<原著>抗BUdR monoclonal抗体を用いた脳腫瘍の生長解析とその臨床応用 利用統計を見る

原

著

抗BUdR monoclona1抗体を用いた脳腫瘍の

生長解析とその臨床応用

長沼博文・木村良一・貫井英明

小 林 愼

_{雄D・山崎弘道肌若尾哲夫2）}

  山梨医科大学脳神経外科 1）山梨医科大学第二病理 2）山梨県立中央病院脳神経外科 抄 録：25例の脳腫瘍患者にbromodeoxyuridine（BUd：R）を手術時に投与し腫瘍のBUdRの取り 込み即ち：Labeli蕪g頚dex（LI）を求めた。2！例では摘嵐標本を抗BUdR抗体を用いて免疫組化学

的染色を行いLIを求めた。5例ではHow cytometerを用い， BUdR最及びDNA量を分析し

LIを求めた。その結果， glioblastoma mu1庶om｝e 10．4−12．9％， astrocytoma 2．6−3。5％， men沁g− io搬a O．7−7。2％， neuri簸oma O。1−0，2％ンhemangioma O．！％， hypothalam圭。 ha斑artomaα！％， ma1圭即ant lympho㎜a 2．8％であった。 meni貸9呈oma 13例中2例は高値で短期間に再発し， CT撮m より求めたdoubling dmeは各・々54日，40−95田と短かった。 LIから計算したdoubling tilneは各 各3日，65日であった。  組織学的悪性度とLIとはおおむね相関していたが，組織学的に良性のme簸ingめmaの中に増殖 が速くLIも高いものがあることが示された。 LIは腫瘍の再発及び予後を予測する上で重要な指標 に，なると考え．られた。 キーワード 脳腫瘍，細胞周期，プロモデオキシウリジン，フローサイトメトリー

1。緒

言

 脳腫瘍の生長解析は以前は3H−thymidi敷eを

用いた灘tomdiography1）で行われていたが，

解析が終了するまでに数ヵ月要する事と，半減

期が12年と長く人体に投与するには問題があっ

た。これに対して，thymidineと拮抗してDNA

に取り込まれるbfomodeoxyuridine（：8Ud：R）

に対するmo捻◎clona1韻tibodyがGr搬t脱e轡に

よって開発され，免疫組織化学的方法によって

D：NAに取り込まれたBUdRが同定出来るよう

になった。これにより脳腫瘍ceU ki且etiCSの研 究が容易に行われるようになった3−8）。又，HOW

cytome七ry（FCM）を用いた生長解析も行われ

ている9覗》。 〒409−38山梨県中巨摩郡玉穂町下河東U10 受付；1987年11月12欝

 我々は，脳腫瘍患者に手術時：8UdRを投与

し免疫組織化学的方法及び一部の症例に対して

：FCMを用いて腫瘍の1abeling index（U；DNA

含成期のfraction）を求めた。これが腫瘍の組

織学的悪性度と相関するか，又再発及び予後の

指標とできるか否かを検討した。

II。対象及び方法

 P86年5月以降山梨医科大学及び山梨県立中

央病院脳神経外科に入院した25例の脳腫瘍患者

を対象とした。脳腫瘍の内訳は，me簸ingioma

13例，，glioblastoma 3例，菰e登rinoma 4例， astrocytoma 2例， hypothalamic ham歌rtom＆ 1例，malig照凱1y1ぬpho鵬1’伊1， hemangioma 工例である（表1）。case 6は2回手術を行い，

