九州大学学術情報リポジトリ

(1)

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

金属配位官能基を有するDNA配位子の合成と機能評価

末田, 慎二

九州大学工学応化分子分子システム工学

https://doi.org/10.11501/3135034

出版情報：Kyushu University, 1997, 博士（工学）, 課程博士バージョン：

権利関係：

(2)

第3章金属配位官能基を有するオリゴヌクレオチドと DNAの相互作用

3 -1 緒言

第2章では、金属配位官能基を有するDNAインターカレータとDNAの相互作用について述べた。 DNAインターカレータは、その基本構造が非常に単純

であるにも関わらずDNAに対する結合能を有するため、インターカレータを基体としたDNA配位子については、 DNAとの相互作用に関する基礎的な知見を得るのに適している。しかしながら、その構造が単純であるが故に、 DNA への塩基配列特異的な結合はほとんど期待できない。そこで、本章では、塩基配列特異的な結合が可能なDNAオリゴヌクレオチドを基体としたDNA配位

子を設計し、そのDNAとの相互作用を調べた。

第l章で述べたように、 DNAオリゴヌクレオチドはHoogs teen型の水素結合を形成して、 DNA二本鎖とDNA三本鎖を形成することが可能である(図1-3)。

DNAオリゴヌクレオチドの三本鎖形成は、現在知られているうち最も高い塩基配列選択性を有するDNAの認識モチーフの1つである4)。この性質のため、

DNAオリゴヌクレオチドは、人工の遺伝子発現手段としての活用が検討されている。例えば、三本鎖形成によって、遺伝子の特定領域への転写制御因子 (タンパク)の結合を妨げることによって、その遺伝子の発現を制御した例

がいくつか報告されているの.3010

一方で、天然の遺伝子発現制御機構をみると、何らかの刺激に応じてその遺伝子の発現がon、 of fされていることがわかる。例えば、メタロチオネイン (MT)遺伝子の発現がその良い例である。ここではまず、細胞内の重金属イオンの濃度の上昇に伴い、金属依存性の転写制御因子が活性化される。そして、活性化された転写制御因子がMT遺伝子の上流にあるプロモーター領域に結合することによって、 MT遺伝子の発現が起こる。このように、 MT遺伝子の発現は、細胞内の重金属イオンによって制御されているということができ

-63-

(3)

る。

このような観点から、 DNAオリゴヌクレオチドを利用して人工的に遺伝子発現を制御する場合においても、何らかの刺激に応じて、そのDNA二本鎖、への結合(三本鎖形成)が制御できることが望ましい。そこで、本研究では、

DNAオリゴヌクレオチドの三本鎖形成能を金属イオンによって、制御することを試みた。

また、第l章で述べたように、 DNA結合性タンパクの認識サイトの多くは、

C2対称、配列となっている。そこで、本研究では、このようなC2対称配列をターゲットとした。

上記の目的のために、金属配位子として、イミノ二酢酸部位を導入したオリゴヌクレオチド (4、ふ 6)を合成した(図3-1 )。このようなオリゴヌクレオチドは、先のDNAインターカレータの系で観られたように、適当な金属イオンの添加により、金属イオンとイミノ二酢酸部位との1 : 2錯体の形成を通じて、二量化することが予想される。 DNAオリゴヌクレオチドのDNA二本

H (' _OH

HOOCー，， /'... _; ん人 ?.

⁷ ^3・

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O-P-O

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HOOCーノ

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0 6

図3-1 イミノ二酢酸部位を有するオリゴヌクレオチド

-64-

(4)

@京

DNA二本鎖

〆

イミノ二酢酸部位を有する DNAオリゴヌクレオチド

、金属イオン

図3-2 金属イオンによるDNA三本鎖形成の制御

鎖に対する親和性(三本鎖形成能)は、二量体として協同的に結合することによって増大することが期待される。そのため、金属イオンによるDN A三本鎖形成の制御が可能であると考えられる(図3-2)。また、このような戦略では、図3-2に示すように、当然C2対称な配列をターゲットとすることが可能であるため、このような配列へのオリゴヌクレオチドの結合を金属イオンによって制御することが可能であると考えられる。

本章では、 DNAオリゴヌクレオチド4、 5、 6とDNA二本鎖との相互作用について、}II買に述べていく。

-65-

(5)

3-2

イミノ二酢酸修飾ピリミジン7量体

会OH

H ('

HOOC ー"" /"....

人 ^人 ?

^5' ^3T

... N� �C"'- _"-/' 、O-P-O_一一一 TTTTTTT HOOC ---/ ス

。_'-J 。 4

まず、イミノ二酢酸修飾ピリミジン7量体(4)を合成し、そのDNAとの相互作用を検討した。このオリゴヌクレオチド4のターゲットとなる DNA二本鎖としては、図3-3に示すような27me r、 28mer、 29me rを合成した。これらのDNA二本鎖は、その配列内に 4の結合サイトとなる連続したアデニン配列をそれぞ、れ2箇所有している。また、 27mer、 28mer、 29mer

は、それぞれ連続したアデニン配列の間に、 l、 2、 3 塩基ほど余分な塩基を有している。これは、 4が金属錯形成を通じて二量化した際のリンカ一部分の長さを考慮して導入した。従って、これらの配列は、実際のところ疑似C2対称、配列ということになるが、基礎的な検討を行う本研究にはこのような配列で十分であると考えられる。

27mer

28mer

29mer

5'-CTGGACTTTTTTTGAAAAAAACAGGTC-3' 3'-GACCTGAAAAAAACTTTTTTTGTCCAG-5'

51-CTGGACTTTTTTTGCAAAAAAACAGGTC-31 31-GACCTGAAAAAAACGTTTTTTTGTCCAG-51

51-CTGGACTTTTTTTGCGAAAAAAACAGGTC-3' 3'-GACCTGAAAAAAACGCTTTTTTTGTCCAG-51

図3-3 4のターゲットとなるDNA二本鎖

第l章で述べたようにDNA三本鎖形成反応には方向性がある。すなわち、

三本自のピリミジン鎖は、二本鎖のプリン塩基に平行に配向して結合する。したがって、図3-3のDNA二本鎖に対しては、 2分子の4がイミノ二酢酸部位を互いに向き合わせた形で結合することになる(図3-4)。ゆえに、キレート部位における金属錯形成を通じた4の二量化が期待できる。

-66-

(6)

オリゴヌクレオチド4

3' 3・

3'

3・ 5'

図3-4 DNA二本鎖上での金属イオンとの錯形成を通じたDNAオリゴヌクレオチドの二量化

3 -2-1 オリゴヌクレオチドの合成

以下に示すような、 27m er 、 28m er、 29m erを構成するオリゴヌクレオチ

ド及び、 4の合成前駆体となる末端にアミノ基を導入したオリゴヌクレオ

チド7を合成した。合成は、 DNA自動合成装置(Pharmacia LKB Gene Assembler Plus)を用い、ホスホロアミダイト法にて行った。図3-5に合成装置内で行われる合成反応を示す。

27mer-a 27mer-b

28mer-a 28mer-b

29mer-a 29mer-b

7

5'-CTGGACTTTTTTTGAAAAAAACAGGTC-3' 5'-GACCTGTTTTTTTGAAAAAAAGTCCAG-3'

5'-CTGGACTTTTTTTGCAAAAAAACAGGTC-3' 5'-GACCTGTTTTTTTGCAAAAAAAGTCCAG-3'

5'-CTGGACTTTTTTTGCGAAAAAAACAGGTC-3' 5'-GACCTGTTTTTTTCGCAAAAAAAGTCCAG-3'

OH H2凡人

_〉 _‘O-

?

