ヒトの下痢便から分離された Campylobacter jejuni と Campylobacter coli の抗菌薬感受性

序 文

Campylobacter

は 1909 年に流産したヒツジの胎 児から分離され，獣医学の分野で注目されていた が，1977 年に Skirrow がヒトの腸炎の起炎菌であ る

の選択分離培養法を 確 立 し

， 先進国の散発性下痢症患者から

が 高頻度に検出されるようになった．我が国では，

1982 年 に

が 食 中 毒 起 因 菌に指定された

．最近， ニューキノロン系薬剤耐

性株の増加が問題となっている

．Campylobac-

腸炎治療の第 1 選択薬剤として使用されるマ クロライド系薬剤に耐性の

はまだ 稀であるが

，今回， マクロライド系薬剤に耐性の

が 分 離 さ れ た の で，2001 年 か ら 2003 年に腸炎患者の下痢便より検出した

と

の分離状況と抗菌薬感受性試験結果を

解析した．

材料と方法

1．分離培養法

2001 年 1 月から 2003 年 12 月までの 3 年間に，

腸 炎 患 者 の 下 痢 便 3,204 検 体 を Skirrow 培 地

ヒトの下痢便から分離された Campylobacter jejuni と Campylobacter coli の抗菌薬感受性

1）伊勢崎市民病院中央検査科，^2）群馬大学医学部保健学科，^3）農林水産省動物医薬品検査所

高山 貞男

佐竹 幸子

石原加奈子

（平成 16 年 12 月 10 日受付）

（平成 17 年 1 月 11 日受理）

2001 年 1 月から 2003 年 12 月までの 3 年間に，下痢症患者の糞便 3,204 検体よりCampylobacter147 株が分離された．Campylobacter陽性率は 15 歳以下，16 歳から 30 歳，31 歳以上で，それぞれ 2.5％（29! 1，155 検体），12.9％（83!641 検体），2.5％（35!1,408 検体）となり，16 歳から 30 歳の年齢層が 15 歳以 下（p＜0.001）および 31 歳以上（p＜0.001）の年齢層に比べ陽性率が有意に高かった．5 月から 8 月に提 出された 16 歳から 30 歳の男性の便からの陽性率が最も高かった（26％，32!123 検体）．Erythromycin

（EM），ciprofloxicin（CPFX），tetracycline（TC）の耐性のブレイクポイントをそれぞれ≧16µg!ml，≧

2µg!ml，≧16µg!ml とすると，耐性率はC. jejuniではそれぞれ 0.0％，22.0％，42.8％ となり，C. coli ではそれぞれ 62.5％，62.5％，87.5％ であった．C. coliにおいて，8 株中 3 株が EM，CPFX，TC に耐性 の多剤耐性株であった．EM の MIC が≧512µg!ml の高度耐性を示した 5 株はディスク拡散法では全く 阻止円を形成しなかったが，MIC が 8µg!ml 以下の EM 感受性株 7 株は 24mm から 36mm の阻止円を 形成し，寒天平板希釈法および Etest と良い相関を示した．C. jejuniが分離された期間を前期（2001 年 1 月〜2002 年 6 月）と後期（2002 年 7 月〜2003 年 12 月）に分けて耐性率を比較すると，CPFX の耐性 率が 27.5％ から 15.5％ に減少していたが，有意差は認められなかった（p＝0.133）．

〔感染症誌 79：169〜175，2005〕

要 旨

別刷請求先：（〒372―0817）群馬県伊勢崎市連取本町 12 番地 1

伊勢崎市民病院中央検査科 高山 貞男

Campylobacter, diarrhea, MIC, drug resistance, erythromycin Key words：

Table  1  Detection  rate  of Campylobacter  from  stool  samples  taken  from  sporadic  diarrheic  patients