2回目の術後50Gyの局所照射療法を受けた。

30 _{長 沼 博 文，他}

case】8は3回再発し4回腫瘍摘出術を受けた。

3回口の術後に50Gyの照射療法を受けたが，

15ヵ月後に再発した。

 方法は，手術時全麻導入後BUdR 150200

mg／sqmを1時間前後で点滴静注し，摘出した

標本は70％etha鍛01固定後，パラフィン包埋

した。5症例では，摘出した腫瘍をsingle cell

suspensionとし， BUdRを投与しなかった例で

はculture medium（RPMI 1640；FCS 10％）

の中にBUdR（3μ9／ml）を投与し30分間incu−

bateした後，70％ethano1で固定しHow cyte一

meter（FCM）により分析を行った。

 免疫組織化学的染色：パラフィン包埋切片を

薄切し，脱パラフィン後0．3％H202で30分間

反応させ，次いで2NHC1を30分間反応させ，

0．1M Na2B407（pH8．5）で中和した。0．01M

phosphate bufεered saliae（PBS， pH 7．2）で

洗浄後，抗BUdR monoclonal抗体（Becton

Dickinson社製）で6◎分間室温で反応させた。

二次抗体はperoxidase標識抗マウスIgG抗体

（DAKO社製）を30分間反応させた。ついで，

0．005％H202加0．02％3，3’一diaminobenzidine Tal）璽e L Patho璽ogica1 diagllosis and玉abe璽ing index三n 25 patieDts

Case N・・ Age（yrs）， Sex Tumor I」ocation ：BUdR． Dose_伽g）

Labe韮ing Index（％）

FCM

Tissue αiob笠asωma multiforme

里9畠3

As亀rocytoma 4げり

Meningioma

ゆ O ● ◎ 魯 0 馳 ● 也 ● 嚇 9 ■

6789012345678

    1i111王111

Neurino㎜縦

QVO19角

19恥9向9↑ 竃 Hemangio㎜a 23． 56， F 48， F 27，M： 34，罫

4，M

MM罫MFFM罫FFFFF

ラ ン シ ぴ タ ヨ ラ ラ ラ コ ン サ ヨ

88黛5黛61223203

5357556564455

37，M

45、罫 59，M： 59，：F 52，翼 Hypo之ha豊amic ham蹴oma 24． 1， F M：a璽三gnan亀置ymphom駄 25。 _79，F rt frontoparie￡a竃 1t temp・rOP撲rie輩a皇 豆t parieta翌 rt fro！覚a豊 cerebellum 鷺midd豊e＆：pos￡erior fossa anterior fossa pos之erior fossa occipita署 tuberCU亘U勤薩 se置ae r愈 fron ta置 aし1｝terioぎ fossa posteyior fossa fa璽x rt sphe簸oidごidge tubercU互um se置ae ￡a置x b翫fron ta置 r￡ 8毒h llerve rt 8奮h nerve T￡8亀hnerve 璽亀 8￡h nerve 璽torbi重 suprase塁量ay rt orbit 250 250 250

00

55

2 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 ％0 250 250 250 250 50 250 く1 ＜1 く1 3．9 く1 12．9 10．4 11．4 5ρ0 00Q4

27窪913471

じ        り  に  リ  ヨ  コ  ゆ

711011101

2．8 0．2 0．1 0。2 0。1 ◎．玉 2．8 8UdR鵠bromodeoxyuridine，罫CM諏廷ow cy愈ometer、 M鵠ma置e， F雛fema璽e 蝿識righg，豊加蓋e￡t，臓嵩bi量＆tera豆

tetrahydrochrolide溶液で5分間反応させ，発

色後Hematoxylinによる核染色を施して観察

した。

 Labeling Indexの算出：腫瘍組織における

BUdR捕捉細胞数の割合（LI）の算出には，任

意に複数の視野を選び，Kontron画像解析シス

テムを用いて平均的細胞数（100−300個）に占め

る標識細胞数の比率を：LIとした。数視野を計

測し最も高い値を各組織型のLIとした。

 Flow Cytolneterによる分析：Ethanol固定

したsingle・・cell suspension 2 m1に4N HC12ml

を加え30分間反応させた後，0，1MNa2B407で

中和し，抗BUdR抗体を室温で30分間反応さ

せ，洗浄機，FITC℃onjugated anti−1nouse IgG （1：100dilution，0．5％Tween 20 i皿PBS）を

室温で30分間反応させた。次いで，Propidium

Iodide（PI）50μg／m1（in PBS containing 2。0％ NP−40）を加え4℃30分聞反応させ，nylon mesh

（40μm）を通しFCMに供した。

 FCMによる分析はEPICS 751（Coulter Elec− tronics， INC．）を用い，波長488 nm，300 mW

のLaser光線で， FITCからの緑色蛍光量即ち

BUdR量は530 nm short pass丘1ter， PIから の蛍光量即ちDNA量は630 nm long pass丘1ter

を用い測定した。およそ1×104個の腫瘍細胞

を分析し，LIを求めた。

 Tumor doubling timeの算出：短期間に再発

した2例（case 6， case 18）のmeningioma症 例では，CT scan像よりTumor doubling time （Td）を算出した。 Tdの算出式はTd；t×lo92／ （10g Vb−10g Va）（Va l tumorのinitial volume，