1

^-o-T T T T T T T

。

-67-

(7)

@

1. Detrytilation

I

3. Coupling

ー

R，:ーCH2CH2CN

DMTr:

OCH3

2. Acti vation tetrazole

DMTO

W

o

- P ....

R1 0'" � N ( i-Pr h

n-mer oligonucleotides

図3-5 オリゴヌクレオチドの自動回相合成

-68-

(8)

NVo， L ^N 人

人

DMTの�

NC

�

人人

人

、、.，ノ噌，Eムftt、

(2)

末端にアミノ基を有するオリゴピリミジン7の合成にあたっては、まず、

通常のアミダイト試薬( ¹)を用いてチミンの7量体を合成し、最後にアミダイト試薬(2)をカップリングさせることによって、 5'末端へのアミノ基の導入を行った。

反応の各段階で生じるトリチルカチオンの吸収からカップリング反応の収率を概算した結果、いずれのオリゴヌクレオチドについても、ほほ98---

99%で各段階の反応が進行したことがわかった。

(オリゴヌクレオチドの精製)

DNA自動合成装置内での反応後、 280/0のアンモニア水で、 550Cで一晩処理することにより、回相担体からの切り出し、及び脱保護反応を行った。

これを逆相HPLCにより精製した。図3-6の( a)に、代表してオリゴヌクレオチド7についてのクロマトグラムを示す(保持時間22分のピークを分取)。

この段階では、まだオリゴヌクレオチドの5'-末端にはDMTr基が存在する。このDMTr基を除去するために、次に、 80 %の酢酸水溶液で20分間処理した。これを逆相HPLCにより精製した。図3-6の(b)にクロマトグラム

を示す(保持時間8分のピークを分取)。

-69-

(9)

(a) ''EE、、 hu 、‘‘，，，

----健J

s司

1官ー L8・

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29- 29-

25- ziv 内，‘ --

39- 39-

35- 3!J-

、‘，/n m f'k 、ljn m r''k

図3-6 オリゴヌクレオチド7の逆相HPLCクロマトグラム ( a)回相担体からの切り出し後 (b)脱トリチル反応後

カラム: LiChrospher.100RP-18(e) (Cica-MERK) j答離液A: O.lM TEAA緩衝液(pH7.0)

j容離液B: アセトニトリル

グラジエント: 30分間でBを10→40%

流速 1ml / min 検出: ^UV(260nm)

(ストック溶液の調製)

精製したオリゴヌクレオチドを200μlの蒸留水に溶解し、数mM程度のストック溶液を作成した。各オリゴヌクレオチドについて以下のように吸光係数εを算出し、吸光度から各ストック溶液の濃度を決定した。

一吸光係数の算出一

l本鎖DNAをN 1 N2 N3 -一一- Nn・1 Nn と表すと、そのDNAの中性条件下での260nmにおける吸光係数εは以下のように表される。

ε= 2(εNIN2 +εN2N3 +一一一ー +εNv-IN) -εN2 εN3 一一一一εNv-I

ここで、 εNV-INvは隣り合った2つのヌクレオチド(ジヌクレトチド)の吸光係数であり、 εNv-Iはモノヌクレオチドの吸光係数である。各吸光係数については文献値を参考にした32)0

-70-

(10)

3-2-2

イミノ二酢酸修飾ピリミジン7量体(4 )の合成

以下のようなスキームに従い、オリゴヌクレオチド4を合成した。

EtOOC一、

NH EtOOCーノ

8

9 ⁺

+ BrCH2COOH N(CH2CH3)3 EtOOC一、、NーノCOOH

+ DCC

。

EtOOC-ー/

8

。 EtOOC -一\一〈一n

O N一

�

N -C EtOOCーノ ^H

。 9

H2N²

�

^，，_

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^P-G₁₁ ^一一-^TTTTTTT

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NaOH

7 OH

H {

EtOOCー'"_{N' 'C}

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... .. ... 'O-P-O 一一一 TTTTTTT

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EtOOCーノ (

o 0

10

H (

OH

HOOCー'"_{N ' 、C '}

_/'..，._ ん‘入? - 5・

" ... 、O-P-O一一一TTTTTTT HOOCーノ o 又 0

4

3-2-2-a

ニトリロ三酢酸ジエチルエステル(8 )の合成

EtOOC一、

NH EtOOC_/

+ BrCH2COOH

N(CH2CH3)3 _{EtOOC一、、} _...COOH EtOOC_/N-'

8

ブロモ酢酸2.78g(2 0mmol )、イミノ二酢酸ジエチルエステル3.78 g (20mmol)及びトリエチルアミン2.23g(22mmol)をエタノール40mlに溶解し

た。 600Cに加熱して4時間撹祥を続けた。加熱撹持後、析出していた白色 -71-

(11)

の結晶をろ別し、ろ液を減圧留去した。残盗にエーテルを加え、不溶物をろ別し、ろ液を減圧留去した。残澄をシリカゲルカラム処理(クロロホルム:メタノール:酢酸= 100 : 10 : 3)により精製し、目的物を得た。化合物の同定はlH-NMR測定により行った。

収量(収率)

3.2g (65%) 性状黄褐色粘性液体

lH-NMR (CDCl3， 250MHz)

S値帰属

積分比分裂 4.20 c 4.3H q J=6.7 。

':l b 'ïj

_ _�. _�

3.62 b 3.7H S

HOOC

人N

^{f C - OCH}^2CH3

3.55 a 2.0H s '\.ーÇ-OCH2CH3

b ¹¹

1.30 d 6.0H t J=6.7 LJ 0 _c _d

3-2-2-b

スクシンイミドエステル(9 )の合成

EtOOC一" _COOH Nーノ +

EtOOC_J 8

OKν。

DCC

o

EtOOCー" ...-... ム_N' _._{C - -N 、y}

人

EtOOC

J S ふJ

9 0

化合物81 .48g( 6.0 m m ol )とジシクロヘキシルカルボ、ジイミド

(DCC)1. 36g(6 .6mmol)を溶解した20mlのD MF溶液に、撹持下N-ヒドロキシスクシンイミド0.76g (6.6mmol)を溶解した20mlのDMF溶液をゆっくりと滴下した。最初2時間は氷浴下で、その後室温で20時間撹祥を続けた。

