外気温変動に基づく環境ストレスにより誘発される血小板および凝固・線溶系の異常に関する基礎的研究
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(2) 博 士学位論 文. 外 気温変 動 に基づ く環 境 ス トレス によ り誘発 され る 血 小板 お よび凝 固 ・線溶系 の異常 に関す る基 礎 的研究. 平 成6年12月. 川. 畑. 篤. 史.
(3) 目. 次 1. 緒論. 3. 第1章SARTス. トレス 動 物 に お け る血 小 板 の 量 的 変 動 3. 言. H実. 験 材 料 な らび に 実験 方 法. 3. 1緒. 3. 1.実 験 動 物 お よ び ス トレス の 負荷 方 法. 骨髄 巨核球数の測定. 4.. 出血時間の測定. 5. 3。. 4. 採血 と血液学的検査. 4. 2。. 5. 5,脾. 臓 摘 出. 7.. 統計学的処理法. 5. 化学的除神経. 5. 6.. 6. 皿. 実 験 結 果. 種 々の ス トレス を 負 荷 した マ ウス の血 液 学 的諸 変 化. 2。. マ ウス の 血 小 板 数 な ら び に 骨 髄 巨核 球数 に お よ ぼ す 種 々の ス トレス の 影 響. 3.SARTス. 6. ユ。. 7. トレス負 荷 期 間 中な らび に負 荷 中止 後 の 血 小 板 数. および骨髄巨核球数の経 日変化. 8. 4.SARTス. トレス よ る血 小 板 数 減 少 に お よ ぼ す 脾 臓 摘 出 の 影 響. 5.SARTス. トレス マ ウ ス に お け る 出血 時 間 の 延 長. 8 11. IV考 察. 11. V小. 13. 第2章. 括 SARTス. トレス動 物 に お け る血 小 板 の 機 能 的 変 化. 1緒. 言. H実. 験 材 料 な らび に 実 験 方 法. 14 14. 一一. 14. ユ.実 験 動 物 お よ び ス トレス の 負 荷 方 法. 14. 2.採 血 と多 血 小 板血 漿 の 調 製. 14. 3.Collagen溶. 15. 液 の 調製. 一1一.
(4) 4.㎞vitro血. 小 板凝 集能 の測定. 15. 5.1皿vivo血. 小 板 凝 集 能 の 測定. 15. 6.血 小 板 凝 集 能 とATP放. 出能 の 同時 測 定. 7血. 小 板 中adenine皿deotides量. 8.血. 小 板 のserotonin放. 9.洗. 浄 血 小 板 の 凝 集 能 の 測定. 16. の測定. ユ6. 出能 と 含 量 の 測 定. 17 17. 10.血 小 板 中 の 蛋 白 質 お よ びcholestero1量. の 測定. 18. 循環血 中の凝集血小板の検出. 11. 皿. 18. 実 験 結 果. 18. ス トレス 負 荷 に伴 う ラ ッ ト血 小 板 数 の 変 化. 1.. 18. 2.Invitro血. 小 板凝集能 の変化. 18. 3.Invivo血. 小 板凝集能 の変化. 22. 4,血. 小 板 のadeninenudeotides放. 5.血. 小 板 のserotonin放. 出 能 と含 量. 22. 出能 と含 量. 6.. 洗浄血小板の凝集能. 7. 皿皿 ノ」 魎 似1判. 8.. 循環血 中凝集血小板の検出. 25 25. 而,1、 摺 士畿 津 諭 △ 具 ・ 脳. 脳. 27. ノ」 里. 27. IV考. 察. 28. V小. 括. 31. SARTス. 第3章 1緒. ト レス 動 物 に お け る血 液 凝 固 ・線 溶 系 の 異 常. 言. 32 32. II実 験 材 料 な らび に 実 験 方法. 32. 1.実 験 動 物 と ス トレス の 負 荷 方 法. 32. 2.乏. 血 小板 血漿 の調製. 32. 3.血. 漿 凝 固時 間の測定. 32. 4.血. 漿fibrinogen量. 33. 5,Euglobulin溶 6.血. の 測 定. 解 時 間(ELT)の. 測 定. 33. 液 凝 固 第 皿 因 子(FVIII:C),antithrombh1皿(ATIII)お α2-plasmininhibitor(α2-PI)活. 7.血. 性 の 測 定. 液 濃 縮 ・希 釈 の 検 討. よ び. 33 34. 一II一.
(5) 薬物投与法. 8. 皿. 34. 実 験 結 果. 35. 1.. ス トレス に よ る 凝 固 ・線 溶 系 の 変 化 一. 35. 2.. 血 液 濃 縮 ・希 釈 の 検 討. 37. 3.. ス ト レ ス 負 荷 に 伴 う血 漿fibrinogen量. 4.SARTス. お よ びELTの. 経 日変 化. トレス 動 物 の 止 血 系 異 常 に お よ ぼ す 薬 物 の 作 用. ユ)血 漿fibrinogen量 2)Alprazolamの. の 減 少 に 対 す るtranexamicacidの. 効果. 37 38 38 38. 作 用. w考. 察. 41. V小. 括. 43. 第4章SARTス. トレス 動 物 の止 血 異 常 発 現 に お け る 活 性 酸 素 の 関与. 45. 1緒 言. 45. H実. 験 材 料 な らび に 実 験 方 法. 46. 1.実 験 動 物 と ス トレス 負 荷 方 法. 46. 2.採. 46. 血. 3。 血 漿5b血ogen量. な ら び にFVm:C活. 性の測 定. 46. 4.. 薬物投与法. 46. 5。. 血漿 中過酸化脂質量の測定. 47. 6。. 組織中過酸化脂質量の測定. 47. 皿. 48. 実 験 結 果. ラ ッ トお よ び マ ウ ス に お い てSARTス. 1.. 血 小 板 数,血. 漿 血b血ogen量. λS叩eroxidedismutase(SOD)の. 3.Catalaseの 4.AUopurinolの 5.血. トレス に よ り誘 発 され る. お よ びFVIII:C活 効 果. 効果. 性 の変化 の比 較. 48 48 50. 効果. 51. 漿 な らび に組 織 中 過 酸 化 脂 質 量 の 変化. 53. IV考 察. 54. v小. 56. 括. 総括. 57. 引用文献. 61 一III一.
(6) 略語一覧表. 70. 謝辞. 一IV一.
(7) 緒. 論. 多 くの 疾 病 像 は 侵 襲 原 因 と生 体 反 応 の 合 作 とい え る.侵 襲 に対 す る 自律 神 経 の 過 剰 興 奮 と臓 器 傷 害 の 関 係 がRemyに. よ って 明 らか に さ れ,下 垂 体 一 副 腎 系 を 中心 と した. Selyeの ス トレス 学 説 が 発 表 され て 以 来,侵 襲 原 因 に対 し 自律 神 経 系 一 内 分 泌 系 は 生 体 のhomeostasisを 維 持 す る た め に 機 能 す る一 方 で,疾 病 現 象 の 形 成 に 関 与 す る と考 え られ て い るL2).い. わ ゆ る ス トレス病 以 外 の 疾 病 に つ い て も,そ の 発 現 あ る い は 進. 行 過 程 に お い て何 らか の 形 で ス トレス性 因 子 の 影 響 を 受 け て い る事 が 指 摘 され つ つ あ る.日 本 の死 因 別 死 亡 率 で 上 位 を 占 め る の は,癌 で あ る 。 後2者. 脳 血 管 疾 患,心 疾 患 な どの 成 人 病. は い ず れ も血 栓 性 疾 患 で あ り,ま た,癌 や 肝 障 害 な ど の 基 礎 疾 患 を 背. 景 に何 ら か のtriggerが 作 用 して 播 種 性 血 管 内凝 固 症 候 群(DIC)が. 発現 す る こ とが 知. られ て い る.こ れ ら止 血 系 の 異 常 が少 な くと も一 部 関 与 す る と考 え られ る疾 患 あ る い は 病 態 につ い て も ス トレス との 係 わ りが 指 摘 され て い る. いわ ゆ る ス ト レス に は 様 々な もの が あ り,こ れ ら全 て が 必 ず しも 同一 の 生 体 反 応 を 惹 起 す る とは 限 らず 、 ス トレ ッサ ー の 種 類 に よ っ て異 な った反 応 が 生 じる こ と もあ る. 近 年,社 会 の 複 雑 化 に 伴 い,心 理 ・社 会 的 ス トレス が 問題 視 さ れ て い る 一 方 で,環. 境. ス トレス が 生 体 に 与 え る影 響 も依 然 重 要 な 問 題 で あ り,未 解 明 な 点 も多 い.気 温 変 動 は 最 も一 般 的 な 環 境 ス トレス の1つ で あ る が,長 期 に 亘 る気 温 変 動 の 生 体 に及 ぼ す 影 響 を 系 統 的 に調 べ た研 究 は少 な い.BullandMor重on3)の. 英 国 での疫 学的研 究 に よ る. と,脳 血 管 障 害 や冠 動 脈 障害 な どの 血 栓 性 疾 患 に よ る死 亡 率 は 気 温 変 動 が 激 し くな る に つ れ て 増 加 す る.こ の こ と か ら長 期 の 気 温変 動 と止 血 機 構 との 間 に 何 らか の 関 係 が 存在 す る 可 能 性 が 考 え られ る が,実 験 動 物 を用 い た 基 礎 的 な研 究 に よ る検 討 は ほ と ん ど行 わ れ て い な い. 喜 多 ら4)は,実. 験 動 物 の 環 境 温度 を数 日間一 定 の ス ケ ジ ュ ー ル に 従 っ て 室 温 と 低 温. に 繰 り返 し変 化 さ せ る こ と に よ って 様 々 な 生 理 機 能 異 常 が 観 察 され る こ と を 報 告 し, この環 境 ス トレ ス をSART(specificaltemationofrhythlnintemperature)ス 付 け て 系 統 的 な 研 究 を 行 った.こ η. ,消 化 器 系8),循. のSARTス. トレス と名. トレス 動 物 で は,現 在 ま で に神 経 系5 . 環 器 系9一工2),血 液 系13)な ど に 様 々な 特 徴 的 異 常 が 認 め られ て い. る.. 1.
(8) 本 研 究 で は,既. に 多 くの 生 理 的 お よ び生 化 学 的 情 報 が 得 られ て い るSARTス. トレ. ス動 物 を 用 い て,長 期 に亘 る気 温 変 動 に基 づ く環 境 ス トレス と止 血 系 との 関係 に っ い て の 基 礎 的 検 討 を行 い,以 下 に そ の 成 果 を詳 述 した.. 一2.
