 3a は AMK、GM お よ び TOB と 同 等 か そ れ 以 上 に 優 れ た 抗 菌 活 性 を 示 し た 。 K. pneumoniae に 対 す る 化 合 物 3a の MIC50

お よ び MIC90は 、 共 に 0.5 g/mL で あ り 、 既 存 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 の そ れ と 殆

ど 差 は な か っ た 。 P. aeruginosa に 対 す る 化 合 物 3a の MIC50お よ び MIC90 は 、 そ れ ぞ

れ 1 お よ び 4 g/mL で あ り 、 測 定 し た 薬 剤 の 中 で 最 も 優 れ た 抗 菌 活 性 を 示 し た 。 以 上

よ り 、 化 合 物 3a は 臨 床 分 離 株 で あ る MRSA お よ び 緑 膿 菌 に 対 し 、 強 い 抗 菌 活 性 を 示

し 、 そ の 抗 菌 活 性 は 、 現 在 臨 床 で 使 用 さ れ て い る 抗 菌 薬 と 同 等 以 上 の 効 果 が 期 待 で き る 薬 剤 で あ る こ と を 確 認 し た 。

Table 6. Antimicrobial activity of ABK derivative 3a against clinical isolates of bacteria

Strain 　 Antibiotic MIC (µg/ml) 　 Strain Antibiotic MIC (µg/mL) (No. of tested)

　 Range MIC50 MIC90 (No. of tested) Range MIC50 MIC90

29

位：log10 cfu/mL）の 経 時 的 変 化 を 示 す 。ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 3a、ABK、お よ び

GM の 3 剤 を 添 加 し た 場 合 は 、 生 菌 数 が 濃 度 依 存 的 に 低 下 し た 。 特 に 、 化 合 物 3a は 、 す べ て の 濃 度 に お い て 、 薬 剤 作 用 後 2 時 間 で 、 生 菌 数 を 2 log 以 上 減 少 さ せ る 殺 菌 効 果 が 認 め ら れ た 。一 方 、非 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 MRSA 薬 で あ る VCM お よ び LZD を 添 加 し た 場 合 は 、 薬 剤 作 用 後 6 時 間 経 過 し て も 、 生 菌 数 の 低 下 は 1 log 程 度 に と ど ま っ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 （3a、 ABK、 お よ び GM） は 、 現 在 臨 床 で 使 用 さ れ て い る 非 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 の 抗 MRSA 薬 （ VCM お よ び LZD） よ り も 殺 菌 力 が 高 い こ と が 確 認 さ れ た 。ま た 、化 合 物 3a は ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬（ ABK お よ び GM） と 同 等 も し く は そ れ 以 上 の 殺 菌 力 を 有 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。

30

小 括

医 療 現 場 で 最 も 検 出 頻 度 が 高 い メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌（MRSA）、お よ び 、 治 療 が 困 難 な こ と が 多 い 多 剤 耐 性 緑 膿 菌（MDRP)を 含 む 薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 に 対 す る 治 療 薬 の 開 発 は 、臨 床 現 場 で の 治 療 の 選 択 の 幅 を 広 げ 、医 療 に 貢 献 す る こ と が 期 待 で き る 。 抗 MRSA 薬 は 、日 本 国 内 で は 現 在 5 薬 剤 が 使 用 さ れ て い る が 、グ ラ ム 陽 性 菌 に の み に 有 効 な 薬 剤 が 多 い 。 し か し 、MRSA と と も に グ ラ ム 陰 性 菌 が 検 出 さ れ る 例 も 多 く 、 グ ラ ム 陽 性 菌 と 陰 性 菌 に 有 効 な 薬 剤 は 感 染 症 治 療 に お い て 有 用 と 考 え ら れ る 。 本 章 で は 、 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 ア ル ベ カ シ ン （ABK）が 、MRSA（ グ ラ ム 陽 性 菌 ） お よ び 緑 膿 菌 （ グ ラ ム 陰 性 菌 ） に 抗 菌 活 性 を 示 す こ と に 注 目 し 、 さ ら に 抗 菌 活 性 の 向 上 を 目 指 し て 、ABK の 化 学 修 飾 に 基 づ く 新 規 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 抗 菌 薬 を 探 索 し た 経 緯 を 述 べ た 。 化 学 修 飾 の デ ザ イ ン は 、A 環 5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に 置 換 基 を 導 入 す る と 、C 環 2''位 の ヒ ド ロ キ シ 基 の 近 傍 が 立 体 的 に 遮 蔽 さ れ て 、AAC(6')-APH(2'')お よ び AAD(4,4'')に 対 す る 安 定 性 が 増 強 す る と の 仮 説 に 基 づ い て 行 っ た 。 第 1 節 で は 、 ABK の A 環 5 位 エ ク ア ト リ ア ル 配 置 の ヒ ド ロ キ シ 基 を 保 持 し て 、 5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に 種 々 の 置 換 基 を 導 入 し た ABK 類 縁 体 1 の 合 成 と 評 価 を 述 べ た 。