反応後、析出国体(DCUrea)をろ別し、ろ液を減圧留去した。残盗を酢酸エチルに分散させ不溶物をろ別し、ろ液を水で洗浄した。硫酸ナトリウムで乾燥後、ろ液を減圧留去した。残濯を2 -プロパノールに溶解し、再結晶

ー72-

(12)

させ目的物を得た。化合物の同定はIH-NMR測定、及び元素分析により行った。

収量(収率)

0. 84g (41%)

性状淡黄色針状結晶

融点 63. 5 --- 64. OOC

冗素分析

H C N C/N

実測

値

^5.82 ^48.76 ^8.08 ^6.03

計算値

^5.87 ^48.82 ^8.14 ^6.00

IH-NMR (CDC13， 250MHz)

Sイ直帰属

^積分比 ^分裂

4.3H q J=6.7 4.20 c

4.06 3.67 2.85 1.28

a 2.0H 4.0H 4.0H 6.0H

S

dH

Hd ハU ハU cH H c c c o o

ouC

CHO bfL a〈 M川 b

。 CHO

。

。は e ρν

b S

e S

d t J=6.7

3-2-2-c

オリゴヌクレオチド(10)の合成(カップリング反応:

EtOOCー" --"- 。 λN' 、C"'--N'o ')

E100CJ 6 レJ

9 0

+

〈ェ

^。-

⁵

^{7 7TT TT3}

7 OH

H (

1

^\ ^0-

EtOOCー"N' 、C'--"- N_...，，-入、O-P-O一一一j' TTTTTTT5・ 3・

EtOOCJ S ら

10

司、d「/

(13)

、、自』，，QノH ny J'『店、、

ゴヌクレオチド70.49μm 01を Na2 C 03・NaHC03緩衝液オリ

この溶液に9を 2 4.5μmol含むO.llmlの (1 .3mM

)

。

O.37 mlに溶解した

室温で一晩振とうさせた。反応混合物を蒸留水で 1 mlに DMSO溶液を加え、

を用いて蒸留水 (Pharmacia Sephadex G-2S)

N AP-l 0カラム希釈した後、

これを濃縮して

保持容量1

^ml--1 .7 mlの部分を分取した。

を溶離液として、

(b)に反応前後のクロマトグラムを示図3-7の(a)、

逆相HPLCで分析した。

王に2つのピークが新た明らかに原料7のピークが減少し、

反応後、

す。

活性エステルこのうち3分付近に出現した成分については、

に出現した。

したがドであることを確認した。

ドロキシスクシンイミ 9が分解したN-ヒ

1 2分付近に出現した原料7よりも疎水性の高い成分が目的物10であ分取した。

ると判断できたので、って、

0.38μmol (77%)

収量 (収率)

-hυ ''a・、、---

Rd 白u Rd 白u cd au 'E.

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マ・4

(a)

---司---

qJV 白U RJv nU Rd nu 1 1 2 2 3

.m .m

カップリング反応前後のオリゴヌクレオチドの逆相HPLCクロマトグラム ( a)反応前(オリゴヌクレオチド7 ) (b)反応後図3-7

カラム LìChrospher 100RP-18(e) (Cìca-MERK) 溶離液A: O.lM TEAA緩衝液(pH7.0)

溶離液B: アセトニトリル

流速 1ml / mìn 検出: UV (260nm)

-74-

(14)

3-2-2-d

オリゴヌクレオチド(4 )の合成(アルカリ加水分解)

H 〆OH

EtOOCー"" .."..._ ん

L

? 5・1

N'、C� ー '-./ 、O-P-O 一一 TTTTTTT

EtOOC..J ら。

10

NaOH

H ( OH

I \ O.

HOOC 一"" .."..._ N 入 ; 5・ 3・

IN'、C� '-./、O-P-O 一一一 TTTTTTT

HOOC-./ ;':" O �

4

20mMのNaOH水溶液 0.5mlに、4 0.18 μmolを含む50μlの水溶液を加え、

室温で2時間放置した。その後、反応溶液に酢酸を加え中和した。反応、溶液にO.lMTEAA 緩衝液を加えて1 m 1とした後、 NAP-I0カラムを用いて 0.1 MTEAA緩衝液を溶離液として、保持容量1 ml --- 1 .7 mlの部分を分取した。

これを濃縮して、逆相HPLCで分析した。

当初、先のカップリング反応物の分析時と同様に、(シリカゲル担体の

逆相カラムである) ODSカラムを用いて分析を行ったのであるが、この場合、反応生成物がほとんど溶出してこなかった。そこで、ポリマー担体の逆相カラムであるODPカラムを用いて分析を行った。その結果、この場合、

反応生成物の溶出が確認できた。図3-8の( a)、(b)に、反応前後のオリゴヌクレオチドのクロマトグラムを示す。反応後、明らかに原料のピークが消失し、7 分付近に新たなピークが確認できた。この原料よりも親水性の高い新たな成分が目的物4であると判断できたので、分取した。

収量(収率) 0.15μmol (82%)

-75-

(15)

fし「川J，---司----』---e----『、‘，J (b)

S 8 5 8

5

'A -A 内，ゐ

つ-

アルカリ加水分解反応前後のオリゴヌクレオチドの逆相HPLC クロマトグラム ( a)反応前(オリゴヌクレオチド10) (b)反応後図 3-8

カラム: Asahipak ODP・50

j容離液A: o.山'1 TEAA緩衝液(pH7.0) 溶離液B: アセトニトリル

流速 1ml _/min 検出: UV (260nm)

とDNA二本鎖 (4 )

イミノ二酢酸修飾ピリミジン7量体の相互作用

3-2-3

DNA二本鎖や三本鎖の安定性を評価するために一般的に用いられる手法を測定する方法がある。 DNAは二本

m T

その複合体の融解温度として、

その吸収スペク塩基聞のスタッキングにより、

鎖及び三本鎖形成に伴い、

トルにおいて吸光度の減少が観察される。従って、温度を連続的に変化さその際生じる吸収スペクトル変化を特定波長において追跡することにせ

三本鎖の融解及び形成過程を観察することができる。

DNA二本鎖、

より、

を模式的図3-9にDNA三本鎖の温度変化に伴う吸光度変化(

À =260nm)

i1fu が観察される。

(吸光度変化) 2つの遷移

ー76-

に表した図を示す。一般的、

(16)

度上昇に伴う解離過程の場合を考えると、低温側での遷移は、 Hoogsteen 型の水素結合でDNA二本鎖に結合していた一本鎖DNAの解離に基づくものである。高温側での遷移は、より熱力学的に安定な DNA二本鎖の解離に基づくものである。 Tmはそれぞれの遷移の中間点の温度として考えることができる。本研究では、このTmを複合体の安定性の指標として用いた。なお、