Vb：tdays後のtumor volume）を用いた3）。

又，LIからも算出式Td＝500×Exp（一〇．73×

LI）（Exp；natural log base）3）を用いてTdを 計算した。

IIL 結

果  免疫組織化学：免疫組織化学的検索では，：LI

は表1の如くであった。meningiomaでは13例

中11例は1．7％以下であったが，case 6（図1），

18の2例では7．2％，2．8％と高値であった。

病理組織学的にはcase 6，18共にmeningo−

theliomatous meningiomaであり， case 6では  Fig・1・ Case 6・ M：eningotheliomatous meningioma。 a． HE stain，×200． b。      Immunoperoxidase staining shows dark：BUdR labeled nuclei．×200

32 _{長 沼 博 文，他} Fig．2。 Case 6． Left：CT scan obtained aftcr    asubtota亙removal of the tumor which    extended from the right middle fossa     to right cerebe盤。・pontine angle。 No     tumor stain is visible． Right：CT    scan 重aken I96 days after the oper−    ation shows the recurrent tumor。

悪性像は認められず，case 18では一部pleo−

morphiSmを示した以外悪性像を認めなかった。

 FCMによる分析：FCMにより求めた5例

のLIは表1の如くである。

 Tumor doubling time：CT丘lmより求めた

Tdはcase 6では54日であった（図2）。 case 18

では，3回の再発時のCT丘1mより計算した

Tdは初回より各々76，40，95日であった。 LI

を用いて算出すると，case 6は3目， case 18 は65日であった。

IV。考

按

 BUdRは以前は放射線増感剤として投与され

ていた13 16）。投与量の限界としては，連日14日

間投与の場合700mg／sqm／12 hrsとされてい

る15）。主なsystemic toxicityとしては， myelo− supPressionとmaculopapular skin rashが挙げ

られているm。又，BUdRを多量に，或は長期間

投与した場合にはmutage黛ic或はteratogenic

な影響もあるとされている17）。Gratzner2）によ

りBUdRに対するmonoclona1抗体が開発さ

れて以来，cell kineticsの研究が広く行われる

ようになったが，この場合のBUdR投与量は

150−200mg／sqmと少量で，1時間前後で静注

を行っている3・墨・5・7）。又growth fractionを調

べる目的で3日間200mg／sqm投与を行った報

告8）もあるが，いずれもBUdR使用量は副作用

を生ずるほど多量ではなく，BUdRを用い安全

にin situでcell kineticsを調べることができ ると思われる。  腫瘍の増殖はcell cycle time， growth fraction 及びcell lossによって規定されると考えられて いる18）。これらのうちgrowth fractionはBUdR

を8時間ごとに3日間投与することによて近似

的な値が得られている8）ことを考えると，LIと

growth fractionとはかなり相関していると思

われる。従ってLIを求めることは腫瘍の増殖

に関する大きな手がかりになると思われる。最

近の報告ではしIは， glioblastoma multiforme では7。8−11．5％，anaplastic astrocytomaは 2．1−21．2％であり5），maligna鉱meningioma では2。9−5．4％3），9．0−13．6％4）と高値である。 hema且giopericytic meningioma も 2。0％4）， 0．4−4．1％3）と比較的高値で，m81ignant mening−