(9) 第1章SARTス. トレス動物 にお ける血 小板 の量 的変動 1緒. 言. ス ト レ ス に よ っ て 様 々 な 生 体 反 応 が 惹 起 さ れ る が,そ れ て い る15).白. の1つ. に血液 学 的変化 が知 ら. 血 球 系 で は 好 酸 球 数 の 減 少 は 最 も 典 型 的 な ス ト レ ス 反 応 で あ り,リ. ン パ 球 数 の 減 少 や 好 中 球 数 の 増 加 な ど も ス ト レ ス 時 に よ く認 め られ る.ま お い て 認 め ら れ る 相 対 的 多 血 症 に は,ス う に,血. た,臨. 床に. ト レ ス 多 血 症 と よ ば れ る も の も あ る.こ. のよ. 液 学 的 所 見 は 生 体 の ス ト レ ス 状 態 を 示 唆 す る1つ. SARTス 常1°'11),脳. ト レ ス 動 物 で は,持 波 異 常16),行. 続 的 低 血 圧9),局. 動 異 常17)お. の 指 標 と も な り う る.. 所 血 流 量 の 変 化9712),心. よ び 痛 覚 過 敏18)な. 電 図異. ど の 生 理 機 能 変 化 の ほ か,. 脳 内 諸 部 位 に お け るacetylcholine`),noradrena】ine,dopamine6)お. よ びserotonin7)含. 量 の 変 化 な ど の 神 経 伝 達 物 質 の 異 常 も認 め ら れ て い る.SARTス. トレス に よ って 惹. 起 さ れ る こ れ ら の 諸 変 化 の 多 く は,一 る.SARTス して も,赤. ト レ ス 動 物 で は,副. 般 的 な 急 性 ス トレス に よ る変 化 と は異 な っ て い. 腎 肥 大,胸. 血 球 な ら び に 好 中 球 数 の 増 加,リ. 般 的 な ス ト レ ス 変 化 が 報 告 さ れ て い る13).本 特 徴 を 探 る 目 的 で,手. ど の ほ か,血. 液系に関. ンパ 球 な ら び に 好 酸 球 数 の 減 少 な ど の 一 章 で はSARTス. トレス動 物 の 血 液 学 的. 始 め に 種 々の タ イ プ の ス トレス を 負 荷 した動 物 と の 比 較 の 観 点. か ら血 液 検 査 を 行 っ た.そ に 認 め ら れ た の で,こ. 腺 萎 縮13'14)な. の 結 果,血. 小 板 数 の 減 少 がSARTス. トレス 動 物 で 特 徴 的. の 現 象 に つ い て さ ら に 詳 細 な 検 討 を 行 っ た.. 皿 実験材料な らびに実験方法. 1.実 験 動 物 お よ び ス トレス の 負荷 方 法 実験 動 物 と して体 重20-25gのddY系 SARTス. ト レス:Hataら19)の. 雄 性 マ ウス(日 本SLC)を. 方 法 に 従 い,24℃. の そ れ ぞ れ に ケ ー ジを 用 意 し,午 前9時 か ら午 後4時. 使 用 した.. と4℃ に気 温 を 維 持 した 飼 育 室 ま で は1時 間 毎 に この2つ. のケ. ー ジ間 に マ ウ ス を交 互 に 移 し替 え ,午 後4時 か ら翌 朝 午 前9時 ま で の 間 は 低 温 側 の ケ. 3.
(10) 一 ジ で マ ウス を 飼 育 した.こ の 操 作 を数 日間繰 り返 した 後,ス 午 前11時. に ス トレス を 解 除 し,こ の マ ウ ス を30-60分. 供 した.特 に 述 べ な い 場 合 は,ス 低 温 ス トレス:マ. トレ ス 負 荷 の 最 終 日の. 間 室 温 に 放 置 した 後,実 験 に. トレス 負 荷 期 間 を7日 間 と した.. ウス を4℃ の 環 境 下 で1時 間,2日. 間 あ る い は5日 間 継 続 して 飼. 育 した. 拘 束 水 浸 ス ト レス(RWIS):マ. ウ ス を 金 網 製 シ リ ン ダ ー 内 に 拘 束 し,15℃. の水 中. に 立 位 に 胸 骨 剣 状 突 起 の 位 置 まで1時 間 浸 漬 させ た. 電 気 シ ョ ッ ク ス トレ ス:マ mA,1秒. ウ ス を 電 気 刺 激 用 ケ ー ジ に入 れ,床. グ リ ッ ドよ り3. 聞 の 電 気 刺 激 を5秒 毎 に30分 間 与 え る こ と に よ りス トレス を 負 荷 した.こ. の 操 作 を1回 の み 行 った 場 合 を急 性 負荷,1日1回. 宛5日. 間 行 う場 合 を慢 性 負 荷 と し. た. 拘 束 ス トレス:マ ま で の15時. ウス を 金 網 製 シ リンダ ー内 に拘 束 し,午 後6時. か ら翌 朝 午 前9時. 間 を室 温 で 放 置 した,慢 性 ス トレス 実 験 で は,こ の 操 作 を5日 間 繰 り返. し行 った マ ウス を用 い た.対 照 群 に は,同 様 の ス ケ ジ ュー ル で 絶 食 絶 水 の みを 行 った.. 9‡ 雲而 ♪ 面 妨 堂 醒1栓杏 御b冨. ψダ■b」▲-盈 ㌔一ロー且量 且」L■匹ノ㌧. 」"剛9一. 工 一 テ ル 軽 麻 酔 下 で マ ウ ス の 心 臓 よ り血 液 を 採 取 し た.赤. 血 球 数,白. 血 球 数,ヘ. モ. グ ロ ビ ン 量 お よ び ヘ マ トク リ ッ トの 測 定 はCou】tercounter(modelSp,Coulter Electfonics)に. よ り行 っ た ・ ま た 全 血 比 重 は 硫 酸 銅 法15)に. 板 は ヒ トに 比 べ て 数 が 非 常 に 多 く,ま に よ り 血 小 板 数 を 測 定 した.こ 断 し,浸. よ り 調 べ た.マ. た 小 さ い た め,Coultercounterを. ウ スの 血 小. の 場 合,マ. 用 い ず 目視 法. ウ ス の 尾 を そ の 先 端 よ り1cmの. 位置で切. 出 す る 血 液 を マ イ ク ロ ピペ ッ トで 採 取 し,Brechera皿dCronkite2°)法. に従 っ. て 位 相 差 顕 微 鏡 下 で 血 小 板 数 を 算 定 した.な の 場 合 も午 前11時. か ら12時. お,日. 内 変 動 を 考 慮 し て,採. 血 は いず れ. の 間 に 行 っ た.. 3.骨 髄 巨 核 球 数 の 測 定 マ ウ ス の 左 右 両 大 腿 骨 を 摘 出 し,野 す な わ ち,大 た,こ. 腿 骨 の 両 端 を 切 断 し,骨. 村21)の. 方 法 に 準 じ て 骨 髄 巨 核 球 数 を 測 定 し た.. 髄 を1mlの5%EDTA-2Na溶. の 細 胞 浮 遊 液 を 均 一 化 し た 後,0.025%ゲ. Fuchs-Rosentha】. 液 中 に洗 い 出 し ン チ ア ナ 紫 で 染 色. 計 算 板 を 用 い て 光 学 顕 微 鏡 下 で 巨 核 球 数 を 測 定 し た.こ 4. し,. の 計数 操作.
(11) を3回 繰 り返 して 平 均 し,大 腿 骨1本 あ た りの 総 巨核 球 数 を 算 出 した.さ. らに,左 右. 大 腿 骨 の 総 巨核 球 数 の 平 均 値 を 求 め,こ れ を各 マ ウス の 骨 髄 巨核 球 数 と した.. 生 出血 時 間 の 測 定 ONeil22)の. 方 法 に 従 っ て,無. 麻 酔 下 で マ ウ ス の 出血 時 間 を 測 定 した.す. マ ウス を 不 透 明 の プ ラ ス チ ッ ク製 シ リ ンダ ー 内 に 固 定 し,37℃ 理 食塩 水 中 に尾 部 の み を浸 した.5分 よ り1cmの. な わ ち,. に 保 温 した0.9%生. の安 静 期 間 後,鋭 利 な カ ミソ リで 尾 を そ の 先 端. 所 で 切 断 し,完 全 に止 血 す る ま で の 時 間 を 測 定 した.な お,30秒. 以内. の 再 出 血 の な い 場 合 を 完 全 止 血 と した.. 5.脾 臓 摘 出 ペ ン トバ ル ビ タ ー ル 麻 酔 下 で マ ウス の 腹 側 部 よ り脾 臓 を 露 出 し,主 血 管 を 縫 合 糸 で 縛 った の ち脾 臓 を 摘 出 した.偽 手 術 は脾 臓 を 露 出す る ま で と した 。 予 備 実 験 に お い て, 血 小 板 数 の 増 加 は 摘 脾 後7-9日. で最 大 か つ 安 定 して 認 め られ た 。 そ こ で,非. ス マ ウ ス の 血 小 板 数 測 定 は 手 術 の8日 後 と し,SARTス. ス トレ. トレ ス 群 で は 手 術 の2日. 後. よ り6日 間 の ス トレス 負 荷 を 行 った 。. 6.化. 学 的 除 神 経. マ ウ ス に6-hydroxydopamine(Sigma)50mg!kgを. 腹 腔 内 投 与 し,そ. の3時. 間 後12). に 出 血 時 間 を 測 定 し た.. 乳 統計 学 的処理 法 得 ら れ た 結 果 は 平 均 値 と 標 準 誤 差 で 示 し,群 Studentの. 対 応 の な い'検. 合 もp<0.05の. 時,有. 間 の統計 学 的有 意 差 の有 無 の 判 定 は. 定 あ る い はNewman-Keuls検. 意 と し た.. 一5. 定 に よ り 行 っ た.い. ず れ の場.
(12) 皿 実験結果 1.種 々 の ス トレス を 負 荷 した マ ウス の 血 液 学 的諸 変 化 SARTス. トレス マ ウ ス の 血 液 学 的所 見 を 一 般 的 に よ く用 い られ る 短 期 の ス トレス を. 負 荷 した マ ウ ス の そ れ と 比 較 してHg1に. 示 した.赤 血 球 数 とヘ マ トク リ ッ トは2日. 問 の 低 温 ス トレス を 除 くい ず れ の ス トレス 負 荷 に よ って も有 意 に 増 加 して い た.ヘ モ グ ロ ビ ン量 お よ び 全 血 比 重 は 低 温 ス トレス や 拘 束 ス トレス で は有 意 な 変 化 を 示 さ な か っ た が,SARTス. トレス,RWISお. 血 球 数 はSARTお. よ び 絶 食 絶 水 に よ っ て 有 意 に 増 加 して い た.白. よ び 低 温 ス トレス を 除 く他 の ス ト レス 負 荷 群 で 著 し く減 少 して い. た 。」 血小 板 数 に つ い て は 低 温 お よ び拘 束 ス トレス に よ り増 加 が 見 ら れ た の に 対 し, SARTス. トレス お よ びRWISに. こ の よ うに,SARTス. よ っ ては 逆 に 減 少 が 認 め られ た.. ト レス マ ウ ス で は 白 血 球 総 数 の 無 変 化 と 血 小 板 数 の 減 少 が. 。. …. こ:::::::=::ト. μ. 離震 一. X× 〉 〈XXXX>← H昼 昌 昌 昌H. ReSfroin雪. ト●畳. Fαs↑. Plq雪ele† ⊂xlO41μ ⊃. 0昌9一 Con↑rol SART. ゜Ol50. FOS↑. ρ65-. 骨齢. こ:::=:ト 踊 一 〔 コ. ". Res↑rolnf. G3 01.0551.060量. 〔 コ ■■■■ ■墜⇔骨. COld RWIS. 昌. 暑. RWIS. 鱒. ト ー ■■■■■■ ■墜鮪 一 こ====:=:]晶 一 唇蔓 こ:==:::}鷲. ト. SART Cold. 18. H↑(%} 0304050. 塑c(x撃3!μP6. Con曾roI. 熟 ロ﹄巴ー. ;撫彗 艶. 制 蝉 口 蚤. 特 徴 的 で あ った,. 隠 骨. Fig.1.Hematologicalprofilesinstressedmice.n=7-13.*P<0.05,**P<0.01。. 一6.
