博 士 （ 医 学 ） 金 内 優 典
学位論文題名
Induction of apoptosis by the p53‑273L (Arg ‑ Leu) mutant in HSC3 cells without transactivation of p21Wa ． fl/Cipl/Sdil and bax
（
p 53−
273L(Arg→Leu) 変異株のHSC3 細胞における
p21Wan/Cipレ
Sdilおよび
baxの転写活性化によらないアポトーシス誘導能についての研究）
学位論文 内容の要旨
I
．緒言
p53
遺伝子のコドン273 における変異は，実際にヒト癌細胞でしばしば見いだされ，ホットス ポッ トのー っと 認識 され ている ．我 々は
6種 類の コド ン273 変 異株の 機能 解析 を行い，p53‑
273 L(Arg
うLeu ）は配列特異的転写活性化能を失っているにもかかわらず，細胞増殖を抑制し うることを明らかにした，そこで，この変異型p53 −273L の細胞増殖抑制能の本態を明らかにす るために，野生型p53 ，変異型p53 −175H(Arg →
His）あるいはp53 ‑273L を各々導入したHSC3 細 胞株を樹立し，導入遺伝子をZnz ゛で誘導することにより各p53 遺伝子の細胞内での転写調節能 や細胞増殖に与える影響について検討した．
II.
材料と方法
（1 ）プラスミド及びブ口一ブ
野生型
p5 3(pC53‑S N3），変異型p5 3(pC53‑175H ，pC53 −2731) からBamHI 消化により分離さ れた各p5 3cDNA を，2n2 ゛で発現を誘導出来るプロモーターを有するpS V2‑ HMT/Ter ベクター にクローニングし，pSV2 ー
HMT/Ter‑ SN3，‑175H ，−273L を得た.p5 031 ＊ーanti‑p53 はMMT V‑ LTR プロ モー ター 下流に 野生 型p53 cDNA のア ンチ セン スDNA をクローニングして作製した．ヒト
b axプロ ーブ は既知 の塩 基配 列を もとに
PCR法に て増 幅し 作製 した.p53 ，
p21プロ ーブは各
cDNAフ゜ラスミド
(pC53―SN3 ，pcDSRa △‑Sdil ）より調製した．
（2 ）誘導可能な
p53遺伝子を有するHSC3 細胞株の樹立
2x 10
＾個の
HSC3細胞に，各p53 クローン(pSV2 ーHMT/Ter‑SN3 ，
‑17 5H，−273L ）と
p5031゛−
an ti‑p 53
とをりン酸カルシウム法にてコ・トランスフェクトし，G418 （
350ルg/ml) セレクショ ンに て耐 性コ ロニー を分 離した（HSC3/SN3 ，
HS C3/175H，
HSC3/2731).導入p53 遺伝子の発現 はZfi2 十（150 ル
M)存在下でスクリーニングした，
（3 ）ルシフェラーゼアッセイ
2 x10
＾個の
HSC3細胞に，2.5 ルg の
WWP−Luc レポータープラスミドと0.1 ，0.5 ，1 ．
0，2.5 凪
gのpCMV‑Neo Bam （ベクターフ゜ラスミド），pC53‑SN3 ，pC53 −175H ，pC5 3‑273L とを，リン酸カル シウム法にてコ・トランスフェクトし、24 時間後の細胞抽出液における各々のルシフェラーーゼ 活性を測定、比較した．
ー 155 ‑
(4)
ノーザンブ口ットハイブリダイゼーション
40
ルg の
totaIRNAを6.7 ％ホルムアルデヒドゲルで電気泳動後，ナイ口ン膜に転写し，32P でラ ベルしたプ口ーフ(p53 ，p21 ，bax ，p ―ac tin ）でハイブリダイゼーション後，オートラジオグラフ イーを行った．