P value Number of samples

Negative Positive（%）

0.034 Male ver. female

1,611 91（  5.3）

male Sex

1,446 56（  3.7）

female

＜ 0.001

＜＿

  15 ver. 16 -30 1,126

29（  2.5）

＜＿   15 Age

＜ 0.001 16―30 ver. ＞  31＿

558 83（12.9）

16―30

＜＿ 1

  15 ver. ＞  31＿ 1,373

35（  2.5）

＞＿   31

＜ 0.001 May―Aug ver. Sep―Apr

1,030 79（  7.1）

May―Aug Month

2,027 68（  3.4）

Sep―Apr

（Oxoid 社，2001 年 1 月から 2002 年 5 月） ，および CCDA 培地（Oxoid 社，2002 年 6 月から 2003 年 12 月）で 42℃，48 時間微好気培養した．

2．同定

分離培養で発育した菌をグラム染色し，グラム 陰 性 の ら せ ん 状 桿 菌 を

属 と 同 定 し， 血液寒天培地に純培養した菌を 20％ スキムミ ルクに濃厚に浮遊させて，−80℃ で凍結保存し た．Linton らの方法

に従って，

に特異的 な hippuricase 遺伝子，C. coli に特異的な CCCH 遺伝子をターゲットとした PCR 法にて保存菌株

を用いて

の菌種を同定した．上記

の方法で同定できなかった株は Fermer らの方 法

により，23S rRNA 遺伝子を増幅し，その増幅

産物を

ターンを確認した．

3．使用薬剤

抗 菌 薬 感 受 性 試 験 に は gentamicin（GM） ， erythromycin（EM），ciprofloxicin（CPFX），tet- racycline（TC）の 4 薬剤を使用した．

4．抗菌薬感受性試験

NCCLS に準拠した寒天平板希釈法で

と

の最小発育阻止濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）を測定した

．感受性測定 には Muller-Hinton agar（Oxoid 社）にヒツジ脱線 維血液を 5％ 加えた血液寒天培地を使用した．こ の血液寒天培地を用いて 37℃ で 48 時間微好気培 養した被検菌を Muller-Hinton broth（Difco 社）に 浮遊させて McFarland 0.5 の菌液を調整した．こ の菌液を Muller-Hinton broth で 10 倍に希釈し，1

スポットあたり 2×10

CFU になるようにミクロ プランター（サクマ製作所）を用いて 2

l を抗菌薬 添加血液寒天培地に接種し，37℃ で 48 時間微好 気培養した．EM については，寒天平板希釈法の他 に，Etest（AB BIODISK 社）及びディスク拡散法 でも感受性検査を実施した

．ディスク拡散法 には EM15

g 含有のセンシ・ディスク（輸入元：

日本ベクトン・ディッキンソン社，日本 BD 社） を 使用した．Etest 及びディスク拡散法では，McFar- land 1 に調整した被検菌液を綿棒で 5％ ヒツジ脱 線維 血 液 添 加 Muller-HintonII agar （日 本 BD 社）

に接種し，42℃ で 24 時間微好気培養後に判定し た．

結 果

1．Campylobacter の分離状況

2001 年 1 月から 2003 年 12 月までの 3 年間に，

腸 炎 患 者 の 下 痢 便 3,204 検 体 よ り

147 株が分離された．Campylobacter 陽性率を男性 と女性で比較すると，それぞれ 5.3％（91

1,702 検体），3.7％（56

1,502 検体）となり，男性から有 意に高い率で

が分 離 さ れ た（p＝

0.034） （Table 1） ．年齢層別にみると，

の陽性率は 15 歳以下，16 歳から 30 歳，31 歳以

上でそれぞれ 2.5％（29

1,155 検体），12.9％（83

641 検体），2.5％（35

1,408 検体）となり，16 歳か

ら 30 歳の年齢層が 15 歳以下（p＜0.001）および

31 歳以上 （p＜0.001） の年齢層に比べ有意に高かっ

た．1 年を 5 月から 8 月，9 月から 4 月の 2 期に分

けて陽性率を比較すると，それ ぞ れ 7.1％（79

1,109 検体），3.4％（68! 2095 検体）となり，5 月か

Table  2  Detection rates of Campylobacter in 16 to 30 year old patients P value Number of samples