(13) 2.マ ウ ス の血 小 板 数 な らび に骨 髄 巨核 球 数 に お よ ぼす 種 々の ス トレス の 影 響 種 々 の ス トレス に よ る 血 小 板 数 の 変 化 に っ い て さ らに 詳 細 に 検 討 した 結 果 をFig.2 に 示 した.急 性 ス トレス で は,RWISに 束 に よ る 増 加 が 見 られ た が,1時 認 め られ な か っ た.一. よ る血 小 板 数 の 減 少,電 気 シ ョ ック お よ び 拘. 間 の低 温 ス トレス お よ び 絶 食 絶 水 で は 有 意 な 変 化 は. 方,慢 性 的 負 荷 で はSARTス. トレ ス に よ る 減 少 と2日 間 の 低. 温 ス トレス に よ る増 加 が 認 め られ た が,他 の ス トレス で は 有 意 な 血 小 板 数 の 変 化 は 見 られ な か っ た. 次 い で,血 小 板 産 生 系 に 変 化 が 生 じて い る か否 か を 検 討 す る 目的 で,種 トレス を 負 荷 した マ ウ ス の 骨 髄 巨核 球 数 を 調べ た.Table1に ス トレス マ ウ ス で は 巨核 球 数 が40%以. 々の 慢 性 ス. 示 した よ うに,SART. 上 も増 加 して い て い た が,他. の ス ト レス マ ウ. ス で は 有 意 な 変 化 は 認 め られ な か っ た.. Acロteexposure. Stress. Chronicexposure. Relativeplateletcount(%)(Mean±S.E.). 0. 50100050100 ゜. °. 「. °1■IFlIL,. 一r噛咄 ア. ,`1. Controi. 浄. 申. SART. 1. Cold. 申. ;. 申**. ミ. !. 申. 1 RWIS. 申**1;. EIectroshock. 申. 申* :. Res亡ralnt. 浄*. 争. 1. Fast. :. 魯〕. 申**. 申. Fig.2.Plaleletcoun重sinmiceexposed重ovarioustypesofstres&Acutestresswas ploducedbyexposurewithinlday,andchronicstresswasproducedbyrepeatedor continuousexposurefor5-7days,exceptfbra),bei鼓gexposure員)r2days.Controlvalue: 1359±3.3and141.8±5.Ox1041μ1inacuteandchronicexperiments,respectively. n=6-10.*P<0.05,**Pく0.01.. 一7一. 申.
(14) TabletMegakaryocytecountsinmiceexposed重ova「ioustyPes ofchronicstress. Stress. Megakaryocytecoun重Change (xユ03/femur)(%). Control. 6.92±0.33. SART. 9.95±0.32**. Co里d2-dayexposure. 6.61±0.49. 5-dayexposure. 7.24±0.79. Electroshock. 7.58±0.69. Restraint. 6.27±0。60. Fast. 6.54±0,59. 43.8 -4 .5 4.6 9.5 -9 .4 -5 .5. Micewereexposed童os甘essfor5-7days,unlessotherwisenoted. n=16(controlgroup)or6-9(stressedgroup).**P<0.01.. 3.SARTス. トレス 負 荷 期 間 中 な らび に 負荷 中止 後 の 血 小 板 数 お よ び 骨 髄 巨核 球 数 の. 経 日変 化 Fig.3にSARTス. トレス 負 荷 に 伴 う血 小 板 数 と 巨核 球 数 の 経 日変 化 を 示 した.マ. ス の血 小 板 数 は ス トレス負 荷 開始3日 後 ま で は ほ と ん ど変 化 しな か っ たが,5日 り有 意 に 減 少 し,7日. ウ. 後よ. 後 に最 小 値 を 示 した.そ の後,こ の 血 小 板 数 の 減 少 は少 な くと. も14日 後 ま で は 持 続 して い た.一 一方,巨 核 球 数 は5日 後 よ り有 意 に 増 加 し始 め,7 日後 に プ ラ トー に 達 した 後,こ の 値 が 少 な くと も14日 後 ま で は 維 持 さ れ て い た.す な わ ち,ス. トレス 負 荷 期 間 中血 小 板 数 と 巨核 球 数 の 変 化 の 発 現 は 並 行 して い た 。. F培4は ス トレス 負 荷 中 止 後 の 血 小 板 数 の 回 復 過 程 を 示 して い る.マ 数 はRWISお. よ びSARTス. トレス い ず れ の 負 荷 に よ っ て も25-30%減. ウスの血小 板 少 して い た が,. ス トレス 負 荷 中止 後,RWIS負. 荷 マ ウ ス の血 小 板 数 は3時 間 で 正 常 レベ ル に ま で 回 復. して い た の に 対 し,SARTス. トレス マ ウ ス で は5日 経 過 後 も な お 有 意 な 減 少 状 態 が. 持 続 して い た.. 4.SARTス Fig5に. トレス に よ る血 小 板 数 減 少 に お よぼ す 脾 臓 摘 出 の 影 響 示 さ れ る よ う に,摘. ら れ た(p<0.01vs.contioDが,偽. 脾 後 非 ス トレス マ ウ ス の 血 小 板 数 に著 明 な 増 加 が 認 め 手 術 で は 有 意 な 変 化 は み ら れ な か っ た.摘 8. 脾 後の.
(15) plateletandmegakaryocyte. Fig.3.TimecoursesofSARTstress-inducedchangesin countslnmlce.皿=740。**P<0.01vs。theinitialleve1.. Fig.4,RecoveryfromdecreasedplateletcountsinmiceafterthecessationofSART stressandRWIS.CIosedsymbo】s,stressedvalues;opensymboIs,vahesaft6rcessationof s重ress.Normalvalue:141.8±5.Ox104/μ1.n=4-10.*P<0.05,**P<0.Olvs.the no㎜alvalue。. 一9一.
(16) P1α 曾ele曾Coun含lxlO4!戸ll(MeGn士S.E.}. Treαme耐 ,O. Confrol. RG雪io 150¶. 50190.. N S. (S1N》. .. 1. o. O.82. 昌". ミ Shom. 欝 S. 11● 愚. ; Sp鰍. 0.88. ; :. ・。my讐. 申 o費. ミ. 邑. 0.87. 1. Fig.5.Influen㏄ofsplenectomyondecreasedplateletcounthlSART-stressedmice.N, non-stress;S,SARTstress.n=7-10.*P<0.05,**P<0.01vs.therespec重ivenon-stressed 9「OUPS・. Table2,InfluencesofSARTstress,RWIS段nd6-hydroxydopamine treatme皿tonbleedingtimeinmice. Treatment. Control SART RWIS 6-OH-DA. Bleedingtime(s). Change(%). 55.2±4.1 130.5±9.1** 66,1±7.0 72,4±13.8*. 6-OH-DA:Micere㏄ivedani.P.injectionwith50mg/kgof 6-hyroxydopamine3hbeforethemeasurement.n=19(con重rol group)anα7-8(treatedgroup)・*Pく0・05,**Pく0・01・. 一10一. 136.4 36.6 52.9.
(17) ス トレ ス,非. ス ト レ ス 両 群 間 の 血 小 板 数 の 比(0.87)は. ほ ぼ 同 じ で あ っ た.す. な わ ち,SARTス. 偽 手 術 後 の そ れ(0.88)と. ト レス マ ウ ス に お け る 血 小 板 数 の 減 少 は 摘. 脾 に よ っ て は 阻 止 さ れ な か っ た.. 5.SARTス. トレス マ ウ ス に お け る 出血 時 問 の 延 長. マ ウ ス の 出 血 時 間 に お よ ぼ すSARTス SARTス. ト レス の 影 響 を 調 べ,Table2に. ト レ ス マ ウ ス の 出 血 時 間 は 非 ス トレ ス マ ウ ス の そ れ に 比 べ,2倍. く延 長 し て い た.SARTス. 以 上 に著 し. ト レ ス と 同 程 度 の 血 小 板 数 減 少 を 惹 起 す るRWISを. し た マ ウ ス で は 出 血 時 間 の 延 長 傾 向 が 認 め ら れ た が,有 SARTス. 示 した.. 意 で は な か っ た.ま. ト レ ス と 同 程 度 の 体 表 面 血 流 量 の 増 加 を も た ら す こ と が 報 告12)さ. 6-hydroxydopamine50mg1宝gの. 投 与 に よ り52.9%の. IV考. 血 液 検 査 の 結 果,SARTス. れている. 有 意 な 出 血 時 間 延 長 が 認 め ら れ た.. ト レ ス マ ウ ス で は 赤 血 球 数,ヘ. ス 負 荷 マ ウ ス に お い て も 見 ら れ た こ と よ り,多. モ グ ロ ビ ン 量,ヘ. マ ト. れ らの 変 化 は 他 の 短 期 間 の ス ト レ. くの ス ト レ ス に 共 通 の 変 化 で あ る と考. 般 に ス ト レ ス の 際 に は 血 液 濃 縮 が お こ る こ と が 多 い15)と. 上 記 の 事 実 はSARTス. た,. 察. ク リ ッ トお よ び 全 血 比 重 の 増 加 が 認 め られ た が,こ. え られ る.一. 負荷. さ れ て い る が,. ト レ ス マ ウ ス に お い て も そ の よ う な 現 象 が 生 じて い る 可 能 性. を 示 唆 す る も の で あ る.一. 方,血. で 減 少 して い た の に 対 し,電. 小 板 数 はSARTス. 気 シ ョ ッ ク,拘. 束,絶. ト レ ス お よ びRWIS負. 荷 マ ウス. 食 絶 水 な ど の 急 性 ス トレ ス や2日. 間 の 低 温 ス トレ ス 負 荷 で は 増 加 し て い た こ と な ど か ら,血. 小 板 数 の 変 化 は ス トレス の. 種 類 に よ っ て 異 な る も の と 推 察 さ れ る. ヒ トで は 運 動 や 情 動 ス ト レ ス な ど の 急 性 負 荷 に よ り 一 時 的 に 血 小 板 数 が 増 加 す る と の 報 告23-27)が. 多 い.こ. れ は ス ト レス に よ る 血 中eplnephrine濃. 度 の 増 大 を 介 して 脾. 臓 に プ ー ル さ れ て い る 血 小 板 が 遊 離 さ れ た た め で あ る と 説 明 さ れ て い る24).ま ヒ ト28)や ラ ッ ト29)で はepinephrineの れ て い る,こ. れ ら の こ と よ り,今. た,. 静 注 に よ り血 小 板 数 が 増 加 す る こ と も 報 告 さ. 回認 め られ た急 性 ス トレス に よ る血 小 板 数 の 増 加 に. 11.