iomaと同じく臨床的悪性度と良く相関するdata

と考えられる。組織学的に良性のmeningioma

では，0．3−1．7％3），0．1−1．5％4）と二値である・

我々のdataもおおむねLIと組織学的悪性度

とは相関していた（表！）。

 FCMを用いてLIを求めた報告もあり5），免

疫組織化学的染色とほぼ同じ結果が得られてい

る。問題点としては，non−neoplastiC ce11が混

じることで，その為にLIがやや低値に出るこ

とである。利点としては，免疫組織化学的染色

と比べて多数の細胞を解析できることである。

培養腫瘍細胞では，細胞内へのBUdRの取り

込みとDNA量を同時に解析することにより，

細胞周期動態の解析9・11），及び，抗癌剤感受性 検査10）等が行われており，様看な分野に応用が 期待される。

 今回の症例の中では，meningiomaが13例と

一番症例数が多く，組織学的には全例良性の部

類に入っていた。しかし，case 6，18の2例で

はしIが高く，しかもCT釦mより算出した

doubling timeも各々54 days，40−95 daysと短

かかった。Choら3）が報告しているmalignant

me簸ingiomaのdoubling timeは9−75日であ

ることを考えると，我々の2例は臨床的には悪

性に近いと考えられる。組織学的に良｛生と診断

されたmeRingiomaの中にこのような症例が含

まれていることは注意を要すべきことである。

この2例は共に照射療法を加えたが，case l8

では再発を認めた。Fukuiら遷）もmal玉g照Rt

meningioma術後に照射療法を行い！0カ月後に

再発を認めた症例を報告している。組織学的に

良性のmeningiomaでもUが高いときは早期

再発が予測され，術後照射療法を行うべきであ

ると考えるが，照射療法のみでは再発を防ぎ得

ない点は今後の課題である。case 6のように完

全摘出が困難な場合も対処の仕様が難しいと思

われる。

 glioblastoma multiformeではUが高く

growth fractio捻も大きいと思われるが， necrosis

もしぼしば見られ単純に腫瘍増大に反映しない

と考えられる。しかしH：oshinoらエ）は3H−thymi−

dineでの研究でLI 5％以上のgliomaは術後

6ヵ月以内に死亡し，5％未満のものは1年以

上生存したとしている。me簸ingiomaでは腫瘍

内壊死が少なくLIとTdと相関するdataが得

られている3）。case鳩でもCT薮hnより算出

したTdと，：LIより求めたTdは近い値であっ

た。LIを求めることは，再発及び予後を予測

する上で重要な指標になると考えられる。 ︶ 1 ︶ 2 ︶ 3 ＞ 4 文 献 Hoshino T， Wilson C8・CeH kinαic a1職lysis ・fhu㎜an malignant brain t疑mors（giio㎜as）・ Cancer 1979；44：956−962． G縦zner HG Monocloml antibody to 5− brom・一and 5−i・d・de・xyuridine：a黛ew reagent for deteαioll o薮DNA replicat圭01玉・ Scie1｝ce 1982； 2蓋8： 4174−4175、 Cho KG， Hoshino T， Nagashi㎜読丁θ孟αZ。 Prediction o￡tumor（玉oub王ing ti搬e in yecur− r｛｝】〔｝t men三ngio1勲as。 Ce王1 】kinetics studies with l）yomodeoxyuridine 1翫beli黛9・JN￠urosurg 1986； 65： 790−794． Fukui M， Iwaki T， S盆w我丁撹α1． Pr◎lifera− tive activity of㎜eningiomas as ev置1uated by bromodeoxyuridine up重ake examina￡ion． Acta Neurochir（Wien） 1986； 81： 135−14，L ﹀ り．D ︶ 6 ︶ 7 ︶ 8 ︶ 9 10＞ u＞ 12） 茎3） 14＞ 15） 16） 17） Hoshlno T， Nag段shi㎜a TンMurovic JAε撤Z・ InL sit1ほ cell kinetics studies o】儀 hu1〕aan 】〔｝euro− ect・dermal tumors wit1ユbr・modeoxyuridine labelin9・ J Neurosurg I986；｛｝4：453−45g． 長島 正，星野孝夫：脳腫瘍成長解析のあゆみ と展望。特に抗8romouridine単一クローン抗 体による迅速解析法について．脳外1984；12： 1◎07−1018． Nagashim盆 丁， DeArmo籍d SJ， Murovic J， Hoshino T・Immunocytochemical demα｝s￡ra− tion◎￡S−phase cel蓋s by antibromodeoxyuri・ dine mOnOC10nal antibOdy i捻11Uman brai簸 tumor t三ssues・ Acta Ne㍊ropatho1（：B｛｝rl） 1985； 67：155−159． Yoshii Y， Maki YンTsuboi K．8‘α∼． Estimation of growth fraction wi￡h bromodeoxy膿idille in human centrahαv・us system tum・rs． J Neurosurg 王986； 65： 659一663． D・1beare F， Gra￡z1｝er H：， P￠11avicini MG， Gray Jw・H・w cytometric measur￡men￡ohotal DNA co燃en￡and incorpora￡ed bromodeoxy− uridir｝e。 