博 士 （ 医 学 ） 尾 松 徳 彦
学 位 論 文 題 名
ホメオボックス遺伝子の過剰発現によるヒト肺癌細胞 A549 の細胞運動性および浸潤性の増強
学位論文内容の要旨
目 的
癌 の 浸 潤 ・ 転 移 を 発 生 生 物 学 的 に 考 察 す る と ， 細 胞 の も つ 固 有 の 空 間 的 位 置 情 報 の 変 化 が 原 因 と 捉 え る こ と が で き る ． 動 物 胚 の 発 生 過 程 に お い て 形 態 情 報 を 位 置 情 報 に 変 換 す る 遺 伝 子 は ホ メ オ ポ ッ ク ス 遺 伝 子 と よ ば れ ， こ の 遺 伝 子 群 が 位 置 情 報 の 最 終 的 な 担 い 手 で あ る 細 胞 接 着 因 子 遺 伝 子 の 発 現 を 調 節 し な が ら 胚 の 形 態 形 成 を 進 め て い く ． 脊 椎 動 物 て は 出 生 後 も 造 血 組 織 ， 腎 臓 ， 肝 臓 ， 中 枢 神 経 な ど で ホ メ オ ボ ッ ク ス 遺 伝 子 の 組 織 特 異 的 な 発 現 バ タ ー ン が 認 め ら れ る ． ヒ ト 第2染 色 体 に 存 在 す るHOX D3ホ メ オ ポ ッ ク ス 遺 伝 子 の 発 現 は 正 常 肺 組 織 で は 認 め ら れ な い が ， 肺 癌 の 原 発 巣 お よ び 転 移 巣 で は し ば し ば 認 め ら れ る ． こ の よ う な 背 景 か ら ，HOXD3ホ メ オ ボ ッ ク ス 遺 伝 子 の 発 現 異 常 は ， 癌 細 胞 の 転 移 ・ 浸 潤 性 と 密 接 に 関 連 し て い る と 予 測 さ れ る ． そ こ で 本 研 究 で は ， ホ メ オ ボ ッ ク ス 遺 伝 子 の ー つ で あ るHOXD3を ヒ ト 肺 癌 細 胞A549に 導 入 し て 過 剰 発 現 さ せ ， 細 胞 の 接 着 ， 運 動 お よ び 浸 潤 性 の 変 化 に つ い て 解 析 を 行 っ た ．
方 法 お よ ぴ 結 果
【HOXD3の 導 入 と 発 現 】 動 物 細 胞 で のHOXD3発 現 ベ ク タ ー と し てTaniguchiら に よ っ て 構 築 さ れ たpMAMneo ‑H OX 4A(+)を 用 い た ． コ ン ト ロ ー ル に は ， ネ オ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 の み を 発 現 す るpMAMneoを 用 い た ． ヒ ト 肺 癌 細 胞A549に そ れ そ れ の べ ク タ ー を 導 入 し ， HOXD3過 剰 発 現 株(HOX+1，HOX+2)， ネ オ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子 発 現 株 （Neol，Ne02) を 得 た ．HOXD3の 発 現 は ，RT―PCR法 に て 調 べ た ． コ ン ト ロ ー ル と し て ヒ トpア ク チ ン を 同 じ 条 件 で 増 幅 し た ． HOX D3遺伝 子の 発現 は， 親株 およ びコ ント 口ー ルク ロー ンて は 非 常 に 低 か っ た が ，HOX+1とHOX+2で は 高 い こ と が 明 ら か と な っ た ・
【 接 着 分 子 の 発 現 】 細 胞 表 面 の 接 着 分 子 で あ る イ ン テ グ リ ンp1，p3， ば3，a4，a5， a6， 口IIb，av，av,83お よ びav,85の 抗 体 を 用 い ， フ ロ ー サ イ 卜 メ ト リ ー に て こ れ ら の 分 子 の 発 現 を 調 べ た ． 親 株 お よ び 他 の す べ て の ク ロ ー ン に お い て イ ン テ グ リ ンa3，ロ5， av， ロ1，83，av,83お よ び ぱvp5の 発 現 が 認 め ら れ た ． こ れ ら の う ち ，a3，p3お よ びavロ3の 発 現 は HOX+1とHOX+2で 増 強 し た ． イ ン テ グ リ ンa4の 発 現 は ，HOX+1と HOX+2の み で 認 め ら れ た ． イ ン テ グ リ ンallbの 発 現 は ， 親 株 を 合 め た い ず れ の ク ロ ー ン に お い て も 認 め ら れ な か っ た ・