(18) っ い て もepinephrineを 介 した脾 臓 プ ー ル か ら の血 小 板 の 遊 離 が 関 与 して い る 可 能 性 が 考 え られ る.一 方,SARTス 阻止 され な か っ た こ と,ま. トレス マ ウス に お け る血 小 板 数 減 少 は 摘 脾 に よ って た この 動 物 で は 血 中epinepllrine濃 度 の 増 大 が 報 告 され て. い る3°)こと な どか ら,epinephrine一. 脾 臓 系 以 外 の 機 序 が 関 与 して い る もの と思 わ れ. る. 血 小 板 数 の 減 少 を 惹 起 す る ス トレス と して は 長 期 の 低 酸 素 負 荷 鋤 や 磁 場32),急. 性. の 低 体 温33)な ど の 特 殊 な もの が 報 告 さ れ て い るの み で あ る.こ の 低 体 温 に よ る血 小 板 数 減 少 は 門脈 で の 凝 集 血 小 板 の 蓄 積 を 伴 う消 費 性の もの で あ る と され て い る.本 研 究 で のRWISの 18-20℃)し. 水 温 は15℃. に設 定 した た め 体 温 が か な り低 下(負. 荷 中止 直後 で. て い た こ と よ り,こ の ス トレス に よ る 血 小 板 数 の 減 少 に は 低 体 温 が 関与. して い る の で は な い か と 考 え られ る.一 方,SARTス. ト レス マ ウス で は 少 な くと も. 採 血 時 に体 温 の 下 降 は 認 め られ な か っ た こ と よ り,低 体 温 の 直 接 的 な 影 響 は考 え 難 い. 循環 血 中の 血 小 板 数 は 骨 髄 にお け る血 小 板 の 産 生,脾 臓 な どに お け る 蓄 積 あ る い は 破 壊,血 管 内 で の 粘 着 ・凝 集 によ る消 費 な ど に よ って 調 節 さ れ て い る.摘 脾 実 験 の 結 果 よ り,SARTス. トレ ス に よ る血 小 板 数 減 少 に脾 臓 機 能 の 変 化 が 関 与 して い る 可 能. 性 は 少 な い と 考 え ら れ る.一 一方,血 小 板 産 生 細 胞 で あ る 骨 髄 巨 核 球 数 はSARTス. ト. レス に よ り著 し く増 加 した.通 常,巨 核 球 数 の 増 加 は 血 小 板 産 生 能 の 元 進 を 示 唆 す る と され て い る こ と よ り,血 小 板 産 生 系 の 変 化 がSARTス. トレス マ ウ ス の 血 小 板 数 減. 少 の 原 因 と は考 え 難 く,む しろ代 償 的 な 現 象 とい え る の か も しれ な い.し か し,ス. ト. レス 負 荷 過 程 の 血 小 板 と 巨核 球数 の 変化 が ほ ぼ 同時 進 行 して い た こ と よ り,巨 核 球 か らの 血 小 板 の 遊 離 能 の 低 下 な どが 生 じて い る可 能 性 も否 定 で き な い.い ず れ に せ よ こ の ス トレス に よ る血 小 板 数 減 少 に は よ り複 雑 な機 序 が 関 与 して い る と考 え られ,血 管 内 血 小 板 消 費 な ど も含 め た 総 合 的 な検 討 が 必 要 で あ ろ う. SARTス. トレス 負 荷 に伴 う血 小 板 数 減 少 の 経 日変 化 はSARTス. トレス 動 物 に お け る. 他 の 生理 的 異 常 の そ れ9'1°)に 概 ね 類 似 して い る が,変 化 の 発 現 に は 若 干 時 間 を 要 す る よ う で あ る.ま べ て,ス SARTス. た,SARTス. ト レス に よ る血 小 板 数 減 少 はRWISに. よ るそれ に 比. トレス 負 荷 中止 後 の 回復 に もか な りの 時 間 を 要 し,持 続 的 で あ っ た. トレ ス に よ る 血 小 板 数 の 減 少 は30%程. 度 で あ った の に対 し,出 血 時 間 は. 2倍 以 上 に も著 し く延 長 して い た.同 程 度 の 血 小 板 数 減 少 が み られ たRWIS負 ス で の 延 長 が36.5%で. あ っ た こ と よ り,SARTス 12. 荷マウ. トレス マ ウ ス では 血 小 板 数 以 外 の.
(19) 因 子 が 関 係 して い る 可 能 性 が 考 え られ る.SARTス に著 明 な増 加 が 認 め られ て い る12)が,同 dopamine50mg!kgの. トレス マ ウ ス で は 体 表 面 血 流 量. 程 度 の 血 流 量 増 加 を 惹 起 す る6-hydroxy-. 投 与12)に よ って も52.9%の. 出血 時 間 延 長 が み ら れ た こ と よ り,. ス トレス に よ る 血 流 量 増 加 が 増 強 因 子 と して 関与 して い る可 能 性 も考 慮 す る必 要 が あ る と思 わ れ る.ま た,血 小 板 機 能 や凝 固 ・線 溶 活 性 な ど他 の 止 血 機 能 に つ い て も検 討 を 要 す る と思 わ れ る が,こ れ らに つ い て は 次 章 以 降 で 述 べ る.. V小. 1)種. 括. 々 の ス トレ ス を 負 荷 した マ ウス の 血 液 学 的 所 見 を 比 較 した と こ ろ,SARTス トレス マ ウ ス で は 血 小 板 数 減 少 が 特 徴 的 で あ っ た.. 2)骨. 髄 巨核 球 数 はSARTス. トレス に よ っ て著 し く増 加 して い た が,他. の慢 性 ス ト. レス で は 変 化 しな か った 。 3)SARTス. トレス 負 荷 に伴 う血 小 板 数 減 少 な らび に 巨核 球 数 増 加 は いず れ も ス トレ. ス 負 荷 開 始5日 後 以 降 よ り認 め られ,14日 た,ス 4)SARTス 5)出. 間 継 続 負 荷 して も持 続 して い た,ま. トレス 負 荷 中 止 後5日 経 過 して も減 少 した血 小 板 数 は 回 復 しな か った. トレス に よ る血 小 板 数 減 少 は 摘 脾 に よ って 阻 止 され な か っ た 。. 血 時 間 はSARTス. 以 上 の 結 果 よ り,SARTス て い る こ とが,1つ. トレス に よ り2倍 以 上 に延 長 した 。 トレス マ ウ ス で は 血 小 板 数 減 少 を 伴 う 出血 傾 向 を 有 し. の 特 徴 と考 え られ る.ま た,こ の 血 小 板 数 減 少 の 発 現 に 骨 髄 巨核. 球 の 産 生 能 お よび 脾 臓 機 能 の 変化 が 関与 して い る 可 能 性 は 少 な く,血 管 内 血 小 板 消 費 の 増加 な ど他 の 要 因 の 関与 が 大 き い と考 え られ る.さ. らに,出 血 時 間 の 著 明 な 延 長 は. 血 小 板 数 減 少 の み に よ って は 説 明 し難 く,血 小 板 機 能 や 凝 固 一線 溶 活 性 な ど止 血 機 構 全 体 に つ いて の 検 討 を 要 す る こ とが 示 唆 され た.. 13.
(20) 第2章SARTス. トレス動 物 にお け る血小 板 の機 能 的変 化 1緒. 言. ス トレス に よ る血 小 板 の 機 能 的 変 化 に つ い て は特 に ヒ トで の 研 究 が 多 い が,報 告 さ れ て い る 結 果 は必 ず し も一 定 の 方 向 性 を有 して い な い34).急. 性 の 精 神 的 ス トレス や. 運 動 負 荷 に よ り,血 小 板 凝 集 能 の 充 進,低 下 の いず れ もが 報 告 され て い る25-27'3437) .一 方,実 験 動 物 を 用 い て ス トレス と血 小 板 機 能 の 関 係 を詳 細 に 調 べ た研 究 は 少 な い.Yoshiharaeta工33)は. 麻 酔 下 の イ ヌ の 体 温 を 強 制 的 に低 下 さ せ る と,血 小 板 数. の 減 少 を 伴 う凝 集 能 の 一 時 的 な 低 下 が み られ る こ と を 報 告 して い る が,よ 条 件 下 で の ス トレス,特 前 章 に お い て,気. り生 理 的 な. に慢 性 型 ス トレス に つ い て の 情 報 は ほ と ん ど得 られ て いな い.. 温 変 動 に基 づ く慢 性 型 環 境 ス トレス の1種. で あ るSARTス. トレ. ス を 負 荷 した マ ウス で は,血 小 板 数 減 少 を伴 う 出血 時 間 の 著 しい 延 長 が 認 め ら る こ と を示 した.し か し,こ の 出血 傾 向 は 血 小 板数 変化 の み で は 説 明 し難 く,血 小 板 の 機 能 変 化 そ の 他 の 要 因 が 関与 す る 可 能 性を 示 唆 した.そ こ で 本 章 で は,血 小 板 の 機 能 面 に お よ ぼ すSARTス. トレ ス の 影 響 を ラ ッ トを 用 い て 調 べ,特. 徴 的 な 所 見 が 得 られ た の. で以 下 に そ の 詳 細 を 記 した.. 皿 実験材料な らびに実験方法. 1.実 験 動 物 お よ び ス ト レ ス の 負 荷 方 法 実 験 動 物 と し て 体 重200-250gのWis重ar系 SARTス. ト レス の 負 荷 は,第1章. 定 を 一3℃ に して 行 っ た19).な か ら12時. 雄 性 ラ ッ ト(日 本SLC.)を. で 述 べ た マ ウ ス の 負 荷 条 件 の う ち,低 お,採. 血 お よ びinvivo実. 使 用 し た. 温側 の 温 度 設. 験 は す べ て 午 前1ユ 時30分. の 間 に 開 始 し た.. 2採 血 と多 血 小 板 血 漿 の 調 製 ペ ン トバ ル ビタ ー ル(40mg!kg)麻. 酔 下 で ラ ッ トを 開 腹 し,腹 大 動 脈 よ り5ml(最. ユ4.
(21) 終 容 量)の. 血 液 を1/10容. 採 取 し た.得. 量 の3.13%ク. る い はPRPの. 間 遠 心 し て 多 血 小 板 血 漿(PRP)を. 一 部 を1,700gで10分. 希 釈 し,30分. で 算 定 し た 後,. 採 取 し,さ. らに 残 りの 血 液 あ. 間 遠 心 す る こ と に よ り 乏 血 小 板 血 漿(PPP)を. の 血 小 板 数 が4x108cells/lnlと. のPPPで. 含 む プ ラ ス チ ッ ク製 シ リン ジ 中 に. ら れ た 血 液 中 の 血 小 板 数 はBrecherandCronkite2°)法. 直 ち に160gで10分. た.pRP中. エ ン酸Naを. な る よ う に 各 ラ ッ トのPRPを. 間 静 置 し て 安 定 さ せ た 後,実. 験 に 供 し た.な. 得. 同一 個 体. お,上. 記 の 操作. は す べ て 室 温 で 行 っ た.. 3。Collagen溶. 液 の調製. 1藍vitro実. 験 用co恥gen溶. 液 は 井 下 ら38)の 方 法 を 改 良 して 調 製 し た.す. な わ ち,ウ. シ ア キ レ ス 腱 由 来 の 至型coHage襲(ナ. カ ラ イ テ ス ク)100mgを15耐. HC1中. 間 ホ モ ジ ナ イ ズ した 後,4℃,1,300gで5分. に 懸 濁 し,氷. 冷 し な が ら40分. 間 遠 心 し て 上 澄 を 採 取 し4℃ 含 む0.9%NaC1溶. で 保 存 し た 。 使 用 時,こ. 液 で 適 当 な 濃 度 に 希 釈 し た.こ. の0。03N. の 保 存 溶 液 を0.003NHC1を. のcollagen保. 存 溶 液 は 作 製 後1カ. 月 以 上 経 過 し て も な お 安 定 し た 活 性 を 示 し た. 1黙vivo実. 験 用coilagen溶. 液 は 松 村 ら39)の 方 法 に 従 っ て 調 製 し た,即. 膚 由来 の1型collagen(Sigma)エ02mgを40mlの0。9%NaC1溶 15時 間 撹 拝 しな が ら溶 解 し た 後,1,000g,4℃. ち,仔. ウ シ皮. 液 に 添 加 し,4℃ で 遠 心 して 上 澄 を 採 取 し,実. で. 験 に使. 用 した. 上 記 両collagen溶. 生Invitro血 Invitro凝. 液 中 の タ ンパ ク 量 は い ず れ もLowryら4°)の. 方 法 に よ り測 定 し た 。. 小 板凝集 能 の測定 集 能 はBom41)の. を 用 い て 測 定 し た.PRP475μ1を 拝 しな が ら2分. 比 濁 法 に 準 じて,血. 小 板 凝 集 計(CAF-100,日. 本 分 光). グ ラ ス キ ュ ベ ッ トに 入 れ,37QC,1,000rpmで. 間 イ ン キ ュ ベ ー トし た 後,ADP(Sigma)ま. 撹. た はcollage皿 溶 液25μ1. を 添 加 し 、 光 透 過 度 の 相 対 的 変 化 を 記 録 した.. 5.lnvivo血. 小 板凝集 能の 測定. Innocentiら42)の. 方 法 を 若 干 修 正 し て 行 っ た ・ ペ ン トバ ル ビ タ ー ル(40mg!kg)麻. 下 で 気 管 切 開 し た ラ ッ トの 左 頸 動 脈 に250U!mlの 15. ヘ パ リ ン(清. 水 製 薬)を. 酔. 満 た した.