Time periods Male Female

Male ver. female Negative

Positive（%）

Negative Positive（%）

0.003 105

13（11.0）

  91 32（26.0）

May―Aug

0.059 196

14（  6.7）

166 24（12.6）

Sep―Apr

Table  3  Distribution of MICs for 127 C. jejuni and 8 C. coli strains isolated in human stools from 2001 to 2003 in Japan No. of isolates for which MIC（µg /ml）is：

No. of  isolates Species

Drug

＞ 512 512 256 128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25

≦ 0.125

2 36 47 42 C. jejuni 127

GM

1 3 2 2 C. coli 8

2 9 77 39 C. jejuni 127

EM

4 1 1

1 1 C. coli 8

3 9 16 7

34 58 C. jejuni 127

CPFX

1 1 3 3

C. coli 8

5 19 22 7 1 1

5 6 21 39 C. jejuni 126

TC

2 4 1 1

C. coli 8

GM, gentamicin；EM, erythromycin；CPFX, ciprofloxacin；TC, tetracycline

ら 8 月の陽性率が 9 月から 4 月に比較して有意に 高かった（p＜0.001） （Table 1）．層別化すると，5 月から 8 月に提出された 16 歳から 30 歳の男性の 便からの陽性率（26％，32

123 検体）が最も高 かった（Table 2） ．

2．同定

凍結保存した

147 株のうち 12 株 が保存中に死滅した．凍結保存できた 135 株を PCR 法 に て 菌 種 の 同 定 を 行 い，126 株 を

と 同 定 し た．1 株 は hippu- ricase 遺伝子および CCCH 遺伝子を保有してい なかった． しかし 23S rRNA 遺伝子の

ターンが

sub.

の標準株と同じであ り，C. jejuni と同定した．

3．MIC 分布

GM は

お よ び

に 高 い 抗 菌 活 性 を示し， すべての菌株が≦1

g

ml の MIC を示し，

MIC 分 布 も 菌 種 間 で 差 異 が 認 め ら れ な か っ た

（Table 3） ．C. jejuni は 全 て の 菌 株 に お い て EM の MIC 値が≦8

g

ml であった．しかし，C. coli に お い て は，EM の MIC が≦8µg! ml の 株 は

37.5％（3

8 株）のみで，残りの 62.5％（5

8 株）の 株は MIC が≧512

g

ml であり，明瞭な 2 峰性の 分布を示し， MIC が 16 から 256µg! ml の菌株は認 められなかった．Campylobacter の CPFX の MIC は，≦0.125 か ら 0.5

g

ml，8 か ら 64

g

ml の 2 峰性の分布を示し，TC の MIC は≦0.125 から 2

g

ml と，16 から 256

g

ml の幅広い分布を持つ 2 峰 性 を 示 し た．以 上 の 結 果 か ら GM，EM，

CPFX，TC 耐性のブレイクポイントは，それぞれ

≧16

g

ml，≧16

g

ml，≧2

g

ml，≧16

g

ml とした．

4．抗菌薬耐性率

GM，EM，CPFX，TC の 耐 性 率 は，C. jejuni で は そ れ ぞ れ 0.0％，0.0％，22.0％，42.8％ と な り，C. coli ではそれぞれ 0.0％，62.5％，62.5％，

87.5％ であった．

検定すると

は

よ り も EM（p＜0.001） ，CPFX（p＝0.021） ，TC

（p＝0.023）において有意に耐性率が高かった（Ta- ble 4） ．C. coli に お い て，8 株 中 3 株 が EM，

CPFX，TC の 3 剤に耐性，2 株が EM と TC の 2

剤に耐性，1 株が CPFX と TC の 2 剤に耐 性，1

Table  4 Resistant rates of four antimicrobaial agents to C. jejuni and C. coli  P value Resistsnt rate（%）

Break point Antimicrobial agent

C. coli（n ＝ 8）

C. jejuni（n ＝ 127）

1 0.0

0.0

＞ 16 Gentamicin

＜ 0.001 62.5

0.0

＞ 16 Erythromycin

0.021 62.5

22.0

＞ 2 Ciprofloxacin

0.023 87.5

42.8

＞ 16 Tetracycline

Table  5  Resistant  rates  of  two  antimicrobial  agents  to C. jejuni  isolates  between  the  periods of January 2001―June 2002 and July 2002―December 2003