Tmは、通常行われているように、融解曲線を微分し、その微分曲線の頂点から見積もった(厳密にはこの温度は「真のJ Tm とは多少異なる)。

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。。円〈

rrmH 温度/OC

図3-9 DNA三本鎖の融解由線の模式図

本研究では、オリゴヌクレオチド4のDNA二本鎖との会合挙動を調べるため、図3-9における低温側での遷移のTm しを使って評価する。そして、ターゲットとなる金属イオン共存下、非共存下において、 TmLを比較するこ

とにより、金属イオンによる(オリゴヌクレオチド4の二量化に基づく) 三本鎖形成制御の可能性について検証する。なお、本研究ではすべて、温度上昇に伴う複合体の解離過程を観察した。

づI勺/

(17)

(DNA二本鎖のハイブリダイゼーション)

DNA三本鎖の形成に先立ち、まずオリゴピリミジン4のターゲットとなるDNA二本鎖(27mer、 28mer、 29mer)のハイブリダイゼーションを行つ

た。ハイブリダイゼーションを確実にするために以下に示すような高塩濃度、高DNA濃度(実際に測定に用いる濃度の100倍)条件下でハイブリダイズさせた。

DNA二本鎖:50μM NaCl:O.5M

HEPES (pH7.5) : O.lM

DNA二本鎖のTmに関しては、経験上以下のような式が導かれており33)、

Naイオン濃度や、 DNAのGC含量、塩基数Nから、おおよその値を見積もることができる。

Tm ニ81. 5 + 16. 6(log，o[Na+]) + 0.41(%G+C) - (600/N)

上式よりこの条件下でのDNA二本鎖(27 mer 、 28mer、 29mer)のTmは 6S0C程度と考えられた。用いるDNAの長さにもよるが、ハイブリダイゼーションの速度はTmよりも15---200C低いところで最大となる。そこで、これらのDNA二本鎖の場合、溶液を500Cで3時間インキュベートし、その後室温に戻してハイブリダイズさせた。

(DNA三本鎖のハイブリダイゼーション)

水溶液中で安定な三本鎖を形成させるためには、 DNA鎖聞の電荷の反発を抑えるためにマグネシウムイオン等の2価金属や、高塩濃度のナトリウムイオンを共存させる必要がある。そこで、マグネシウムイオン等の適当な金属イオン共存下、先に調製した二本鎖のストック溶液を用いて、 ooC、

3時間インキュベートして、 DNA二本鎖とオリゴヌクレオチド4をハイブリ -78-

(18)

ダイゼーションさせた。以下に、安定化剤として、 20m Mのマグネシウムイオンを共存させた場合の測定条件の一例を示す。

DNA二本鎖: 0.5μM

オリゴヌクレオチド4 : 1μM MgC12 : 20mM

NaCl: 5mM

HEPES (pH7. 5) : 1 mM

なお、オリゴヌクレオチド4のターゲットとなる金属イオン、すなわち、

4を二量化させるための金属イオンとしては、 Cu(II)やFe(III)、ランタノイドイオンを用いた。これらの金属イオン共存下での測定では、溶液に目的の金属イオンを0.5 μM 共存させて、同様にインキユベーションした後に、

測定を行った。

(結果)

まず、ターゲットとなる金属イオン非共存下で、オリゴヌクレオチド4 とDNA二本鎖を含む溶液の融解曲線の測定を行った。様々な条件で測定を

行ったのであるが、 DNA二本鎖の解離に基づく吸光度変化が観察されるのみで、 4の解離に基づく吸光度変化は、観察できなかった。

次に、銅イオンなどのターゲットとなる金属イオンを共存させて、様々な条件で測定を行ってみた。その結果この場合も、 4の解離に基づく吸光度変化は、いずれのDNA二本鎖(27mer、 28mer、 29mer)を用いた場合も観察できなかった。図3 -10に、代表して、 MgCh 20mMの条件下で、ターゲットとなる金属イオンとしてCu(II)を共存させた場合の融解曲線の測定例を示す。

このように、 4は通常の測定条件下では、 DN A二本鎖と安定な複合体 (DNA三本鎖)を形成することが難しいと判断できた。このような状況下

では、金属錯形成を通じた4の二量化に基づくDNA三本鎖形成の制御の可能性について、検討することは実質不可能であると考えられた。

ー79-

(19)

8.0

6.0

4.0

2.0

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0.26 0 ー0.2

70 80 40 50 60

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30

ハU 20

0.26 0

の複合体の融解曲線(実線) 及びそれらの微分曲線(点線)

(a) 27 mer， (b) 28mer， _(c) 29mer

4: 1μM，DNA二本鎖: 0.5μM， CuCh: 0.5μM， MgCb: 20mM， NaCl: 5mM， HEPES(pH7.5): 1mM 温度変化速度:0.50C/min，検出波-長: 260nm

28mer、 29mer) Cu(II)共存下における4とDNA二本鎖(27mer、

図3-10

(20)

3-2-4 まとめ

ここでは、 DNAオリゴヌクレオチド4の合成、及び4とDNA二本鎖との相互作用について述べた。末端にイミノ二酢酸部位を有するオリゴヌクレオチド4は、オリゴヌクレオチド7と活性エステル9を反応させ、その後、

エチルエステル部位をアルカリ加水分解することにより得た。活性エステル9については、満足のいく収率で、高純度のものが得られた。また、オリゴヌクレオチド7と活性エステル9のカップリング反応、及びその後のアルカリ加水分解についても、高収率で目的物が得られた。カップリング反応及び加水分解反応生成物については、マススペクトル等による同定は特

別には行わなかった。しかしながら、これらの反応条件では、他の反応は考えられず、生成物も基本的にHPLCで単一ピークであることから判断し

て、目的物は得られているものと判断できる。

様々な条件で4とDNA二本鎖の混合溶液の融解曲線を測定したのであるが、いずれの条件においても、 DNA三本鎖の形成は確認できなかった。 4 の塩基数が7とかなり短すぎたため、安定な複合体を形成できなかったものと考えられる。この7塩基という鎖長については、できるだけ短い鎖長の方が二量化した際の効果が現れやすいのではないかと判断して選択した(この7塩基という鎖長は、過去の研究例25)・34)から判断して三本鎖の形成が確認できるギリギリのレベルである予想された)。しかし、オリゴヌクレオチドへの末端修飾が三本鎖複合体の安定性に影響したせいか、複合体は観察できなかった。

-81-

(21)

3-3

イミノ二酢酸修飾ピリミジン14量体(その1)

前節では、イミノ二酢酸修飾ピリミジン7量体4を用いて検討を行ったのであるが、その鎖長が短すぎたために DNA三本鎖の形成が確認できず、

金属錯形成を通じたオリゴヌクレオチドの二量化の効果を検討することはできなかった。そこで、ここでは塩基数を2倍にしたイミノ二酢酸修飾ピ

リミジン14量体5を合成し、そのDNA二本鎖との相互作用を検討した。

H (' _OH

I I 0・

HOOC一"" /".... _

N‘ 人 í

_5' ^3'

N -

-C� ""'" -0 -P-O一一一 TTTTTTTTTTTTTT

HOOC-d/ l!- . 1!