(22) ポ リエ チ レ ンチ ュ ー ブ(外 径1mm)を ロ ピペ ッ トで10μ1つ っ た後,右. 挿 入 し,こ の カ ニ ュ ー レ よ り血 液 を マ イ ク. つ 採 取 し,血 小 板 数 を 算 定 した.安 静 状 態 で 最 初 の 採 血 を行. 大 腿 静 脈 よ りADPま. た はco】】agenを直 接 注 入 し た.こ の 場 合,ADPは2. 秒 以 内 で 全 量 を 急 速 注 入 し,ま たcollagenは05mg!kgZminの. 一 定 速 度 で 注 入 した.. 各 刺 激 剤 注入 終 了 後 採 血 を3回 繰 り返 し行 い,循 環 血 中 の 血 小 板 数 の 経 時変 化 を 調 べ た.刺 激 剤 注 入 後 の血 小 板 数 は注 入 前 の 値 に対 す る パ ー セ ン トで 表 示 し,循 環 血 中血 小 板 数 の 相 対 的 減 少 の 大 き さをinvivO血. a血. 小 板 凝 集 能 とATP放. Feinmanら43)の. 小 板 凝 集 能 の 指 標 と した.. 出 能 の 同 時 測定. 方 法 に 準 じ て 行 っ た.PRP425μ1に40mg!m1の. ル シ フ ェ ラ ー ゼ(Sigma)溶. 液50μ1を. 添 加 し,1,000rpmで. 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト した 後,coUagen溶. 液25μ1を. 度 の 変 化 を ル ミア グ リ ゴ メ ー タ ー(CAF一 応 終 了 後,ATP標. Holmsenら44)の. 透過度 お よび発光強. 用 い て 同 時 測 定 した.反. な わ ち,PRPO.5mlに. ル ビ ン 酸 キ ナ ー ゼ(オ. レ イ ン 酸 緩 衝 液(pH7.6)か 液3mlと 変 換 した.反. 小板 中. 澄 の 一 部(20. 光 純 薬),5.2mMKα,1.6mM. リエ ン タ ル 酵 母)お. よ び8mMト. リ ス ーマ. ら な る ホ ス ホ エ ノ ール ピル ビ ン酸 一 ピ ル ビ ン 酸 キ ナ ー ゼ 混 合 し,37℃ 応 混 液 を80℃. のfire且yIantemextract(Sigma)溶 総adeninenucleolides(ATP+ADP)量 間)PEP_PK溶. 添 加 し,血. 間 遠 心 後,上. ス ホ エ ノ ール ピル ビ ン酸(和. MgCl2,2UIInlピ. 同容量 の. 鶴1:9,pH7.4)を. 抽 出 し,4℃,1名000gで15分. μ1)を,α04mMホ. と に よ りATP量. で2. の測定. 液(0.1MEDTA二99.5%ethano玉. のadeninenucleo面esを. 20分. 添 加 し,光. ユ00,日 本 分 光)を. 方 法 に 従 っ て 行 っ た.す. EDTA-ethan。1混. をATPに. 混 合 し な が ら37℃. 準 液 を 添 加 して 基 準 発 光 量 を 測 定 し た,. 乳 血 小 板 中adenhenucleotides量. (PEP-PK)溶. ル シフ ェ リン ー. で30分 で6分. 間 イ ン キ ュ ベ ー トす る こ と に よ りADP 間 加 熱 し て 反 応 を 終 了 さ せ,10mg!m1. 液 と 希 釈 試 料 溶 液 と の 反 応 に よ る 発 光 量 を 測 定 し, を 調 べ た ・ 別 途,酵. 素 を 熱 失 活 さ せ た(80℃,. 液 と 試 料 溶 液 を 同 様 に イ ン キ ュ ベ ー ト後,発 を 調 べ,先. の 総adeninenuculeotides量. た.. 16. 光量 を測定す るこ. と の 差 よ りADP量. を算 出 し.
(23) 8、血 小 板 のserotonin放. 出能 と含 量 の測 定. DrummondandGordon45)の (最 終 濃 度. 方 法 に 準 じて,PRP475μ1にcoUagen溶. こ10μ9!ml)を. 添 加 し,1,0001pmで. キ ュベ ー ト し た 後,10mMEDTA溶 に4℃,12,0009で2分. で5分. で10分. フ タ ル ア ル デ ヒ ドと10NHCIと. 間 加 熱 し た.冷. る こ と に よ り,collagenと. 小 板 中 に 残 存 し て い たse姻o血. 】. 間イ ン. 添 加 に よ り反 応 を 終 了 さ せ,直. 間 遠 心 し た ・ 上 澄 お よ び 沈 渣 に そ れ ぞ れ100%ト. を 加 え て 非 特 異 的 蛍 光 物 質 を 除 去 し,水 475㎜)す. 混 合 し な が ら37℃. 液50μ1の. 酸 を 添 加 して 除 蛋 白 後,05%伊 を 添 加 し,100℃. 液25μ. 却 後,両. ち. リク ロ ロ酢. の 混 液(1:10)2m1. 試 料 に そ れ ぞ れ ク ロ ロ ホ ル ム2m1. 相 に っ い て 蛍 光 強 度 を 測 定(EX360㎜,EM. の 反 応 に よ っ て 放 出 さ れ たsemton㎞. 量 ㊤)を 算 出 し た 。Serotoni麺. 量(A)と. の 放 出 率(Oは. 血. 次式 よ. り算 出 し た. C(%)=A1(A+B)x100 一方. ,血. 小 板 のserotonin含. 量 に つ い て は,別. 2分 間 遠 心(4℃,12,000g)後,沈. 途PRPに10mMEDTAを. 渣 中 のseroto血. 添 加 して. 量 を 上 記 と 同様 の 方 法 で 測 定 す る. こ とに よ り調 べ た 。. 甑 洗浄血 小板 の凝 集能 の測定 洗 浄 血 小 板 は 異 な っ た2方 洗 浄 法A:Tomi重aら46)に 5認. 法(下. 記Aお. よ びB)に. よ り作 製 し た.. よ り改 良 さ れ たBaenz韮gerandMa∫erus47)の. 方 法 に 従 い,. の 洗 浄 液(αU3MNaC1,4。3mMK2HPO4,4.3mMNa2HPO4,24.4mM. NaH2PO4,55mMglucoseお を 洗 浄 し,得 MNaC1お. よ び1mMEDTA,pH65)で. ら れ たpelle重 を 血 小 板 数 が4x108cells/mlと. よ び5mMglucoseを. 添 加 し,collagen凝. の 方 法 で 洗 浄 さ れ た 血 小 板 はADP刺 洗 浄 法B:田. 上48)に. よ り 改 良 さ れ たMustardら49)の. 血 小 板 を3回. 添 加 し た 後,coHagenお. に懸 濁 した ・. 集 能 を 測 定 し た.な. お,こ. 方 法 に 準 じ て,ADPに. な わ ち,3U/m1のapyraseを. 洗 浄 し た 後apyraseを. よ びADP刺 17一. よ り. 含 むHEpES-. 含 ま な いHEPEs-Tyrode液. に 再 懸 濁 し た ・ こ の 洗 浄 血 小 板 浮 遊 液 に15mMCaC12お. の 籔brinogenを. 分). 激 に よ っ て 凝 集 しな い.. 凝 集 し う る 洗 浄 血 小 板 を 作 製 した.す Tylode液(pH6.7)で. ッ ト1匹. な る よ う 再 浮 遊 液(0.14. 含 む ユ5mMTris-HCIbuf￡er,pH74)中. こ の 血 小 板 浮 遊 液 に15mMCaCl2を. (pH7.4)中. 血 小 板(ラ. よ び04mg∠m玉. 激 に よ る 凝 集 能 を 測 定 した..
(24) 1α 血 小 板 中 の 蛋 白 質 お よ びcholestero1量 上 記 洗 浄 法Aに ら4°)の. の測 定. よ り作 製 し た 洗 浄 血 小 板 を 丘eeze一血awingし,蛋. 方 法 に よ り,ま. たto観cholestelo1量. 白 量 をLow琢. を 酵 素 法(COD-DAOS法)5°)に. より. 測 定 し た.. 11.循 環 血 中の 凝 集 血 小 板 の 検 出 Mar薩nsら51)に よ り改 良 さ れ たWuandHoak52)の. 方 法 に 従 い,高 濃度EDTAに. よ り血 中凝 集 血 小 板 を 解 離 させ た 場 合 と,fomlali皿 に よ り そ の解 離 を 阻 止 した場 合 の 血 小 板 数 の 差 よ り循 環 血 中 凝 集 血 小 板 の 存 在 の 程度 を 調 べ た.す な わ ち,無 麻 酔 下 で ラ ッ トの 尾 動 脈 よ り血 液 を採 取 し,そ. の 一 部 を12mMEDTAを. bu描ered謝ine(EDTA-pBS,pH74),9容 を 含 むEDTA-PBS,9容 謝ineで さ ら に120倍. 含 むphosphate-. 量 で希 釈 し,残 りの 一 部 を0.2%fo㎜alin. 量 で希 釈 した.両. サ ンプ ル を 室 温 で15分. 間放 置 した後,. に 希 釈 し,位 相 差 顕 微 鏡 下 で遊 離 血 小 板 数 を算 定 した.循 環 血. 中 凝 集 血 小 板 の 存 在 は,用 い た希 釈 液 中のfomla1董nの有 無 に よ る遊 離 血 小 板 数 の違 い, あ る い は そ の 比 か ら推 定 した.. そ の 他,記 載 の な い もの に つ い て は第1章. と 同 じ方 法 で 行 った.. 皿 実験結果 1.ス トレス 負 荷 に伴 う ラ ッ トの血 小 板数 の 変 化 Fig6に ス トレス 負 荷 に 伴 う ラ ッ トの 血 小 板 数 の 経 日変 化 を 示 した.ラ 板 数 は,ス. トレス 負 荷 開 始5日 後 よ り有 意 に 減 少 し,7日. ッ トの血 小. 後 に最 低 値 に達 した 後,こ. の レベ ル が 少 な くと も1週 間 持続 した.こ の よ うな経 日変 化 は,第1章. で示 した マ ウ. ス で の 結 果 と ほ ぼ 一 致 して お り,種 差 は 認 め られ なか っ た.. 2.lnvitro血. 小板凝 集能 の変化. ス ト レ ス 負 荷 お よ び 非 負 荷 ラ ッ トよ り 得 ら れ た 血 小 板 のinvitroで. ユ8. のtypica1な.