P value  Resistant rate（%）of strains isolatesd from:

Antimicrobial agent

July 2002―December 2003 January 2001―June 2002

（n ＝ 58）

（n ＝ 69）

0.133 15.5

27.5 Ciprofloxacin

0.370 48.3

39.7 Tetracycline

株が CPFX1 剤に耐性，1 株 が TC 1 剤 に 耐 性 で あった．

5．分離時期別にみた耐性率の比較

薬 剤 感 受 性 試 験 を 実 施 し た

株が分離された期間を前期（2001 年 1 月〜2002 年 6 月）と後期（2002 年 7 月〜2003 年 12 月）の 2 つに分けて薬 剤 耐 性 率 を 比 較 す る と，EM は 6.5％ から 0.0％，CPFX は 31.2％ から 15.5％，TC は 42.9％ から 48.3％ に変化し，CPFX にのみ有意 差が認められた（p＝0.043）．しかし，耐性率が高 かった

8 株を除いた

127 株につい て前期と後期の耐性率を比較すると，TC 耐性率 は 39.7％ か ら 48.3％ と 増 加 し，CPFX は 27.5％

から 15.5％ に減少したが，いずれの薬剤において も有意な耐性率の変化は認められなかった（Ta- ble 5） ．

6．寒天平板希釈法，Etest，ディスク拡散法を用 いた EM の抗菌薬感受性試験

EM の MIC が 1

g

ml から 8

g

ml を示した 7 株（C. coli 1 株，C. jejuni 6 株）を用いて，寒天平 板希釈法と Etest で求めた MIC を比較すると，3 株は同じ MIC であったが，その他の菌株は Etest の方が寒天平板法より 2 倍から 4 倍低い MIC を 示した （Table 6） ．寒天平板希釈法により測定した EM の MIC が≧512µg! ml の高度耐性を示した 5

株は Etest では＞256

g

ml，ディスク拡散法では 全く阻止円を形成しなかった．寒天平板希釈法で MIC が 8

g

ml 以下の EM 感受性株は デ ィ ス ク 拡散法では 24mm から 36mm の阻止円を形成し，

7mm から 23mm の中間の大きさの阻止円を示す 株はなかった．EM の耐性ブレークポイントを MIC で≧16µg! ml，阻止円直径で≦6mm とする と，寒天平板希釈法，Etest 法，ディスク拡散法の いずれの方法においても， 使用した 12 株の成績は 全て一致し，これら 3 つの方法を用いた成績は良 い相関を示した．

考 察

Campylobacter

属は，サルモネラや腸炎ビブリオ

を凌いで当院では最も分離頻度の高い食中毒の起 炎菌である．分離された

の大部分 は

であり，C. coli は稀にしか検出されな かった．Campylobacter jejuni!

は家畜の腸管に 高率に生息しており，それらの排泄物で汚染され た食肉，環境，生乳からヒトへ感染すると考えら れている

．好発時期は食中毒が頻発する 5 月か ら 8 月であり，これは食中毒を引き起こす他の菌 種と同様の結果であった

．好発年齢層は小児お よび青年層とされているが

，本研究では

pylobacter

の分離率は 16 歳から 30 歳の男性が有

意に高かった．欧米では好発年齢層が青年層から

Table  6  Erythromycin  susceptibility  to C. jejuni  and C. coli  using the agar dilution, Etest, and disk diffusion tests 