5 -

オリゴヌクレオチド5のターゲットとなるDNA二本鎖としては、図3 -11 に示すような41mer、 42mer、 43merを新たに合成した。これらのDNA二本

鎖は先ほどと同様に、その配列内に5の結合サイトとなる連続したアデニン配列をそれぞれ2箇所有している。その連続したアデニン配列の聞には、

1、 2、 3塩基ほど余分な塩基を導入した。

5'-CTGGACTTTTTTTTTTTTTTGAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3'

41mer

3'-GACCTGAAAAAAAAAAAAAACTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5'

_ 5'-CTGGACTTTTTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3'

42mer

- 3'-GACCTGAAAAAAAAAAAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5'

43mer 5' -CTGGACTTTTTTTTTTTTTTGCGAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3 ' 3'-GACCTGAAAAAAAAAAAAAACGCTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5'

図3 -1 1 5のターゲットとなるDNA二本鎖

オリゴヌクレオチド5の合成は、 4の合成法に準じて行った。なお、 DNA 二本鎖4 1 mer、 42mer、 43merを構成するオリゴヌクレオチドの合成では HPLCで精製するに際に、これらが高次構造を形成するのを避けるために、

カラム温度を上昇させ、 500Cで精製を行った。

ー82-

(22)

3-3-1 イミノ二酢酸修飾ピリミジン14量体行)とDNA二本鎖の相互作用

3-3-1-a 測定条件の検討

まず、ターゲット(二量化の制御因子)となる金属イオン非共存下において、オリゴヌクレオチド5の DNA二本鎖との三本鎖形成能を評価した。

DNA二本鎖としては、 42merを用いて検討を行った。 5と42merを含む溶液の融解曲線を測定したところ、明らかに5の解離に基づく吸光度変化が観察され、三本鎖複合体の形成を確認することができた。

図3-1 2 の(a)に、三本鎖複合体を安定化させる(DNA鎖聞の反発を抑える ) ために20mMのMgCbを共存させて測定を行った場合の融解曲線を示す(こ

の測定条件は、先の4についての検討における図3-10に相当する条件である)。図3-1 2の(b)には、同一条件で42merのみの融解曲線を測定した結果を示す。これより、図3-1 2の(a) では明らかに42merの解離に基づく吸光度

変化の他に、低温側に5の解離に基づく吸光度変化が観察できる。

ただ、図3-12の条件では、三本鎖の形成は確認できるものの、その微分曲線からわかるようにTmが低すぎて複合体の安定性を正確に評価することができない。そこで、より安定な三本鎖複合体が形成されるような測定条件を検討した(図3-13，14)。

まず、 MgC12濃度を50mMに増大させて測定を行った(図3-13)。その結果、複合体の安定性が増大し、 Tm は180C程度と評価できた。ただ、高濃度のMg(11)の使用は、本研究目的にはあまり適していないと考えられるo Mg(II)とイミノ二酢酸の会合定数は、本研究でターゲットとしているCu (11) やFe(111)等の遷移金属イオンのそれと比べるとオーダー的にかなり低くいのであるが、測定条件ではかなりの高濃度の Mg(11)を共存させるため、目的とする金属イオンとイミノ二酢酸の会合をMg(11)が阻害する可能性が十分考えられる。そのため、本研究ではMg(11)の使用はできるだけ避けたい。

-83-

(23)

己〉\仏、円(H-C

凶)

1.4

1.2

ハU-EEA

0.8 0.6 0.4 0.2

(a)

0.50

どミ0.45

0.40

0.35 0

己〉\(目、叶(〉ハ-()凶)

0 80

1.4

0.2

nu --A

1.2

0.6 0.8

0.4 70

50 60

温度tc

40 20 30

10

、、Ej'hu 〆's・‘、、口AU「3nu

0.36

0.34

0.32

0.30

0.28

。沼N〈

。 80 70 40 50 60

温度tc

20 30 10 0.26

0

42mer(b)の融解曲線及び微分曲線 5: 1μM， 42mer: 0.5μM， NaCl: 5mM， MgC12: 20mM， HEPES(pH7.S): 1mM 温度変化速度:O.SoC/min，検出波長:260nm

5と42merの複合体(a)、

図3-12

-84-

(24)

(円〉\仏、吋(H-O

凶)

1.4 1.2 1.0

0.6 0.8

0.4 0.2

， .・. . . ，・ . . ・ ' . ・ . ・ . a ・ . .

- . ・

. . . . . . . . . . - . . e

， .

0.55

0.50

5

^{0 45}

0.40

0 80 70 40 50 60

温度tc

20 30 10 0.35

0

(M g Clz 5 0m M) 5: 1μM， 42mer: 0.5μM， NaCI: 5mM， MgC12: 50mM， HEPES(pH7.5): 1mM 温度変化速度: 0.50C/min検出波長: 260nm

0.38 0.36

(】〉\〔日叶(M-O

凶)

8.0 7.0

6.0 5.0

2.0 1.0 4.0 3.0

5と4 2m erの複合体の融解曲線及び微分曲線

0.46 0.48

0.44

0.42

、。Cコ

<t. 0.40

図3-1 3

0 80 70 60 40 50

20 30 10 0.34

0

温度tc

(N aCl 2 M) 5: 1μM， 42mer: 0.5μM， NaCl: 2M， HEPES(pH7.5): 1mM

温度変化速度: 0.50C/min，検出波長: 260nm

5と4 2merの複合体の融解曲線及び微分曲線

図3-14

-85-

(25)

そこで、次に三本鎖DNAを安定化させるために、高塩濃度のNaClを使用して測定を行った。

図3 - 14に、 2MのNaCIを加えて融解曲線の測定を行った結果を示した。

この場合、三本鎖のTmは先ほどよりもさらに上昇し、 300C程度と評価できた。このように高濃度のナトリウムイオンを用いれば、十分に三本鎖安定化することができることがわかった。ただ、この高濃度のNaCIの使用にも問題がないわけではない。というのは、高濃度のNaCIを加えると結果的に高濃度の塩素イオンが系内に共存することになる。この塩素イオンはCu (II)

等のいわゆるHややソフトなH金属イオンと多少の親和性を有するため、目的とする金属イオンとイミメ二酢酸との錯形成を阻害する可能性が考えられる。そのため、ナトリウムイオンのカウンターイオンとしては、配位能力が実質ないと考えられる過塩素酸イオンや硝酸イオンが望ましい。

そこで、実際にNaCIの代わりにNaCI 04やNaN03 を共存させて測定を行ったのであるが、結果的に両者とも本研究には使えないことがわかった。

まずNaN03については、 DNAの最大吸収波長領域に吸収を有しており、融解曲線の測定が不可能であることがわかった。また、 NaCI04については、

融解曲線の測定は可能なのであるが、三本鎖DNAを安定化する能力をほとんど有していないことがわかった。

以上のような検討から、本研究では多少の問題はあるが、高濃度のNaCl を用いて三本鎖DNAを安定化させ、融解曲線の測定を行うことにした。

3-3-1-b

複合体の安定性に及ぼす金属イオンの効果

次に、ターゲットとする金属イオンを共存させて、オリゴヌクレオチド 5とDNA二本鎖の複合体の融解曲線を測定し、 5の二量化に基づく複合体の安定化効果が観察できるかどうかを調査した。金属イオンとしては、Cu(II)、