(25) Fig。6.Time-reヨatedchangesinplateletcoun量inratsdufingSARTstress.n蕩9-11. *P<0. ADP凝. .05,**P<0.0ユv&theiniti紋llevel.. 集 曲 線 をFig.7に. 示 し た.PRPに3-10μMのADPを. 添 加 す る こ と に よ り,. 非 ス ト レ ス ラ ッ トで は 濃 度 依 存 的 に 可 逆 的 な 血 小 板 凝 集 が 認 め ら れ た.ス トの 血 小 板 凝 集 は い ず れ のADP濃 小 さ か っ た ・Fig.8は. トレス ラ ッ. 度 で も 非 ス ト レ ス ラ ッ トの そ れ に 比 べ て 明 ら か に. 多 数 例 か らの 結 果 を ま と め た も の で あ る が,ADP3-10μMの. 濃 度 範 囲 で は 血 小 板 の 最 大 凝 集 率 は い ず れ もス トレス 群 の 方 が 非 ス トレス 群 に 比 べ て 有 意 に 小 さ く,ス Collagen刺. ト レ ス 負 荷 に よ るADP凝. 激 に よ るtypi(別 な 凝 集 曲 線 をFig.9に. て,coliagenは3-30μ9/mlの. れ た が,非. ス ト レ ス ラ ッ トに お い そ れ に 続 く不 可. ト レ ス ラ ッ トの 血 小 板 は,3μg!m1のco】lagenに. み を 示 し,凝. 集 しな か っ た.5μg/m1以. 大 き さ を 指 標 と し て,ス. 大 凝 集 率,凝 ト レス,非. 添 加 に よ り,最. より. 上 では血 小板凝集 が認 め ら. ス ト レ ス ラ ッ トの 場 合 に 比 べ て 程 度 は 弱 か っ た.Fig亙0はcollagen刺. よ る血 小 板 凝 集 能 を,最. 3-30μ9加1の. 示 し た.非. 濃 度 範 囲 で 血 小 板 のshapechangeと. 逆 的 な 凝 集 を 惹 起 した.ス shapechangeの. 集 能 の 低 下 が 示 唆 さ れ た.. 集 発 現 ま で のIagtimeお. 激に. よ びshapechangeの. ス ト レ ス 両 群 問 で 比 較 した も の で あ る.Collagen. 大 凝 集 率 は 濃 度 依 存 的 に 増 大 し た が,3-10μ9/mlの. 濃度 範 囲 で ス トレス 群 の 最 大 凝 集 率 は 非 ス トレス 群 に比 べ て 明 らか に 小 さ か っ た 。 19.
(26) Anon-s曾. 「ess●d「ot. ASART≧s曾ressedrα. 曾. IOPM Bos● 、璽ine. lnl" H. Fig.7,TypicaIcurvesfor. ADP-inducedplateletaggregationinnon-stressedand. SART-stressedrats.. 寂 ︾5 冨呂 2 9 0 ε 5三 琶 Σ Fig.8、Invitroplateletaggreg段tioninducedbyADPinnon-stressedandSART-stressed rats.Opencohmn,non-stress;closedcolumn,SARTstress.nニ80r9.*P<0.05, **Pく0. .01,. 一20一.
(27) Anon-Sfressedro曾. ASART吻s曾ro5sedro,. ⊆2の切旧 ε 切§ と 三 2 ﹂ 95物5n H. Fl9.9.Typicalc翌rves. innon-stressedand. forcollagen-inducedp董ateletaggregat量on. SART-stressedrats.. 《%,Mo翼im駈mo99『ego曾i◎. 動. くm董網o》 2. 60. し09髄me 40◎ (mm》 20 20 10 S駐opochonoe O35105003510 30C o麗ogen(μ9!ml,Co川ogon{四!ml}. Fig.10.Invitroplateletaggregationinducedbyco】1ageninnon-stressedand SART-stressedrats.Opencircle,non-stress;dosedcircle,SARTstress。n=9-12. a)themea皿withS.E.ffomratsshowingaggregation(4ratsoutofユ0). *P<0. .05,**Pく0,01,***P<0.001.. 一21一.
(28) LagtimeはcoHage皿. 濃 度5-30μg∠. に 延 長 し て い た.一. 血董の 範 囲 で. 方,shapechangeに. い ず れ もス トレス 群 に お い て有 意. つ い て は,今. 回 用 い たcoilagenの. 濃度範囲 で. は 両 群 間 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た.. aInviVO血. 小 板凝集能 の変化. Fig.11はinvivoで 注 に よ り,非 60秒. のADP凝. 集 能 を 調 べ た 結 果 で あ る ・ADPo.2mg!k9の. ス ト レ ス ラ ッ トの 血 小 板 数 は20秒. 後 に は ほ ぼ 完 全 に 回 復 して い た.ス. ら れ た が,20秒. 後 に は 静 注 前 の 約30%に. 減 少 の 程 度 は 有 意 に 小 さ か っ た.ADPの. 少 率 が 大 き く な り,非. v凡. ス ト レ ス ラ ッ トに 比 べ て. 投 与 量 を1mg!kgに. 増 量 す る と,20秒. 場 合 と 同 程 度 で あ っ た が,ス. 注 入 に よ り,. 後 に は 注 入 前 の 約45%と. の 血 小 板 数 減 少 は 若 干 の 回 復 傾 向 が 認 め ら れ た も の の,注. み. コ ヘユ ゆ リヲ 切 モヨピむ き 寸机 コレ リフい11いA5'レ. 小 板 数 は 約80%に が 持 続 し た.注. セ. ロ. つ リ. コ リデけ の 八 フ ツpu縞1ロ. 減 少 し た が,そ 入3お. よ び10分. ス 群 に 比 べ て 有 意 に 多 く,ス. の 後,そ. っコ ロふ ヨ ロリ 」川 里 のco⊥1agen辻 人Kよ. ア. 後 にお. の . ロ ダユ ノ り1舛 伎み ふヂ に 皿ノ. れ 以 上 の 減 少 は 認 め ら れ ず,こ. の レベ ル. 後 の血 小 板 数 は いず れ も ス ト レス群 の 方 が 非 ス トレ. ト レ ス に よ るinvivocoHagen凝 増 量 す る と,血. 集 能 の 低 下 が 示 唆 され. 度 を1mg!kgに. 度 に 減 少 し,両. 群 間 で 減 少 の 程 度 に 大 き な 差 は 認 め られ な く な っ た.. 4.血 小 板 のadeninenucleotides放. 小 板 数 は 注 入 前 の10%以. 下 に ま で極. 出 能 と含 量. 時 記 録 し たcoUagen刺. typicalな パ タ ー ン を 示 し て い る.ス μ9∠m1の. な っ た.. 入10分. に て ロロ しヨ あ . た.CoHagen濃. Fig.13は,同. 後の. トレス群 で は 減. 凝 集 能 を 示 して い る.CollagenO5mg!kgの. 非 ス ト レ ス ラ ッ トの 血 小 板 数 は 徐 々 に 減 少 し,3分. ず ザ. あ り,非. ス ト レ ス 群 と の 間 に 有 意 な 差 が 認 め ら れ な く な っ た.. Figl2はhwivoco皿age皿. そ の 後,こ. 減 少 した が,. ト レ ス ラ ッ トに お い て も 同 様 の 傾 向 が 認 め. 後 の 血 小 板 数 は 静 注 前 の 約56%で. 減 少 率 は 非 ス ト レ ス 群 で は0.2mg!kgの. 急速静. 添 加 に よ る 血 小 板 のATP放. 激 に よ る 血 小 板 のATP放. 出お よび凝集 曲 線 の. トレ ス ラ ッ トに お け るcollagen3お 出 能 お よ び 凝 集 能 は,非. れ ら に 比 べ て い ず れ も 明 ら か に 小 さ か っ た.Fig.14は,ATP放. よ び5. ス トレ ス ラ ッ トの そ 出の 最 大 値 お よ び 最. 大 凝 集 率 を 指 標 と し て 多 数 例 よ り 得 られ た 結 果 を ま と め た も の で あ る.Collagen3 お よ び5μg∠mlの. 濃 度 範 囲 で は,ス. トレ ス 群 の 放 出 能 お よ び 凝 集 能 は い ず れ も非 ス. ト レ ス 群 の そ れ ら に 比 べ て 有 意 に 低 下 し て い た. 一22.
(29) O O ー. 0 5. =oお ■8 噛 軸 09 ε2 α ち ま } 芒38 ↑22 コα 2 鴇039﹂ δ. OO206 0碁8002060. 180. Timeo脅erADP而ec曾io"(sec》. Fig.1tInvivoPlateletaggregationinducedbyrapidintrave皿ousinjectionofADPin non-stressedandSART-stressedrats.Opellcircle,non-stress;c】osedcircle,SARTstress。 n=50r11.**P<0.01vs.thecorrespondillgnoI1-stressedvalue.. 0 ◎ 腰 0 5. 含掌 2 ε 竃 o冒 旧 2α 蜘 o 調︾ ↑ § 8 伽22 0覧 Oεち 甲 3 ﹄δ. 10013 Timeo鱈ercoilo9●oinjec曾ioo{min). Fig.12.InvivoPlateletaggregationinducedbyintravenousir噸ectionofcollagenin non-stressedandSART-stressedrats.Opencircle,non-stress;closedcircle,SARTstress, n=4-7.*P<0.05vs.thecorrespolldingnon-stressedvalue.. 一23一. 10.
(30) 一. 5餌9/mloo騨ag㎝. 3芦9/耐co額ageo S量沿880d. Uns萱re88ed AlrP「e書ea8e 4鉾 鯛. 09艦OO◎oε βヨ 一. 4山. 4μ 鯛. 4淵. Co韓. A㎜oatioO ◎噛 oゆ哲 藍﹂引ゆ藍◎﹂ 劇 一蚤 ﹂. 笥曲. Fig.13.SimultaneoustypicaIrecordingsofplateletaggregationandATPreleasein non-stressedandSART-stressedrats。AuthenticATP(4μM)wasaddedforcalibration ofIuminescence,after重hereactioncompletelyfinished.. 婁. ( =こ. しO O望冊29 ⊆﹂ 2≧旧 翼6雛. Fig.14.DeficiencyofcollageninducedaggregationalldATPreleasein platelets丘omSART-stressedrats. Opencolumn,noll-stress;closed 0. column,SARTstress.n=7-9.. 60. *P<0. 一24一. .05,**P<0.01,***P<0.001..
(31) Flg、15。Adenillenucleotidecontentsinplateletsfromnon-stressedandSART-stressed rats.Opellcolumn,non-stress;closedco董umn,SARTstress。n=6.**P<0.01.. 血 小 板 中adeninenudeotides量1こ よ りATP量. つ い て は,Fig。15に. の 有 意 な 低 下 が 認 め られ た が,ADP量. み ら れ る よ う に,ス. トレス に. に は 変 化 は み ら れ ず,ATP∠ADP. 比 は有 意 に低 下 した 。. 5.血 小 板 のserotonin放 Fig.16に. 出能 と含 量. 示 さ れ る よ う に,co1ユagen10μg/m玉. るserotoninの. 量 は,ス. の 添 加 に よ って 血 小 板 か ら放 出 さ れ. ト レ ス 負 荷 ラ ッ トで は 著 し く 滅 少 し て お り,ま. 放 出量 を 示 す 放 出 率 に つ い て も有 意 な 低 下 が 認 め ら れ た.さ い 静 止 血 小 板 中 のserotonin量. O洗. ら に,刺. た,相. 対的な. 激を与 え てい な. も ス ト レス に よ り有 意 に 減 少 して い た.. 浄血小 板の凝 集能. Table3は. 異 な っ た2方 法 で 洗 浄 した血 小 板 の 凝 集 能 を 調 べ た結 果 で あ る.ADp凝. 集 が 起 こ らな いAの され て い るBの. 方 法 で作 製 した洗 浄 血 小 板 のcollagen凝 集 能,ADP凝. 方 法 で 洗 浄 した 血 小 板 のADPお. よ びcollagen凝 集 能 の いず れ に も ス. トレス 群 と非 ス トレス 群 で有 意 な差 は 認 め られ な か った. 25一. 集 が保 持.