（5 ）ウェスタンブ口ッテイング
Zn
添加前と添加後12 時間の各細胞株から抽出した蛋白（10 ルg ）を10 ％
PAGEで展開し，二 トロセルロース膜に転写し，一次抗体(PAb1801 あるいはDO −7 ），二次抗体に反応させ化学発光 法にてバンドを検出した．
(6)
細胞増殖曲線
各細胞株の細胞（1xio ＾個）を10 cm ディッシュに播種し，Zn2 ゛存在（100 ルM) 下に5 ％及び0.1
％
FBS添 加
DMEMで 培 養 し っ
48時 間 毎 に 生 細 胞 数 を カ ウ ン ト し 作 成 し た ．
(7)FACS解析及びDNA 断片化の検出
(6)
と同様に培養した細胞を5 ％血清下ではday‑0 とday −6 に，0.1 ％血清下ではday‑0 ，1 ，3 ，5 ，7 に浮遊細胞も含め回収し，propidium iodide(50 ルg/ml) 溶液でDNA 染色を行い細胞周期の解析 を行った．また0.1 ％血清下で得られたサンプルから．フェノール／ク口口ホルム法によって
DNAを抽 出し ジゴキ シゲ ニン 法に てラベ ル後 ．2 ％ア ガ口 ース ゲルに て電 気泳 動しナイ口ン メンブランに転写，化学発光法にてDNA 断片化を検索した，
III
．結果
親株及び樹立した各細胞株を，Zn 添加（150 ルM) 下で培養すると，親株を除き，導入した各
p53遺伝子 は6 時間 後に は既に誘導されており，この誘導は24 時間後にも持続していることが 確認された．ウェスタン法にて親株以外の細胞株において
p53蛋白の誘導も確認された．また 野 生型
p53の発 現に よっ てのみ
p21が誘 導さ れ，
273L，17SH の発現では
p21は誘導されなかっ た
.baxの発現には，どの細胞株においても明らかな変化を認めなかった．ルシフェラーゼアッ セ イに より ，野生 型
p53のみがp21 プ口モーターを転写活性化し，273L 及び175H ではこの機能 を欠いていることが確認された．
これ らの 細胞株 を
5％
FBS，
Zn2十（100 ル
M)下で培養すると，HSC3/SN3 の細胞増殖は親株に 比 ベ 抑 制 され た が ，
HSC3/273Lの 細 胞 増殖 は 親 株 と 同 等 で あ っ た ． しか し
0.1％
FBS下 で は ，
H SC3/175Hの 細胞 増殖 は親 株に比 ベ促 進さ れた のに対し，HSC3/273L では著しく抑制さ れた．
FACS
解析の結果，5 ％FBS ，2n2 ゛（100 ル
M)下では，HSC3/S N3 においてday ―6 におけるGl 分画 の細胞数が
dayー0 に比ベ
30％以上増加していた．親株，HSC3/175H ，
HSC 3/27 3LではGl 分画の 細胞数に変化は認められなかった．一方0.1 ％FBS ，Zn2 ゛（100 ルM) 下では，親株においてday −3 か ら
sub‑G1分画の 増加 が確認されたが，HS C3/S N3 ，HSC3/175H ではsub ―
Gl分画の増加は認 められなかった．しかし，HSC 3/273L では，day‑3 ，5 ，7 と著しくsub −G1 分画が増加していくこと が 確 認 さ れ ，
day‑7で 親 株 の 約
3倍 に 達 し て い た ． ア ボ ト ― シ ス に よ る
DNAの 断 片 化 は
HSC3／
SN3，
HSC3/175Hで は 認 め ら れ な かっ た の に 対 し ， 親 株 で は
day‑5か ら 検 出 さ れ 始 め，HSC3/273L ではday‑3 から著しく生じていることが確認された．
IV.