-86-

(26)

Fe(111)、及びLu(111)を使用した。

(Cu(II)の添加効果)

まず、 Cu (11)共存下において、 5とDNA二本鎖の複合体の融解挙動を検討した。 DNA二本鎖として41mer、 42mer、 43merを使用し、 Cu( 11)共存下、

非共存下における融解曲線を測定した。その結果、いずれのDNA二本鎖を用いた場合も、 Cu(I1)共存下、非共存下でほとんど融解曲線に違いは観られず、本実験条件下においてはCu (11)は複合体の安定性に影響を及ぼさないこヒがわかっ?こ。

これについては先述したように、 Cu(I1)が、系内に大過剰に存在する塩素イオンによってマスクされてしまい、 5のイミノ二酢酸部位と十分に錯形成できなかったことが原因として考えられる。

(Pe(III)の添加効果)

イミノ二酢酸と高い親和性を有し、 Cu(I1)の場合のように、塩素イオンとの親和性があまり問題にならない Fe(111)を使用して検討を行った。その結果この場合も、 41mer、 42mer、 43merのいずれのDNA二本鎖、を使用した場合においても、 Fe(111)共存下、非共存下でほとんど融解曲線に違いは観

られなかった。

これについては、 Fe(OH)3の溶解度積定数Ks pが関係しているのではないかと考えられた。すなわち、 Fe(OH)3のKs pは1x10-36とかなり小さく、本測定条件下においては溶液内に加えられたFe(I11)の大部分はイミノ二酢酸と錯形成せずにFe(OH)3として沈殿してしまった可能性が考えられる。

(Lu(III)の添加効果)

次に、ランタノイドイオンのlつであるLu(I11)の添加効果を検討した。

図3-15の(a)、 (b)、 (c)に、それぞれDNA二本鎖として 41mer 、 42mer、

43merを使用した場合のLu(111)共存下、非共存下における融解曲線を示す。

(27)

2.0 0.41 (a)

0.40 0.39

0.38

f ^s⁰³⁷

0.36 0.35

0.34 II I I II II I ^I II ^I 0

o 10 20 30 40 50 60 70 80

温度(C

、.、』j'hu 〆'EE‘.、、

2.0 0.41 (c)

2.0

1.5

ロ〉ー

、、、

1.0角 0.38 〆〉'ー4、、

ト・4

、、ーCノtコ;) 0.37 0.5

0.35

o 10 20 30 40 50 60 70

温度(C

1.5

1.0

0.5

0.36 目目目目 I! ^II ^{! I}J J 11' I ， I I 1 I 10

o 10 20 30 40 50 60 70 80

温度(C

図3-15 Lu(III)共存下(点線)、非共存下(実線)における5とDN A二本鎖(41mer、 42mer、 43mer) の複合体の融解曲線及びそれらの微分Illl線

(a)41mer， (b)42mer， (c)43mer

5: 1μM，DNA二本鎖: 0.5μM， LuCb: 0.5μM， NaCl: 2M， HEPES(pH7.5): 1mM 温度変化速度: 0.50C/min検出波長: 260nm

1.5

1.0

0.5

(28)

表3-1 Lu(田)共存下、非共存下における5とDNA二本鎖の複合体の融解温度Tm CC)、及び融解温度差6. Tm

融解温度Tm CC)

Lu(Ill)非共存下 Lu(III)共存下ムTm 41mer

42mer 43mer

00 ハU OAU つ- 1d っ“

2 3 1

勺コ司、J 2J

A斗・

「コ勺コ

表3-2 Tma)おけるLu(III)共存下、非共存下での吸光度A、

及び吸光度差ムA

吸光度A

Lu(皿)非共存下 Lu(田)共存下ムA

41mer 0.3666 0.3599 0.0067

42mer 0.3772 0.3599 0.0035

43mer 0.3867 0.3834 0.0033

a) Lu(皿)非共存下での各複合体のTm

この場合、 Lu(I II)の添加によって融解曲線に明らかな変化が生じた。各融解曲線を微分し、微分曲線の頂点から、三本鎖複合体のTmを見積もった。

その結果を、表3-1にまとめて示す。 4 2m er、 4 3m erについては、 Lu(III)の添加によって、 Tmが約30C上昇し、 41m e rについては、約40C上昇した。いずれの場合においても Lu(III)の添加によって複合体の安定性が増大することがわかった。

ここで、 Tmは各融解曲線を微分し、その微分曲線の頂点から見積もったのであるが、各微分曲線の頂点の判別が難しいため、微妙な温度差を議論することは困難であるように思われた。そこで、 L u(III)による安定化の効果を評価するパラメーターとして淡色効果の大きさを利用した。すなわち、

ある温度おけるLu(III)共存下、非共存下における吸光度の差を安定化の尺度として捉えてみた。その温度としては、各複合体におけるLu(III)非共存下におけるTmを採用した。その結果を表3-2にまとめて示す。このよう評価法をとった場合、 DN A二本鎖として 41m e rを使用した場合の吸光度変化

-89-

(29)

41m erを使用した場合に Lu(111)による大きな安定化が得られたと考えることができる。

が、他と比べると極めて大きいため、

ここで観察されたLu(111)による安定化効果が何に基づくものであ次に、

以下いくつかのコントロール実験を行った。まず、

るかを調べるために、

をオリゴヌクレオチド5のイ℃わりにのような未修飾のチミン14量体(T14)

同様の測定を行った。

用いて、

5'-TTTTTTTTTTTTTT-3'

T14

非共存下におけるT14と43merの複合体の融 Lu(111) 共存下、

図3-1 6に、

Lu(111)のこの場合、融解曲線は、

及びそれらの微分曲線を示す。

解曲線、

図3-15で観察されこのことから、

添加によって全く影響を受けなかった。

たLu(111)による安定化効果は、 5のイミノ二酢酸部位とLu(111)の錯形成に基づくものであると考えられる。

(】〉\丘、叶(凶円。凶)

2.0

ハU・1A

1.5

0.5 0.42

0.4

ぷ

^0.39

0.41

0.38

0.37

0.36 0

0 70 80 60 40 50

30

-IA ハU 20

温度rc

Lu (111)共存下(点線)、非共存下(実線)におけるT14と43merの複合体の融解曲線、及びそれらの微分曲線

T1 4: 1μM， 43mer: 0.5μM， LuCb: 0.5μM， NaCl: 2M， HEPES(pH7.5): 1mM 温度変化速度: 0.50C/min検出波長: 260nm

図3-16

-90-

(30)