(32) Serotor暫. 髄relea8einduoedbvcollaoen. Se「otonincontent. Fig.16.Serotoninreleaseandcontentinplateletsffomnon-stressedandSART-stressed ra重s.Opencolumn,non-stress;c】osedcolumn,SARTstress.PIateletswerestimulatedby 10μg/mlofcollagen.n=80r9.*Pく0.05,**P<0.01.. Table3,Aggregabilityofwashedplateletsfromnon-stressedandSART-stressedrats Maximumaggregation(屠) Agonists. Non-streSS. 0. ± ± ±. 9 6 4. ■. 1 8 3. ± ± ±. 6 4 5. ● ● ● ●. ■. 54.8. 7 2 5. ●. ± ま 士. 0. ●. 2 4 3. ●. ●. ■ ●. ●. 6 9 2. ■. 5 7 7. 1凸5 5 2 5 7. 7 2 6. ■. 0. plate】etspreparedessenllallybythemethodofMustardeta1.49)werestimulatedwithADP. 3 噌 ⊥5. 30.6 44.9. ■. 8 2 6 2 5 7. ●. andstimulatedwithcollageninthepresenceofl5mMCa.n=7-9.B)Washed. 一26一. 2 2 4. ●. A)Pla重eletswerewashedessentiallyaccordingtothemethodofBae皿zigerandM{虹erus47),. orcollageninthepresenceofl.5mMCaandO、4mg〆mlflbrinogen.n=50r6.. 5 4 1. 55.8. ±. 79.4. 十胴 ±. 3. ● O ● -Q Ω∪ - 占. 工2.0. ± ± 士. (四/ml) 0.3 1. 6 5 2. Collagen. ± 士 土. ●. 30.0 51.3 54.4. 3 10. 3 4 5. ■. (pM) 1. ■. B)ADP. 6 2 0. (P9/ml) 1 3 10. 5 7 5 2 4 7. A)COユlagen. SARTstreSS.
(33) Table4・Proteinandcholesterolcontentinp】ateletsfromno鼓. 一stressedand. SART-stressedrats. Non-streSS. SARTstress. 121.3土1●9. 116●6土365. 描 ヲ}08「::宝1￡) Totalcholesterol. 5.88土0.16. 5・91土0・20. 4.85土O.12. 5.07二LOg10. (μ9!108cells) (Cholesterol/Protein)x100. n=11(non-stress)and8(SARTstless).. T,. T よ. `. 1. ⊥ *. 肇 緬. さ 善 85◎ 冨 可駕. 6. O旧 劇雨﹂ 軸 信昌OOー剣O幽 ①ω 雨咀 自. 宝100 > 9. 匡 o Formalin-containingFormalinイree. A/B. εDτA-PBS{A)EDτA-PBS{B) Di験回en量solut轟on. Fig-7.DetectionofcirculatingplateletaggregatesinSART-stressedrats.Open column,non-stress;closedcolumn,SARTstress.皿=6.*P<0.05,***P<0.001.. 7.血 小 板 構 成 成 分 量 Table4に. 血 小 板 中 の 蛋 白量,cholesterol量. に つ い て も ス ト レ ス,非. お よ び 両 者 の 含 量 比 を 示 し た.い. ずれ. ス ト レ ス 両 群 間 に 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た.. 8.循 環 血 中 凝 集 血 小 板 の 検 出 Fig.17に 合,ス. み ら れ る よ う に,採. 取 し た 血 液 をfomlalin含. 有EDTA-PBSで. 希 釈 した場. ト レ ス ラ ッ トで は 非 ス ト レ ス ラ ッ トに 比 べ て 遊 離 血 小 板 数 が 少 な か っ た が, -27一.
(34) formalinを た.希. 含 ま な いEDTA-PBSで. 釈 液 中 のfo㎜alinの. 数 比 は,非. 有 無 に よ る遊 離 血 小 板 数 の 変 化 の 度 合 い を 反 映 す る血 小 板. ス ト レ ス ラ ッ トで は ほ ぼ ユ.0で あ っ た の に 対 し,ス. 前 後 と な り,有 EDTAに. 希 釈 す る と両 群 の 血 小 板 数 に 差 が 認 め ら れ な か っ. 意 に 低 下 し て い た 、 こ の こ と は,ス. ト レ ス ラ ッ トで は0.7. ト レス に よ り循 環 血 中 に 高 濃 度. よ り解 離 し う る 凝 集 血 小 板 が 出 現 した こ と を 意 味 し て い る 。. IV考. SARTス. ト レス動 物 で は,摘. 察. 出腸 管 のacetylcholine反 応 性 低 下 が 認 め られ る8)が,. これ を指 標 と して ス トレス の 至 適 負 荷 条 件 を 検 討 した 報 告19)に よ る と,室 温 側 は 常 に24℃. に 設 定 し,低 温 側 を マ ウ ス で は4℃ で あ っ た の を ラ ッ トで は 一3℃ に,モ ル. モ ッ トで は0℃. にす る こ と で いず れ の 動 物 に お い て も同 様 の 変 化 を 認 め て い る,本 章. で の ラ ッ トに お け る血 小 板 数 減 少 の 度 合 い は マ ウ ス の 場 合 と 同 様,約30%で. あ り,. ま た ス トレス 負 荷 に 伴 う経 日変化 もマ ウス で の パ タ ー ン と一 致 して い た こ と よ り,止 血 系 に 関 して も低 温 側 を 一3℃ に変 更 して ス トレス 負 荷 す る こ と で ラ ッ トに マ ウ ス と 同様 の 変 化 を惹 起 で き る こ と が確 認 され た. SARTス. トレス ラ ッ トで は,血 小 板 数 減 少 の ほ か,PRP中. 能 の 低 下 が 認 め られ,さ SARTス. らに,invivoで. で のinvitro血. 小板凝集. も凝 集 能 が 低 下 して い る こ とが 明 か とな り,. トレス動 物 に お け る 出血 傾 向 に は血 小 板 の 量 的減 少 の み な らず 質 的 変 化 が 大. き く関与 して い る こ と が 示 唆 され た,一 一方,循 環 血 中 に高 濃 度EDTAに. よ って 解 離. し う る凝 集 血 小 板 が 出 現 して お り,一 見 矛 盾 す る結 果 が 得 られ た. ヒ トの 血 小 板 凝 集 能 の 変 化 は,様. 々な 病 態 時53'54)や 栄 養 状 態 の 変 化55)な ど に よ. って 誘 発 され る.急 性 ス トレス に よ る血 小 板 凝 集 能 変 化 も調 べ られ て い る が,一 定 の 方 向 性 は な く充 進,低. 下 の い ず れ もが 報 告 さ れ て い る25-27'34-37).血. DICな ど の 患 者 の 血 小 板 凝 集 能 を 調 べ たYamazakiら54)の の 進 行,治. 療 過 程 の あ る 時 期 やDIC患. れ る.土 屋 ら56)は,実. 栓性 疾 患や. 臨 床 研 究 に よ る と,血 栓 症. 者 で は 血 小 板 凝 集 能 の 明 らか な 低 下 が 認 め ら. 験 的 に作 成 した 微 小 循 環 傷 害 モ デ ル を 用 い た研 究 結 果 か ら. DICの 発 現 あ る い は 発 達 過 程 に お け る ス トレ ス 性 要 因 の 重 要 性 を 主 張 して い る.. 一28.
(35) SARTス. トレス ラ ッ トに お い て 血 小 板凝 集 能 の低 下 と 同 時 に循 環 血 中 に 凝 集 血 小 板 が. 検 出 さ れ た こ と は,こ. の 動 物 が マ イ ル ドなDIC様. しれ な い.す な わ ち,何. 状 態 に あ る こと を意 味す る の か も. らか の 理 由 で血 管 内 の血 小 板 が 活 性 化 さ れ,消 費 が 促 進 さ れ. て 血 小 板 数 が 減 少 し,疲 弊 血 小 板 の 出現 あ る い は 反 応 性 の 高 い 若 い血 小 板 が 優 先 的 に 消 費 さ れ て 老 弱 血 小 板 が 相 対 的 に多 くな る こ とに よ り,結 果 と して血 小 板 凝 集 能 が 低 下 した 可 能 性 が 考 え られ る. SARTス. トレ ス ラ ッ トで は 血 小 板 凝 集 能 の 低 下 と と も に,collagen刺. お よ びserotonin放 出 能 の 低 下 が 認 め ら れ た.ま. た,静. 激 に よ るATP. 止 血 小 板 中 のATPお. よび. se畑onin量 に も減 少 が 認 め られ た こ と よ り,放 出能 の 低 下 の一 因 と して 濃 染 穎 粒 内 物 質 の 含 量 低 下 が 考 え ら え れ る.し か し,sero重oninの 含 量 に 対 す る 相 対 的 な 放 出量 を 算 出 した 放 出率 に も有 意 な低 下 が 認 め られ た こと は,ス も低 下 した こ と を 示 唆 して い る.さ わ な いADP凝. らに,SARTス. 集 能 も低 下 して い た こ と よ り,ス. トレス に よ って 放 出 機 能 自体. トレス ラ ッ トで は放 出 反 応 を 伴 トレス に よ る凝 集 能 の 低 下 が 放 出 能. 低 下 の 二 次 的 な 変 化 と は 考 え 難 い。 SARTス. トレ ス ラ ッ トの 血 小 板 中ATPお. 前 述 の 仮 説,す. よ びserotonin量 が 減 少 して い た こ と は,. な わ ち ス トレス に よ って 血 管 内 で血 小 板 の 消 費 が 充 進 した 結 果,疲. 弊. あ る い は 老 弱 血 小 板 が 増 加 して い る 可 能 性 を支 持 す る結 果 で あ る.し か し,ADP量 はSARTス. トレス に よ って 変 化 せ ず,そ. の結 果,ATP/ADP比. は 有 意 に 低 下 し た.血. 小 板 濃 染 穎 粒 内 物 質 は刺 激 に 伴 っ て非 選 択 的 に放 出 され る57)の で,ADPの っ た挙 動 を 示 す と は 考 え 難 い.Yalnazaklら54)は,DIC患 びADP含. 量 が い ず れ も有 意 に 低 下 して お り,ATP/ADP比. 者 の 血 小 板 で はATPお. よ. は む しろ 上 昇 す る こ と を. 報 告 して い る.す な わ ち,種 差 を 考 慮 す る必 要 は あ る が,SARTス 血 小 板 の 特 徴 は,DIC患. み が異 な. トレス ラ ッ トの. 者 に お い て 認 め られ る い わ ゆ る疲 弊 あ る い は 老 弱 血 小 板 の. 特 徴 と は 必 ず し も一 致 しな か っ た.血 小 板 中のserotoninは そ の ほ と ん ど が 濃 染 穎 粒 内 に 局 在 す るの に 対 し,ATPは. ユ13,ADPは2/3が. 濃 染 穎 粒 内 に,残. りのadenine. nucleo重idesはそ の ほ とん ど が エ ネ ル ギ ー 代 謝 に 関連 して 細 胞 質 に 存 在 す る57・58).細 胞 質 内 のATPは,invitroに. お い て,血 小板 のstarvation(栄 養 成 分 欠 損)や. の活 性 化 な ど に よ って 減 少 す る こ とが 報 告 され て い る57)が,前 を 伴 うの に 対 し,後 者 で はADP量. 者 で はADP量. は 変 化 しな い.こ の こ と よ り,SARTス. 血 小板 の 増加 ト レス ラ. ッ トで は 血 管 内 で放 出反 応 を 伴 わ な い マ イ ル ドな 血 小 板 の活 性 化 が 起 こ り,そ の 結 果, 一29.