ABK 類 縁 体 1 は 、予 想 ど お り ABK よ り も AAC(6')-APH(2'')お よ び AAD(4,4'')産 生 株（ S.

aureus MF490(MRSA)株 ）に 対 す る 抗 菌 活 性 が 向 上 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。し か し な が ら 、ABK 類 縁 体 1 は 、緑 膿 菌（ グ ラ ム 陰 性 菌 ）に 対 す る 抗 菌 活 性 が 低 下 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。 こ れ は 、1 の A 環 5 位 に 極 性 基 が 多 数 存 在 す る こ と に よ り 、 細 胞 壁 透 過 性 が 低 下 し た た め と 予 想 さ れ る 。 そ こ で 、 第 2 節 で は 、 ABK の エ ク ア ト リ ア ル 配 置 の 5 位 ヒ ド ロ キ シ 基 を 除 去 し 、 5 位 ア ク シ ャ ル 配 置 に の み 置 換 基 を 導 入 し た ABK 類 縁 体 2 の 合 成 ・ 評 価 を 検 討 し た 。

ABK 類 縁 体 2 は 、 ABK 類 縁 体 1 と 比 較 し て 、 さ ら に 、 S. aureus MF490(MRSA)株 に 対 す る 抗 菌 活 性 が 向 上 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。 ま た 、 グ ラ ム 陰 性 菌(E. coli NIH JC-2、 P.

aeruginosa PAO1)に 対 す る 抗 菌 活 性 も 向 上 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。 臨 床 で 分 離 さ れ た MRSA の な か に は 、 ABK の C 環 4"位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を ア デ ニ ル 化 す る 修 飾 酵 素 （AAD(4',4")） の 酵 素 活 性 が 亢 進 し て い る 株 も 知 ら れ て お り 、 修 飾 酵 素 AAD(4',4")に 対 す る 抵 抗 性 を さ ら に 高 め る こ と は 、 広 範 な ス ペ ク ト ル を 示 す 抗 菌 薬 の 開 発 に 繋 が る と 考 え た 。 第 3 節 で は 、 第 2 節 で 強 い 抗 菌 活 性 が 確 認 で き た ABK 類 縁 体 2a–2c に つ い て 、 AAD(4', 4'')に 対 す る 安 定 性 向 上 を 目 的 と し て 、 4''位 の ヒ ド ロ キ シ 基 を 反 転 さ せ た ABK 類 縁 体 3a–3c の 合 成 と 評 価 を 検 討 し た 。こ れ ら の 類 縁 体 の 中 で も 、 特 に 化 合 物 3a は 、 4''位 ヒ ド ロ キ シ ル 基 が 反 転 し て い な い 化 合 物 2a と 比 較 し て 、

予 想 ど お り S. aureus MF490(MRSA) 株 お よ び グ ラ ム 陰 性 菌 (E. coli NIH JC-2 、 P.

aeruginosa PAO1)に 対 す る 抗 菌 活 性 が 向 上 す る 傾 向 が み ら れ た 。

第 4 節 で は 、 S. aureus RN4220/pMF490 由 来 の AAC(6’)-APH(2”)の 濃 度 を 変 化 さ せ て 、

32

第

2 章 メ タ ロ β -ラ ク タ マ ー ゼ 阻 害 剤 の 探 索

メ タ ロ β -ラ ク タ マ ー ゼ （ M B L ） は ペ ニ シ リ ン 系 、 セ フ ェ ム 系 お よ び カ ル バ ペ ネ ム 系 な ど ほ ぼ す べ て の β - ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 を 分 解 す る 強 力 な β - ラ ク タ マ ー ゼ で あ る 。M B L の 産 生 は 緑 膿 菌 が β - ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 に 対 し て 耐 性 を 示 す 大 き な 要 因 の １ つ と な っ て い る 4 6。 β-ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 と M B L 阻 害 剤 の 併 用 療 法 は 、薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 に よ る 感 染 症 の 治 療 に 有 効 で あ る と 考 え ら れ る 。特 に 多 剤 耐 性 緑 膿 菌（M D R P ） で は M B L 産 生 菌 が 多 い こ と が 知 ら れ て お り 4 7、 こ の 併 用 療 法 は M D R P 感 染 症 の 治 療 に 有 効 で あ る と 推 定 さ れ る 。 著 者 は 、M D R P を 含 む 薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 感 染 症 の 有 効 な 治 療 法 を 提 供 す る 目 的 で 、 β -ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 と 併 用 可 能 な M B L 阻 害 剤 の 創 製 研 究 を 行 っ た 。本 章 で は リ ー ド 化 合 物 の 探 索 、 そ の 構 造 展 開 と 最 適 化 及 び 高 次 評 価 に つ い て 5 節 に 亘 り 詳 述 す る 。