以下のような 5の二量化に基づく安定化効果を検証するために、

次に、

その配列内に5の結合部この26merは、

を合成した。

(2 6mer) DNA二本鎖

5の二量体としての結合は不可能であ位をl箇所しか有していないため、

る。

5'-CTGGACAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3' 3'-GACCTGTTTTTTTTTTTTTTGτ'CCAG-5 '

26mer

非共存下において測 Lu(I11)共存下、

5 と2 6merの複合体の融解曲線を、

これより求めたTm及び淡色効果また、

その結果を図3-1 7に示す。定した。

Lu (111)による安定化の程度は、

この場合、

の程度を表3 - 3にまとめて示す。

先の42merとについても、

(i1 A) 淡色効果の程度

また、

L1 Tmについても、

先の41 merと5の

、�

..._ー

したカぎって、

(]〉\己、吋(H-O凶)

2.0

l.5

1.0

0.5

このことカ、ら、

複合体に対するLu(111)の効果が特異であると考えられる。

。。J

43merを用いた場合とほぼ同じであった。

0.5

0.49

0.48

0.47

0.46

0.45

0 80 0.44

0 10 20 30 40 50 60 70

における5と26merの複合温度tc

Lu(I11)共存下(点線)、非共存下(実線) 体の融解曲線、及びそれらの微分曲線

5: 1μM， 26mer: 0.5μM， LuCb: 0.5μM， ^NaCl:2M， HEPES(pH7.5): 1mM 温度変化速度: 0.50C/min 検出波長: 260nm

図3-17

-91-

(31)

表3-3 Lu(I11)共存下、非共存下における5と26merの複合体の融解温度Tm(t) 及び融解温度差ム Tm、並びにTma)おける吸光度A及び吸光度差ム A

融解温度 Tm CC)

Lu(皿)非共存下 26

吸光度 A 0.4618

a) Lu(111) 非共存下での各複合体のTm

Lu(III)共存下 29 0.4585

ムTmあるいはムA 3

0.0033

の現象は L u (I 11)との錯形成を通じた5 の二量化に基づくものであることが示唆される。ただ、安定化の程度がTmから判断すると 2 6mer を用いた場合とそれほど明瞭な差がないことから、 5は、錯形成部位における立体障害

等から、完全に二量化するに至っていないのかもしれない。

なお、 2 6merや42mer、 43 merにおいて観察されたL u(11 I)による安定化は、

主にLu(I1 1)との錯形成に基づく5のイミノ二酢酸部位におけるプラス荷電の増加によるものではないかと考えられる。

3-3-2 まとめ

ここではイミノ二酢酸修飾オリゴヌクレオチド5とDNA二本鎖との相互作用について検討した。前節の7量体のオリゴヌクレオチド4の場合、三本鎖複合体の形成は確認できなかったのであるが、 14量体のオリゴヌクレオチド5の場合、複合体の形成を確認することができた。また、融解曲線を測定するための溶液条件の検討も行った。その結果、本研究目的には、

高濃度のNaClを用いて三本鎖 DNAを安定化させるのが適当であると考えられたので、以下、そのような条件で融解曲線の測定を行った。

C u (11)、 Fe(III)、 Lu(1I1) が複合体の安定性に及ぼす効果について検討を行った。 c u (11)、 Fe(I II)については、複合体の安定性に全く影響を及ぼさ

ないことがわかった。一方、 Lu( I I1)については、複合体を安定化させるこ - 92-

(32)

とがわかった。 Lu(111)は典型的なハードな金属イオンであるため、 Cu (1 1) の場合のような塩素イオンとの親和性についての問題は無視できる。また、

Lu(OH)3の溶解度積定数Ks pは1x10・27と3価の金属イオンとしては異常に大きな値であるため、 Fe(111)の場合のように水酸化物として沈殿する可能性もほとんどないと考えられる。このような要因から、 Lu(111)の場合にお

いてのみ複合体の安定化が観察されたものと考えられる。

41 merと5の複合体については、 Lu (111)添加による淡色効果の程度が他の系と比べて大きかったことから、 5が二量体として協同的に41merに結合している可能性が示唆された。これについては、 CPKモデルから、 5が二量化した際のリンカーの長さとしては、 l、 2塩基程度が適当であると考えられたことからも納得のできる結果である(41merはその配列の中心に 1塩基ほど余分な塩基を有している)。ただ、 Lu(111)添加に伴うTmの増加の程度は、他の系とそれほど差がなかったことから、 5は、 41mer上でLu(1 11)

との錯形成を通じて完全には二量化するに至っていないと考えられた。 5 については、イミノ二酢酸部位とヌクレオチドをつなぐリンカーの長さが短く剛直であるため、コンフォメーション的な自由度が小さい。そのため、

2つのイミノ二酢酸部位が同時にLu(1II)に十分に配位できるようなコンフオメーションがとれないことが原因で、完全な二量化には至らなかったのではないかと考えられる。

-93-

(33)

3-4 イミノ二酢酸修飾ピリミジン14量体(その2)

前節では、オリゴヌクレオチド5とDNA二本鎖との相互作用について検討を行った。その結果、 Lu(IJI)共存下、 5は二量体として協同的に41 mer に結合することが示唆された。しかしながら、その協同性は、複合体のTm にはほとんど反映されておらず、満足のいくものではなかった。これについては、 5のイミノ二酢酸部位とヌクレオチドをつなぐリンカ一部位の剛直性に問題があるのではないかと考えられた。

H HOOCー""

�ん

N � ‘C�

HOOCJ

S

6

0・

o-ro

^--

TTTTTTTTTTTTTT

。

ここでは、リンカ一部位のメチレン鎖を延ばし、その柔軟性を増したオリゴヌクレオチド6を新たに合成し、 DNA二本鎖との相互作用を検討した。

6が金属錯形成を通じて二量化した際の(2 つのオリゴヌクレオチドをつ

なぐ)リンカーの長さとしては、 CPKモデルから3、 4塩基程度が適当であると考えられた。そこで、 6のターゲットとなるDNA二本鎖としては、

以下のような42mer、 43mer、 44merを使用し、 6との相互作用を検討した (42nler、 43mer、 44merは、それぞれ中心に2、 3、 4塩基ほど余分な塩基を有する)。

42mer 5' -CTGGACTTTTTTTTTTTTTTGCAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3 ' 3'-GACCTGAAAAAAAAAAAAAACGTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5'

43mer 5' -CTGGACTTTTTTTTTTTTTTGCGAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3 ' 3 '-GACCTGAAAAAAAAAAAAAACGCTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5 ，

�rner 5 '-CTGGACTTTTTTTTTTTTTTGACGAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3 ，

3'-GACCTGAAAAAAAAAAAAAACTGCTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5'

オリゴヌクレオチド6は、図3- 1 8に示すような末端にアミノ基を有するオリゴヌクレオチドから、 4の合成法に準じて合成した。この末端にアミ

-94-

(34)