Proc Natl Acad Sc圭USA I983；80： 5573−5577． 蹴上勝弘，河本圭司，岡 信行：避ow cyto− metryによる脳腫瘍の生長解析，第5報 新し い抗癌剤感受性検査とその臨床応用。脳外王986； 14： 627−634． 佐谷秀行，伊地智昭浩，穀内 隆ほか：抗 8Ud：R抗体を用いた腫瘍細胞周期動態の解析￠ Medicanmmuno璽・9y 1987；13：225−230。 高橋 学，佐々木功典，村上知之：：Bromode− oxyuridine標識による細胞動態の解析。最新医 学1985；40：80−84． おagshaw MA』ogg磁RLS， Smith KC 6齪Z． In￡ra−arterial 5−bromodeoxyuridine a1簾d x−ray 之herapy． Am J Roentgellol l967；99：88昏894， Ki1蔵sella TJ，：Russo A， Mitchell J：Bε蝕♂． A phase l study o鐙i凱ermitte1㌃t i圭㌃travenous bromodeoxyuridine（：BUdR）with co・wen￡iα・al fractiollated irradiation・ Int J Radiation on− cdogy：Bio三Phys 1984；10：69漏ツ6． Mi￡chell J8， Kinsella TJ，：Russo A 8診α∼． RadioseRsitizatio嫉of 1竃ematopoietic precursor ce1三s（CFUs＞in g玉ioblastoma patients yeceiving intermitten￡ intravenous 呈nfusions of bromo− deoxyuridine（藁3丁目R）・ In之 J Radiatio級 on− cology：Biol Phys 1983；9：457−463． Russo A， Gianlli覧， Kinse11哉TJ 8飽乙Pha】瞼a− cological eva玉uatiol、 of i貧trav￡nous delivery o歪 5一董）romodeoxyuridi嶽e to pa．￡iαユts with brain tumors． Cancer Res藁984；磁：170黛一 1705． Goz：B・The e貿ects of incorpor縦tioll o鋳一 h段logenated deoxyuridines into the DNA of eUkaryOtiC Ce1圭S． PharmaCO玉ReV 1978；窯9：

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900.

61:

89S-Ceii Kineties Studies eft Brain Tumors with Bromedeoxyuridine Labeiing

Hiro￡umi Naganuma, Ryoichi Kimura, Kideaki Nukui, Makio Kobayashii>, Hiremichi Yamazaki2) and Tetsuo Wakao2>

Defaartment of Neurosttrgery, Yam.anashi Medical College 1) 2nd Departmfent of Pathology, Yama.nashi Medical College 2) DePartment of Neitros2trgeTy, Yamanashi P･refectural Central rrosPitag

Twenty five patients with braiR tuinors were given intravenously bromodeoxyuridine (BUdR>

at the time of surgery to examine the uptake of BUdR by tumor cells. In 21 cases, BUdR

labeled cells were detected by immunoperoxidase staining using anti-BUclR. monoclona} antibody, and BUdR }abeling indices (LI) were caiculated. IR 5 cases, the LI was determined by fiow cytometer. The LI were 10.4 to I2.9% for glioblastoma multiforme, 2.6 to 8.S% for astrocytoma, 3.7 to 7.2% for ineRingioma, O.l to O.2% for neurinoma, O.l% for hemaRgioma, e.1% for

hypo-tl}alamic hamartoma, 2.8% foy malignant lymphoma. Two out of 18 meRii}giomas had high

LI and exhibited early recurrence. The tumor doubling times in these two patients, calculated from serial computed tomographic scaRs, were 54 days and 95 days, whereas the doubling times estimated from the LI were 3 days and 65 days, respective}y.

LI cerrelated closely with histological malignancy. In addition, some histologicaliy benign

menikgiomas had a high growth rate and high LI. The U. may irnprove the prediction of

recurrence and prognosis in some patients.