考察
p53
遺伝 子に よる 細胞 増殖抑 制効 果は その配 列特異的転写活性化能とよく相関すると考え
られている，今回，
Zn2十で誘導可能な野生型p53 ，変異型p53 （‑175H ，−273L) を導入し樹立した
HSC3細 胞 株 を 用 い て ， 変 異型
p53‑273Lが ， 低 血 清 条 件下で はp21 や
baxを 介さな い機 序で
HSC3
細胞に アポトーシスを誘導し，細胞増殖を抑制し得ることを明らかにした．また、野性 型p53 に よる
p21の誘 導は アポト ーシ スを 抑制することも確認された．従ってp53 遺伝子によ るアポトーシス誘導には，配列特異的転写活性化を介さない経路が存在することが示された，
さらに変異型p53 −273L は，実際にヒトの癌で見出される変異でありながらこの経路を活性化
する働きを保持していると考えられた．
学位論文審査の要旨
主 査 教 授 長 嶋 和 郎 副 査 教 授 吉 木 敬 副 査 教 授 藤 本 征 一 郎
学位論文題名
Induction of apoptosis by the p53‑273L (Arg →Leu) mutant in HSC3 cells without transactivation of p21Wa'''Cip'/Sdil and bax
（p 53―273L(Arg→Leu)変 異 株のHSC3細 胞 にお け るp21Wafl/CipレSdil お よ びbaxの 転 写 活 性 化 に よら な い アポ ト ー シス 誘 導能 に つ いて の 研究 ）
p53遺伝子 のコドン273変異株（6種 類）の機 能解析を 行い,p53‑273L(Arg+Leu)は配列特 異的転 写活性化 能を失って いるにも かかわら ず，細胞 増殖を抑制しうることを申請者らは すでに明らかにした．そこで申請者は今回，この変異型p53‑273Lの細胞増殖抑制能の本態を 明らか にするた めに，野生 型p53，変異型p53‑175H(Arg→His)あるいはp53‑273Lを各々導入 し たHSC3細 胞 株を 樹 立 し，導入 遺伝子を2n2゛ で誘導す ることに より各p53遺 伝子の細 胞 内での転写調節能や細胞増殖に与える影響について検討した．
野生型p53(pC53‑SN3)，変異型p53(pC53‑175H，pC53‑273L)からBam HI消化により分離さ れ た各p53cDNAを，2n2゛で発 現を誘導 出来るブロ モ一夕ー を有するpSV2‑HMT/Terベクタ ーにク口ーニングし，pSV2‑HMT/Ter―SN3，―175H，‑273Lを得た．p503 l*‑anti‑p53はMMTV−LTR プ ロモ 一 夕ー 下 流 に野 生 型p53cDNAの ア ンチ セ ンスDNAを クロ ー ニ ング し て作 製 した ． ヒ トbaxプ ロー ブ は 既知 の塩基 配列をもと にPCR法にて 増幅し作 製した.p53,p21プ ローブ は各cDNAプラスミド(pC53‑SN3，pcDSR口△‑Sdil）より調製した，
2X l06個のHSC3細胞に，各p53クローン(pSV2―HMT/Ter―SN3，―175H，−273L)とp5031*― antiーp53とをりン酸カルシウム法にてコ・トランスフェクトし，G418(3 50ルg/ml)セレクショ ンにて 耐性コ口 二一を分離 した(HSC3/SN3，HSC3/175H，HSC3/273L)，導入p53遺伝子の発現 は2n2゛（150ルM)存在下でスクリーニングした．
40ルgのtotalRNAを6．7％ホルムアルデヒドグルで電気泳動後，ナイ口ン膜に転写し，3゜P でラベルしたプ口ーブ(p53っp21，bax，p−actin)でハイブリダイゼーション後，オートラジオグ ラフイーを行った．
2n2゛添加前と添加後12時間の各細胞株から抽出した蛋白（10ルg）を10％PAGEで展開し，
二ト口 セル口ー ス膜に転写 し，一次抗体(PAb1801あるいはD0‑7)，二次抗体に反応させ化学 発光法にてバンドを検出した．
親株及び樹立した各細胞株を，2n2゛添加（150ルM)下で培養すると，親株を除き，導入した各 p53遺伝子 は6時間後 には誘導さ れており ，24時間後 にも持続していることが確認された．