Disk diffusion（mm）^b）

MIC（µg/ml）

Species

E test^b）

Agar dilution^a）

6

＞ 256

＞ 512 C. coli

6

＞ 256

＞ 512 C. coli

6

＞ 256

＞ 512 C. coli

6

＞ 256

＞ 512 C. coli

6

＞ 256 C. coli 512

24 4

C. coli 8

28 2

C. jejuni 4

33 1

C. jejuni 4

30 2

C. jejuni 2

36 0.5

C. jejuni 1

34 0.75

C. jejuni 1

30 1

C. jejuni 1

aIncubated for 48hours at 37 ℃

bIncubated for 24hours at 42 ℃

壮年層までの広がりがあり，性差は認められてい ない

．本研究では，青年男性から高頻度に検出 されていることから，好発年齢層や性差の違いは 食文化や食品の嗜好の相違によるものと考えられ る．

NCCLS は

の判定基準 MIC（ブレ イクポイント）を公表していないので，本研究で 得 ら れ た MIC 分 布 を 参 考 に し て GM，EM，

CPFX，TC の 耐 性 の 判 定 基 準 を そ れ ぞ れ≧16

g

ml，≧16

g

ml，≧2

g

ml，≧16

g

ml とした．

NCCLS が発表している動物用の GM，EM，TC の耐性判定基準≧16

g

ml，≧8

g

ml，≧16

g

ml と比較すると，異なるのは EM のみである．EM の MIC が 8

g

ml を示す株が 3 株あり，この 3 株 は感受性の MIC を示す菌株と同じ分布にあった ので，8µg! ml は感受性とし，≧16µg! ml を耐性と した．

この耐性判定基準を使用すると，EM 耐性率は

で 0％（0

127 株），C. coli で 62.5％（5

8 株）であった．家畜の便由来株について研究した Ishihara ら の 報 告 に お い て も

，EM 耐 性 株 76 株は全て

であ っ た．前 期（2001 年 1 月〜

2002 年 6 月） に EM 耐性

が分離されたが，

後期（2002 年 7 月〜2003 年 12 月）では分離され ず，後期の EM 耐性率は 0％ となった．Campylo-

bacter

の抗菌薬耐性率の変化は，耐性率の高い

coli

の分離率に依存していると考えられる．Cam-

pylobacter

腸炎の治療に EM が第一選択薬剤とし

て 期 待 さ れ る が，今 後，再 び EM 耐 性 の

が分離される可能性があるので，早急に少なくと も第一選択薬剤である EM の判定基準の設定が 望まれる．菌株数は少ないが，EM 耐性菌 5 株と感 受性菌 7 株の寒天平板希釈法，Etest，ディスク拡 散法の成績は良い相関を示した．Gaudreau 等も，

寒天平板希釈法とディスク拡散法の比較を

145 株を用いて実施している

．寒天平 板希釈法で EM の MIC が≦4

g

ml を示した 139 株はディスク拡散法で 20mm 以上の阻止円を形 成 し，≧128

g

ml の 4 株 は 阻 止 円 を 形 成 し な かった．EM の MIC が 16 から 64

g

ml を示す株 はないが，MIC が 8µg! ml を示す株が 2 菌株あっ た．ブレークポイントを設定する際，MIC が 8

g

ml を示す菌株のカテゴリーをどの様にするかと いう問題と，使用する耐性菌の菌株数の問題が残 されている．EM に高度耐性の株が Gaudreau 等 は 4 株，本研究でも 5 株のみであるので，EM の判 定基準の設定には，今後さらに多くの耐性菌株を 用いた検討が必要であると考える．

最近，ニューキノロン系薬剤耐性株の増加が問

題 と な っ て い る

の CPFX 耐 性 率 22％

（28

127 株） は，米国で 2001 年に分離された

の CPFX 耐性率 18％（66

365 株）と同様な結 果 で あ っ た

．わ が 国 に お い て も

の ニューキノロン系薬剤耐性率は今後も継続して監 視する必要があると考える．

文 献

1）Skirrow MB ：Campylobacter enteritis ： A new disease. Br Med J 1977；2：9―11.

2）厚生省環境衛生局食品衛生課長通知：ナグビブ リオ，カンピロバクター等の食品衛生上の取り扱 いについて．環食第 59 号 1982.

3）Aarestrup FM, Nielsen EM, Madsen M, Engberg J：Antimicrobial susceptibility patterns of ther- mophilicCampylobacter spp. from humans , pigs , cattle , and broilers in Denmark . Antimicrob Agents Chemother 1997；41：2244―50.

4）Gaudreau C, Gilbert H：Antimicrobial resistance ofCampylobacter jejuni subsp . jejuni strains iso- lated from humans in 1998 to 2001 in Montreal, Canada. Antimicrob Agents Chemother 2003 ； 47：2027―9.