第

1 節 リ ー ド 化 合 物 の 探 索

緒 論 で 概 説 し た よ う に 、 M B L 阻 害 剤 に つ い て は 、 強 い 酵 素 阻 害 活 性 を 有 す る 数 種 の 化 合 物 が 報 告 さ れ て い る 2 8 - 3 2。 し か し 、 薬 剤 耐 性 緑 膿 菌 、 特 に M D R P を 対 象 と す る 治 療 薬 と し て 、こ れ ら の M B L 阻 害 剤 が β -ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 と 共 に 使 用 さ れ て い る 治 療 例 は 報 告 さ れ て い な い 。そ の 理 由 と し て 、 ① 緑 膿 菌 は 、 外 膜 お よ び 細 胞 壁 の 構 造 上 、 薬 剤 の 菌 体 内 へ の 透 過 性 が 他 の 菌 に 比 べ 低 い こ と 、② 緑 膿 菌 に は 多 く の 異 物 排 出 ポ ン プ が 存 在 す る た め 、わ ず か に 透 過 し た 薬 剤 も 排 出 さ れ や す い こ と が 挙 げ ら れ る（F i g . 1 9 ）。 す な わ ち 、 こ れ ら の 緑 膿 菌 の 機 能 に 対 し て 、 既 存 の M B L 阻 害 剤 は そ の 物 性 が 十 分 に 対 応 で き て い な い こ と が 推 定 さ れ る 。 β -ラ ク タ ム 系 抗 菌 薬 を 用 い る 緑 膿 菌 感 染 症 に 対 す る 併 用 療 法 に お い て 、 有 効 な M B L 阻 害 剤 を 見 出 す た め に は 、高 い 阻 害 活 性 を 有 し 、さ ら に 菌 体 内 へ の 透 過 性 の 高 い 化 学 構 造 （ リ ー ド 化 合 物 ） を 探 索 す る こ と が 必 要 と 考 え た 。

33 リ ー ド 化 合 物 の 探 索 に お い て 、目 的 と す る 生 物 活 性 を 示 す 化 学 構 造 を 見 出 す 方 法 は 、 標 的 分 子 の タ ン パ ク 質 構 造 や リ ガ ン ド の 構 造 情 報 に 基 づ き 、 理 論 的 に リ ー ド 化 合 物 を デ ザ イ ン ・ 合 成 す る 方 法 （r a t i o n a l a p p r o a c h ） と 多 数 の 化 合 物 を ラ ン ダ ム に ス ク リ ー ニ ン グ す る 方 法 （ r a n d o m a p p r o a c h ） に 大 別 さ れ る 4 8。r a t i o n a l a p p r o a c h は 標 的 分 子 等 に 親 和 性 の 高 い 分 子 の 構 造 の 最 適 化 に は 有 効 で あ る が 、薬 物 透 過 性 と 排 出 能 の バ ラ ン ス に 起 因 す る 菌 体 内 の 薬 物 量 な ど 、物 理 化 学 的 な 性 質 を 踏 ま え た リ ー ド 化 合 物 の 探 索 に は 必 ず し も 有 効 で は な い 。 一 方 r a n d o m a p p r o a c h は 、 ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 適 切 に 選 択 す る こ と に よ り 、菌 体 内 の 薬 物 量 な ど の 物 理 化 学 的 な 性 質 に お い て 、 好 ま し い リ ー ド 化 合 物 の 探 索 が 可 能 で あ る と 考 え ら れ る 。 特 に 、 ロ ボ ッ ト 工 学 の 発 展 に よ り 利 用 可 能 と な っ た ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ （H T S ） は r a n d o m a p p r o a c h の １ つ と し て リ ー ド 化 合 物 の 探 索 に 利 用 さ れ て い る 4 8。 そ こ で 、 著 者 は 社 内 化 合 物 ラ イ ブ ラ リ ー （9 1 4 9 6 化 合 物 ） に つ い て 以 下 の ス ク リ ー ニ ン グ 系 を 組 み 合 わ せ て H T S を 行 い 、 M B L 阻 害 剤 の リ ー ド 化 合 物 を 探 索 し た （ F i g . 2 0 ）。 社内化合物ライブラリー（91496サンプル） ①IMP-1阻害活性（ニトロセフィン分解阻害活性スクリーニング） （230サンプル） ②IMP-1産生大腸菌（異物排出ポンプ破壊株）における 　MEPM、CAZとの併用効果スクリーニング （40サンプル） ③IMP-1産生緑膿菌（異物排出ポンプ破壊株）における 　MEPM、CAZとの併用効果スクリーニング リード化合物

Fig. 20. Scheme for discovery of the lead compound through HTS