ウエスタ ン法にて親 株以外の 細胞株に おいてp53蛋 白の誘導 も確認された．また野生型p53 の発現に よってのみp21が誘導さ れ，273L，175Hの発現ではp21は誘導されなかった．baxの 発現には 、どの細胞株においても明らかな変化を認めなかった，ルシフウラーゼァッセイに より ， 野生 型p53のみ がp21プ 口 モ 一夕一 を転写活 性化し，273L及ぴ175Hではこ の機能を 欠いていることが石寉認された，
これらの 細胞株を5％FBS，2n2゛（100以M)下で培養すると，HSC3/SN3の細胞増殖は親株に 比ベ 抑 制さ れ た が，HSC3/273Lの 細 胞増殖は 親株と同 等であっ た．しかし0．1％FBS下で は，HSC3/175Hの細 胞増殖は親 株に比ベ 促進され たのに対 し，HSC3/273Lでは著しく抑制さ れた．
FACS解析の結 果，5％FBS，2n2゛(100ルM)下では ，HSC3/SN3においてday‑6におけるGl分 画の 細 胞数がday‑0に 比ベ30％以 上増加し ていた． 親株，HSC3/175H，HSC3/273LではGl分 画の細胞数に変化は認められなかった，一方O．1％FBS，2r12゛(100肛M)下では，親株において day―3からsub‑Gl分 画の増加が 確認され たが，HSC3/SN3，HSC3/175Hではsub―Gl分画の増 加は認められなかった．しかし，HSC3/273Lでは，day‑3，5，7と著しくsub‑Gl分画が増加して いく こ とが確認 され，day‑7で 親株の約3倍に達し ていた， アポトーシ スによるDNAの断片 化はHSC3/SN3，HSC3/175Hでは認め られなか ったのに 対し，親 株ではday−5から検出さ れ 始 め ， HSC3/273Lで は day‑3か ら 著 し く 生 じ て い る こ と が 確 認 さ れ た ． 2n2゛で誘導可能な野生型p53，変異型p53 (‑175H，―273L)を導入し樹立したHSC3細胞株を 用い て ，変異型p53‑273Lが，低血 清条件下 ではロ´ やbaxを介さ ない機序でHSC3細胞にア ポトーシ スを誘導し，細胞増殖を抑制し得ることを本研究において明らかにした．また、野 性型p53によ るp21の誘 導 はア ボ ト ーシ ス を 抑制 す るこ と も 確認 され た．従っ てp53遺伝 子による アポトーシ ス誘導に は，配列 特異的転 写活性化 を介さな い経路が存在することが はじめて 示された，さらに変異型p53‑273Lは，実際にヒトの癌で見出される変異でありなが らこの経路を活性化する働きを保持していると考えられた，
公 開 発 表 に際 し ，副 査 の 吉木 教 授 から ，HSC3細胞 を 実 験に 供 した 理 由 ，HSC3細 胞 で のアボト ーシス誘導経路が他の癌細胞において存在する可能性，今回のin vitroの成果をin vivo(例えばSCIDマウス） で確認し たか，ヒ トにおい てこの変 異をもつこ との予想 される 効果，配 列特異的転 写活性化 を介さな い経路で のアポト ーシス誘 導について具体的な実験 施行 の 有無 ， ア ポト ー シス 誘 導 にお けるp53とp21との関係 ，p53‑273Lによるア ボトーシ ス誘 導 経路 の 解 明に あ たり ，p21，bax以 外の他の 因子の検 討の必要性 ，などに っいて質 問があっ た．副査の 藤本教授 からは，p53‑273Lが検出さ れるヒト 癌の特徴とその癌の自然 史，低血清濃度で細胞を培養したことの臨床的意義，亜鉛濃度（100l.t M)を設定した根拠，
D0‑7抗体 を 用い た ウ エス タ ン法 で 野 生型p53蛋白 の バ ンド が 認 められ なかった 理由，な どについ て質問があ った．主 査の長嶋 教授から は，細胞 株樹立時 の回収ク口ーン数とクロ ーン 間 でのp53‑273L誘 導 の差 異 ，p21の他にコ ドン273領域 が転写活 性化する因 子，p53‑
273Lが 独 自に 活 性 化す る 因子 の 存 在，p53のり ン 酸 化とp53‑273L変 異と の 関 連，273コ ドン が 口イシン に変化す ることに よるp53蛋白 の立体構 造への影響 ，などに っいて質 問が あった． これらの質 問に対し て，申請 者は自身 のこれま での研究 成績や文献的情報をもと に概ね妥当な回答をなしえた・
審 査員 一 同 は，p21お よぴbaxの転 写活性 化によら ないp53‑273Lによ るアボトー シス誘 導能を初 めて示唆し た本研究 の成果を 評価し， 申請者が 博士（医 学）の学位を受けるのに 資格を有するものと判定した．