【 細 胞 の 接 着 性 】 フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン ， ラ ミ ニ ン ， ビ ト 口 ネ ク チ ン お よ びBSAに 対 す る 細 胞 の 接 着 性 を 経 時 的 に 調 べ た ． フ ィ ブ 口 ネ ク チ ン と ビ ト ロ ネ ク チ ン に 対 し てHOX+1と HOX+2は 親 株 お よ び コ ン ト 口 ー ル ク ロ ー ン と 比 較 し て 高 い 接 着 性 を 示 し た ． ラ ミ ニ ン と BSAに 対 す る 接 着 性 は 各 ク ロ ー ン と も 同 程 度 で あ っ た ．
【 細 胞 の 運 動 性 】 フ ィ ブ 口 ネ ク チ ン ， ビ ト 口 ネ ク チ ン ， ラ ミ ニ ン お よ ぴ フ ィ ブリ ノ ー ゲン に 対 す る 細 胞 運 動 性 を ト ラ ン ス ウ エ ル チ ャ ン バ ー を 用 い た ハ プ ト タ キ シ ス ア ッセ イ に て調 べ た ． フ ィ ブ ロ ネ ク チ ン， ビ ト 口ネ ク チ ンお よ び フ ィブ リ ノ ーゲ ン に 対す る 細 胞運 動 性 は，
親 株 お よ び コ ン ト 口 ー ル ク 口 ー ン と 比 較 し てH OX+1とHOX+2で 有 意 に 増 強 し た ． ラ ミ ニ ン に 対 す る 細 胞 運 動 性 は 各 ク 口 ー ン と も 同 程 度 で あ っ た ． 次 に イ ン テ グ リ ンp1， イ ン テ グ リ ン ロ3に 対 す る 中 和 抗 体 で 各 ク ロ ー ン を 処 理 し て ， フ ィ ブ 口 ネ ク チ ン と ビ ト 口 ネ ク チ ン に 対 す る ハ プ ト タ キ シ ス ア ッ セ イ を 行 っ た ． 親 株 と コ ン ト ロ ー ル ク 口 ー ン のフ ィ ブ 口ネ ク チ ン に 対 す る 細 胞 運 動 性 は ， 抗 イ ン テ グ リ ンp1抗 体 に よ っ て ほ ぼ 完 全 に 抑 制 さ れ た の に 対 し ， 抗 イ ン テ グ リ ンp3抗 体 に よ っ て は 全 く 抑 制 さ れ な か っ た ．HOX+1とHOX+2の フ ィ ブ 口 ネ ク チ ン に 対 す る 細 胞 運 動 性 は ， 抗 イ ン テ グ リ ンp1抗 体 あ る い は 抗 イ ン テ グ リ ン ,3抗 体 に よ っ て 部 分 的 に 抑 制 さ れ た ． ビ ト ロ ネ ク チ ン に 対 す る 細 胞 運 動 性fま ， 親 株 と コ ン ト ロ ー ル ク 口 ー ン で は 抗 イ ン テ グ リ ン,1抗 体 あ る い は 抗 イ ン テ グ リ ンp3抗 体 の 単 独 処 理 に よ っ て 部 分 的 に 抑 制 さ れ ， 両 抗 体 で の 処 理 で は 完 全 に 抑 制 さ れ た ．H OX+1お よ ぴ HOX+2の ビ ト 口 ネ ク チ ン へ の 細 胞 運 動 性 は 各 抗 体 の 単 独 処 理 で も 部 分 的 に 抑 制 さ れ ， 両 抗 体 の 処 理 で は さ ら に 抑 制 さ れ た が 完 全 で は な か っ た ・
【 ウ 口 キ ナ ー ゼ 型 プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン ・ ア ク チ ベ ー タ ー(uPA)お よ びetsフ ん ミ リ一 遺 伝 子の 発 現 】uPAと そ の 転 写 因 子 で あ るetsフ ん ミ リ ー 遺 伝 子 （ets‑l，ets‑2，EIAF） のmRNAの 発 現 をRT‑PCR法 を 用 い て 調 べ た ．HOX+1お よ びHOX+2のuPA，ets‑lお よ びets―2の 発 現 は 親 株 お よ び コ ン ト 口 ー ル ク ロ ー ン と 比 較 し て 高 か っ た ．EIAFとHOXD3の 発 現 程 度 に は 明 ら か な 相 関 性 は 認 め ら れ な か っ た ・