5）Krausse R, Ullmann U：In vitro activities of new fluoroquinolones againstCampylobacter jejuniand Campylobacter coliisolates obtained from humans in 1980 to 1982 and 1997 to 2001. Antimicrob Agents Chemother 2003；47：2946―50.

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7）Linton D, Lawson AJ, Owen RJ, Stanley J：PCR detection, identification to species level, and fin- gerprinting ofCampylobacter jejuni andCampylo- bacter coli direct from diarrheic samples . J Clin Microbiol 1997；35：2568―72.

8）Fermer C, Engvall EO：Specific PCR identifica- tion and differentiation of the thermophilic Cam- pylobacters,Campylobacter jejuni,C. coli,C. lari, andC. upsaliensis. J Clin Microbiol 1999 ； 37 ： 3370―3.

9）National Committee for Clinical Laboratory Stan- dards：Performance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from animal ； Approved standard-

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10）National Committee for Clinical Laboratory Stan- dards：Performance standards for antimicrobial susceptibility testing ； fourteenth informational supplement. M100-S14：NCCLS, Wayne, 2004；p.

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12）Huang MB, Baker CN, Banerjee S, Tenover FC：

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13）Altekruse SF , Stern NJ , Fields PI , Swerdlow DL ：Campylobacter jejuni― An emerging food- borne pathogen. Emerg Infect Dis 1999；5：28―

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14）国立感染症研究所，厚生省保健医療局結核感染症 課：サルモネラ症 2003 年 6 月現在．病原微生物 検出情報 2003.

15）国立感染症研究所，厚生省保健医療局結核感染症 課：カンピロバクター腸炎 1995―1998．病原微生 物検出情報 1999.

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17）Ishihara K, Kira T, Ogikubo K, Morioka A, Ko- jima A, Tanaka-Kijima M,et al.：Antimicrobial susceptibilities of Campylobacter isolated from food-producing animals farms（1999―2001）：re- sults from the Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring Program. Int J Antimicrob Agents 2004；24：261―9.

18）Gaudreau C, Gilbert H：Comparison of disc diffu- sion and agar dilution methods for antibiotic sus- ceptibility testing ofCampylobacter jejunisubsp.je- juni and Campylobacter coli. J Antimicrob Che- mother 1997；39：707―12.

Antimicrobial Susceptibility of

and

Isolated from Human Diarrheic Samples

Sadao TAKAYAMA

, Sachiko SATAKE

＆ Kanako ISHIHARA

1）Isesaki Municipal Hospital

2）School of Health Sciences, Gunma University

3）National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries

One hundred forty-seven

were isolated using 3,204 samples taken from sporadic diarrheic patients from January 2001 to December 2003. The detection rate of

in 16 to 30 year old patients（12.9％, 83

641）was significantly higher than that in patients less than16 years of age, 5％,（29" 1,155） （p＜0.001）and more than 30 years of age, 2.5％（35" 1,408） （p＜0.001）,respec- tively. The highest detection rate was obtained from the stool of males in the 16 to 30 year old range during the months from May to August, 26％（32

123）.If the minimal inhibitory concentration（MIC）

breakpoint for resistance of gentamicin（GM） , erythromycin（EM） , ciprofloxacin（CPFX） , tetracy- cline（TC）were defined tentatively

16

g

ml，

16

g

ml,

2

g

ml,

16

g

ml, the resistant rate would be 0.0％, 0.0％, 22.0％, 42.8％ in

, 0.0％, 62.5％, 62.5％, 87.5％ in

the

isolates were susceptible to GM. Three of the 8

isolates were multi-resistant in EM, CPFX, and TC. Five highly EM resistant strains with an MIC of

512

g

ml did not show any zone around the EM disk；7 susceptible strains with an MIC of less than 16µg" ml showed＝zones of 24mm to 36mm and revealed a good correlation with the Etest method and the agar dilution method.

Between the two time periods of January 2001―June 2002 and July 2002―December 2003, the resis-

tant rate of CPFX in

decreased from 27.5％ to 15.5％, however, that was not significant de-

crease（p＝0.133） .