ノ基を有するオリゴヌクレオチドはDNA自動合成装置により、ホスホアミダイト法により合成した。 5'末端へのアミノ基の導入にあたっては、図3-

1 8に示すようなアミダイト試薬を使用した。

H2N 0-十0一一TTTTTTTTTTTTTT

^O'⁽ ^S' ^3'

0

末端にアミノ基を有するDNAオリゴヌクレオチド

F3CyN H

O アミダイト試薬

。人人

NC�人

図3-1 8 末端にアミノ基を有するDNAオリゴヌクレオチド(6の合成前駆体)及びその合成に使用したアミダイト試薬

3-4-1 イミノ二酢酸修飾ピリミジン14量体(6 )とDNA二本鎖の相互作用

3-4-1-a 複合体の安定性に及ぼす金属イオンの効果

先のオリゴヌクレオチド5を用いた検討では、金属イオンとしてLu(III) を用いた場合に複合体の安定化が観察された。そこで、ここではLu(III)を中心としていくつかのランタノイドイオンを用いて、それらが、オリゴヌクレオチド6とDNA二本鎖の複合体の安定性に及ぼす効果を調査した。

(Lu(III)の添加効果)

まず、 Lu(IIl)の添加効果を検討した。図3-1 9に、 Lu(III)共存下、非共存

(35)

2.0

1.5

1.0

0.5

0 80 70 30 40 SO 60

温度tc

20 10

ω一 nu

0.41 2.0

1.5

1.0

0.5

70 60 30 40 SO

温度tc

20 10

、lノー。

/11\

「ノ』A『

nU

0.41

。司〉

、、、

1.0叶巳ー

〆'ー、、

><

ト_.o _w

、、_"

0.5 2.0

1.5

0 80 60 70

30 40 SO

温度tc

20 10

\Eノa

バ叶ハU f'\

0.35 0 0.4

0.39

cuJ

0.37

0.36

ー巾va'

44mer) 43mer、

における6とDN A二本鎖(42mer、

の複合体の融解曲線及びそれらの微分山線 (a)42mer， (b)43mer， (c)44mer

6: 1μM，DNA二本鎖: 0.5μM， LuCb: 0.5μM， NaCl: 2M， HEPES(pH7.5): 1mM 温度変化速度:0.50C/min，検出波長: 260nm

(実線) 非共存下

Lu (111)共存下 (点線) 図3-19

(36)

表3-4 Lu(ill)共存下、非共存下における6とDNA二本鎖の複合体の融解温度Tm CC)及び融解温度差ムTm

融解温度Tm CC)

Lu(皿)非共存下 Lu(ill)共存下ムTm 42mer

43mer

00 勺/

1i ウん勺んつ臼

2 1 1

1d 勺コ

「コ

A斗バ斗T

噌''A ハU

44mer

下における6と DNA二本鎖 (4 2 me r、 4 3 mer、 44mer)の複合体の融解曲線を示す。いずれの DNA二本鎖、を用いた場合もLu(III)の添加によって、融解曲線が大きく変化した。各融解曲線を微分し、各複合体の融解温度 T mを見積もった。その結果をまとめて表 3-4に示す。いずれの複合体についても

Lu(III)の添加によって明らかにTmが上昇し、その安定性が増大することが

わかった。特に、 6と44mer の複合体については、 Lu (III)の添加によって

Tmが約100C上昇し、大きな安定化が観察された。この安定化効果は、 6の二量体としての協同的な結合に基づくものであると考えられる。これについては、 Lu(III)共存下における(融解曲線の)微分曲線が非共存下のものと比較すると、極めて鋭くなっていることからも推測される(微分曲線の

鋭さは2つのオリゴヌクレオチドの協同的な結合の指標となり得る)。

次に、図3-19で観察されたLu(III)添加による安定化効果が、 6の二量体としての協同的な結合に基づくものであるということを裏付けるために、

コントロール実験を行った。具体的には前節で行ったように、 DNA 二本鎖として以下のような 2 6 merを使用して、同様にLu(III)の添加効果を検討した。

26mer 5'-CTGGACAAAAAAAAAAAAAACAGGTC-3' 3'-GACCTGTTTTTTTTTTTTTTGTCCAG-5'

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(37)

(円〉\仏、円安-cu) 2.0

1.5

0.5 1.0 0.5

0.49

0.48

ぷ

Cコ ^0.47

0.46

0.45

0 80 60 70

40 50

温度tc

20 30 10 0.44

0

Lu(III)共存下、非共存下における6と26merの複合体の融解曲線、及びそれらの微分曲線

図3-20

6: 1μM， ^26mer:0.5μM， LuCb: ⁰_._5μM， ^NaCl:2M， HEPES(pH7.5): ^lmM 温度変化速度: 0.50C/min，検出波長:260nm

非共存下における6と26merの複合体の融解 Lu(III)共存下、

図3-20に、

Lu(III)は複合体の安定性にほとんど影響を与えなこの場合、

曲線を示す。

図3-1 9で観察されたLu(III)添加による安定化効果このことから、

かった。

6の二量体としての協同的な結合に基づくものであるということが確認できた。

が、

(その他のランタノイド金属イオンの添加効果)

同様に複合体の Lu(III)だけでなくイ也のランタノイドイオンについても、

La(III)、

ランタノイドイオンとしては、

安定性に及ぼす効果を検討した。

各金属イオン共存下における6と図3-21、

Tb(III)を使用した。

、、、B，ノyaA YEyti r，，、、HU R・μ

(図には、併せて金属イオン非 Lu(III)共存下におけるデータも示している)

43merの複合体の融解曲線をまとめて示す

共存下、。これより、 La(III)、

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(38)

表3-5 ランタノイドイオン共存下、非共存下における6と43merの複合体の融解温度 Tm CC)及び融解温度差ムTm

Tm CC) ムTm

none 27

La(皿) Eu(皿) Tb(III)

Lu(II1)

00 ハU 噌l tI 勺L qd 弓3 2J

1i 司3 A『

バH.

表3-6 ランタノイドイオンとイミノ二酢酸の会合定数(文献値28))

会合定数(log^KML)

La(皿) 5.88

Eu(皿) _6.73

TbロII) 6.78

Lu(II1) 7.61

Eu(111)、 T b(111)についても明らかに複合体の安定性に影響を及ぼすことがわかった。各融解曲線を微分し、各複合体のTmを見積もった。図3-22に図3-21の各融解曲線の微分曲線を、表3- 5に、各複合体のTm値をまとめて示す。いずれのランタノイドイオンを添加した場合も、複合体のTmは上昇し、これらの金属イオンも複合体を安定化させることがわかった。安定化の程度は、 L a(111)< Eu(111)< T b(111)の順に大きくなった。ここで得られた安定化の序列は、各金属イオンとイミノ二酢酸の親和性を反映したもので

あると考えられる(表3-6) 。

次に6 と44merの複合体についても同様に、 La(I 11)、 Eu (111)の添加効果を検討した。図3-23と3-24に、各金属イオン共存下における融解曲線、及びそれらの微分曲線をそれぞれまとめて示す。また、各複合体のTmを表3- 7にま

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