【In vitroの 浸 潤 性 】 基底 膜 モ デル と し て 頻繁 に 利 用さ れ て いる マ ト リゲ ル に 対す る 浸 潤性 を 調 べ た ．HOX+1とHOX+2は ， 親 株 お よ ぴ コ ン ト ロ ー ル ク 口 ー ン と 比 較 し て 有 意 に 高 い 浸 潤 性 を 示 し た ． さ ら に ， 浸 潤 ア ッ セ イ 系 に プ ラ ス ミ ノ ー グ ン を 添 加 す る と ，HOX+1と H OX+2に お い て の み 浸 潤 性 の 増 強 傾 向 が 認 め ら れ た ．
考 察
A549細 胞 の フ ィ ブ 口 ネ ク チ ン や ビ ト 口 ネ ク チ ン に 対 す る 細 胞 運 動 性 がHOXD3遺 伝 子 の 過 剰 発 現 に よ っ て 増 強 す る 原 因 と し て ， イ ン テ グ リ ン 分 子 の 発 現 亢 進 と 機 能 性の 変 化 が考 え ら れ る ．A549細 胞 は ， フ ィ ブ 口 ネ ク チ ン に 対 す る 細 胞 運 動 に 際 し て は 本 来 イ ン テ グ リ ン Biを 使 用 し て い る が ，HOXD3が 過 剰 に 発 現 さ れ る と イ ン テ グ リ ンav,83の 発 現 が 亢 進 し ， ロvp3とp1の 両 方 を 禾IJ用 す る よ う に な る こ と が 示 唆 さ れ た ． ビ ト ロ ネ ク チ ン に 対 す る 運 動 性 の 亢 進 は イ ン テ グ リ ン83の 発 現 亢 進 と そ の 利 用 に よ る と 考 え ら れ る ，A549のHOXD3 過 剰 発 現 株 に お い てuPAの 発 現 の 増 強 が 認 め ら れ た ．uPAの 転 写 因 子 の ー っ にetsフ ん ミ リ ー遺 伝子が 知られて いる． HOX D3過 剰発現株 におい てets‐1，ets−2の著明な発現の亢進が 認 め ら れ ，HOX D3は ， 転 写 因 子 で あ るetsフ ァ ミ リ ー の そ の 上 位 の 転 写 因 子 と し てuPAの 発 現 を 促 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．uPAは プ ラ ス ミ ノ ー グ ン を プ ラ ス ミ ン に 変 換 す る こ と に よ り 様 々 な 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス を 分 解 し ， ま た ， マ ト リ ッ ク ス メ タ ロプ 口 テ アー ゼ
（MMP)を 潜 在 型 か ら 活 性 型 に 変 換 さ せ る ．uPAの 発 現 と 転 移 ・ 浸 潤 性 と の 相 関 は 肺 癌 を 含 め 多 く の 癌 に お い て 報 告 さ れ て お り ， イ ン テ グ リ ンp3の 発 現 は ヒ ト メ ラ ノ ー マ の 悪 性 化 に 伴 っ て 増 加 す る こと ， お よび ヒ ト 乳 癌細 胞 の 骨転 移 と 関連 す る こと が 報 告さ れ て いる ， uPAの ほ か にetsフ ん ミ リ 一 遺 伝 子 に よ っ て 転 写 が 調 節 さ れ る 遺 伝 子 と し てMMPに 属 す る MMP‐1，MMP−3，MMP−9な ど が 挙 げ ら れ る ， こ れ ら の 分 子 は 癌 の 転 移 ・ 浸 潤 に 関 わ る 分 子 で あ る ． 実 際 ，HOXD3過 剰 発 現 株 の マ ト リ ゲ ル へ の 浸 潤 性 は ， コ ン ト ロ ー ル 株 に 比 ベ 有 意 に 高 か っ た ． 従 っ て ， 癌 細 胞 に お け るHOX D3の 発 現 異 常 は ， 転 移 関 連 遺 伝 子 の 発 現 を亢 進し， 転移・浸 潤性を 増強して いる可 能性が示 唆された ．
結語
―338―
ヒト肺癌細胞A5 49 の転移・浸潤は癌細胞に特有な遺伝子発現によって起こるというより
は，むしろ発生過程の遺伝子発現プ口グラムを模倣あるいは借用している可能性が高いと
考えられた．
学位論文審査の要旨 主査 教 授 宮坂和男 副査 教 授 守内哲也 副査 教授 細川真澄男
学 位 論 文 題 名