(36) 細 胞質 中 のATP量 高 濃度EDTAに. が 減 少 した可 能 性 が 考 え られ る.SARTス. トレス ラ ッ トに お い て,. よ って 解 離 しうる マ イル ドに凝 集 した 血 小 板 が 出現 して い た こ と は,. この よ うな 考 え を支 持 す る知 見 で あ る. 血 小 板 は そ れ 自身 で はserotoninを 産 生 す る こ と は で き ず,血. 漿 中 のsero重oninを能. 動 輸 送 に よ っ て 濃 染 穎 粒 内 に 取 り込 む こ と に よ り,血 中 に 存 在 す るserotoninの ほ と ん どを 含 有 して い る57).こ. の こ とか ら,血 小 板 中serotonin量 減 少 の 原 因 と して,血. 小 板 の 放 出 反 応 の 充 進 の ほ か に,全 身 の 臓 器 プ ー ル か ら血 中 へ のserotoninの 供 給 量 の 減 少 やserotoninの 取 り込 み 機 能 の 低 下 が 考 え られ る.前 者 の 可 能 性 を 支 持 す る も の と して,SARTス. トレ ス ラ ッ トの 脳 内serotonin量 の 減 少 が 報 告 さ れ て い る7)が,. 現 時 点 で は これ と関 連 づ け る 明確 な 証 拠 は得 ら れ て お らず,将 来 の 課 題 と した い. PRP中 で の 血 小 板 凝 集 能 が ス トレス に よ っ て 明 らか に 低 下 して い た に も 関 わ らず, 洗 浄 血 小 板 の 凝 集 能 が 全 く変 化 して い な か っ た こ と は 驚 くべ き 結 果 で あ る.Tomita ら59)は,同. じ洗 浄 法 を 用 い て 脳 卒 中易 発 性 高 血 圧 自然 発 症 ラ ッ ト(SHRSP)に. 血 小 板 のcoHagenお して い る が,SARTス こ と は,SARTス 低 下 やinvivO凝. よ びADP凝. おける. 集 能 の 低 下 を 報 告 し,血 小 板 自体 の 機 能 障 害 を 証 明. トレス ラ ッ トで 同様 の 証 拠 を 得 る こ と は で き な か っ た.こ の トレス ラ ッ トに お け る血 小 板 のPRP中. で の 凝 集 能 お よ び 放 出能 の. 集 能 の 低 下 は血 小板 自体 の本 質 的 な機 能 障 害 に基 づ く もの で は な く,. 血 漿 環 境 の 変 化 あ る い は 洗 浄 に よ って 除 去 され うる血 小 板 膜 表 面 上 の 変 化 が 原 因 で あ る 可 能 性 を 示 唆 して い る.換 言 す れ ば,SARTス. ト レス ラ ッ トの 血 小 板 は凝 集 能 低. 下 を き た す ほ ど の不 可 逆 的 な 障害 は 有 して い な い と考 え られ,前 述 の ス トレス に よ る 血 小 板 中ATP量. の 減 少 が,過 度 の 血 小 板 の 疲 弊 を 意 味 す る濃 染 穎 粒 内 で の 減 少 を 反. 映 した もの で は な い 可 能 性 を 支 持 す る結 果 と も いえ る.ま た,血 小 板 中の 蛋 白量 や コ レス テ ロ ール 量 が ス トレス に よ って 変 化 しな か っ た こ と も こ れ と矛 盾 しな い.血 小 板 機 能 に影 響 す る血 漿 中 因 子 と して 脂 質 量 や そ の構 成 成 分 比 の 変 化55'6°)が 知 られ て い る が,SARTス. トレス動 物 で は血 清 中 の ほ とん どの 脂 質 量 が 減 少 して お り13),こ. れ. が 凝 集 能 低 下 に 寄 与 して い る可 能 性 も考 え られ る.ま た,血 漿 中や 血 小 板 膜 表 面 上 に 付 着 して い る 且bτinogenの量 が 凝 集 能 に 影 響 す る49'61)こ と も考 え られ る が,こ の 点 に つ い て は次 章 で 若 干 触 れ る こと とす る. 以 上 を 総 合 す る と,SARTス. トレス ラ ッ トで は 刺 激 に 対 す る血 小 板 の 凝 集 能,放. 出能 な どの 機 能 低 下 が 認 め られ る一 方,血 管 内 で は何 らか の 刺 激 に よ っ て血 小 板 が 活 一30.
(37) 性 化 さ れ て お り,マ イ ル ドなDIC様. 状 態 に あ る可 能 性 が 考 え られ る.ま た,ス. トレ. ス に よ る血 小 板 機 能 の 低 下 は,血 小 板 自体 の本 質 的 な 異 常 に 基 づ く もの で は な く,血 漿 環 境 や 血 小 板 膜 表 面 上 の 変 化 が 関 与 して い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た。. V小 1)SARTス. 括. トレス ラ ッ トに お い て もマ ウ スの 場 合 と同様 の 血 小 板 数 減 少 が 観 察 さ れ,. 種 差 は 認 め られ な か った. 2)PRP中. での 量 皿vitro血. 小 板 凝 集 能,放 出 能 は ス トレス に よ り低 下 し,ま た,in. vivO凝 集 能 に も 明 らか な 低 下 が 認 め られ た. 3)SARTス ADP量. ト レス ラ ッ トで は 血 小 板 中のATP量. とserotonin量 が 減 少 して い た が,. に は 変 化 は 認 め られ な か っ た.. 4)洗. 浄 血 小 板 の 凝 集 能 は ス トレス に よ って変 化 しな か っ た 。. 5)血. 小 板 中の 蛋 白量 お よ び コ レス テ ロ ール 量 は ス ト レス に よ っ て 変化 しな か っ た.. 6)SARTス. トレス ラ ッ トで は循 環 血 中 に高 濃度EDTAに. よ って 解 離 し う る凝 集 血 小. 板 が 出 現 して い た 。 以 上 の 結 果 よ り,SARTス. トレ ス ラ ッ トで は 刺 激 に 対 す る 盈1小板 の 凝 集 能,放. 出. 能 な どの 機 能 が 低 下 して い る一 方 で,血 管 内 で は 血 小 板 が 何 らか の刺 激 に よ って 活 性 化 され て い る可 能 性 が 示 唆 され た.ま た,ス. トレス に よ る血 小 板 機 能 の 低 下 は,血 小. 板 自体 の 本 質 的 な 障 害 に 基 づ く もの で は な く,血 漿 環 境 や血 小 板 膜 表 面 上 の 変 化 が 関 与 して い る こ とが 推 察 さ れ た。. 一31一.
(38) 第3章SARTス. トレス動物 にお け る血液 凝 固 ・線 溶系 の異 常 1緒. 言. ヒ トに お い て,短 時 間 の 運 動 負 荷 や急 性 の 精 神 的 ス トレス な ど に よ っ て血 液 凝 固 ・ 線 溶 系 が 活 性 化 さ れ る こ と は,多. くの 臨 床 研 究25・62・63)に よ って 既 に 指 摘 され て い. る.し か し,実 験 動 物 を 用 い た 同様 の 報 告64)は 少 な く,ま た,ス. トレス を 長 期 間 負. 荷 した 場 合 の 血 液 凝 固 ・線 溶 系 の 変 化 に つ い て は ほ とん ど 調 べ られ て い な い 。 第1,2章. に お い て 認 め られ たSARTス. トレス 動 物 の 血 小 板 の 量 的 な らび に機 能. 的 変 化 の 特 徴 か ら,こ の 動 物 は マ イ ル ドなDIC様. 状 態 に あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た.. 本 章 で は さ ら に 止 血 機 構 の 全 体 像 を 明 らか にす る 目 的 で,SARTス. トレス ラ ッ トの. 血 液 凝 固 ・線 溶 系 の 特 徴 を調 べ る こ と と した. さ ら に,SARTス. トレス に よ る止 血 機 構 の 諸 異 常 の 発 現 と 中 枢 神 経 系 との 接 点 を. 求 め る 目的 で,抗 不 安 薬alprazolamの 効 果 につ い て も検 討 した.. H実. 験材料な らびに実験方法. 1.実 験 動 物 と ス ト レス の 負 荷 方 法 実 験 動 物 と し て 体 重20-25gのddY系 雄 性 ラ ッ ト(日. 本SLC)を. 雄 性 マ ウ ス あ る い は200-250gのWistar系. 使 用 し,SARTス. ト レス の 負 荷 は 前 章 と 同 じ方 法 で 行 っ. た。. 2乏. 血 小板血 漿の 調整. 前 章 に 記 した 方 法 で ラ ッ トよ り採 取 した クエ ン酸 加 血 液 を4℃,ユ,700gで10分 間遠 心 す る こ と に よ り,乏 血 小 板 血 漿(ppp)を 得 た.. 3.血 漿 凝 固 時 間 の 測 定 内 因 性 凝 固 活 性 を 反 映 す る 活 性 化 部 分tllromboplastin時. 32. 間(APTD,外. 因性 凝 固活 性.
(39) を 反 映 す るprothrombin時 thrombin時 APTrの. 間(n)を. 間(PT)お. よ び 主 に 血 漿fibrinogen濃. 度 の変 化 を反 映 す る. 指 標 と し た.. 測 定 二5):ウ. サ ギ 脳 由 来 リ ン 脂 質 お よ び エ ラ ジ ン 酸 を 含 むAprT試. 光 純 薬)0.1m1とPPPO.1m1を ン キ ュ ベ ー ト し た37℃. 混 合 し,37℃ の0.02MCaCl2溶. で5分. 液0.1m1を. 薬(和. 間 イ ン キ ュ ベ ー ト後,プ. レイ. 添 加 し,撹 拝 し な が ら 飾rh1. 塊 が 析 出 す る ま で の 時 間 を 測 定 し た. PTの. 測 定15):Quickの1段. 含 むpT試. 薬(和. 階 法 に 従 い,ウ. サ ギ 脳 由 来thromboplastinとCaC12を. 光 純 薬)0.2m1とPPPO,1m1を. 混 合 し,37℃. でfibrin塊. 析 出ま で. の 時 間 を 測 定 し た. Trの. 測 定15):25U/miの. し,37℃. 4血. でfibrin析. 漿fibrhogen量. 出 時 間 を 測 定 した.. 方 法 に 従 い,6.8mMCaChと0.32mM重ranexamicacid. 含 む0。9%NaC1溶. 液5m茎. とPPP50μ1を. 混 合 し,37℃. キ ュ ベ ー ト す る こ と に よ り 血 漿 中 のfib血ogenをfibrinに の 蛋 白 量 をLowryら4°)の. 5。Eugiobulin溶. 方 法 に よ り 測 定 し,血. 解 時 間(EじDの. 組uftら66)の GaUimoreら67)の. (pH7.4)で. 再 度 溶 解 し た.37℃. を 添 加 し,析. 6.血. 間 放 置 後,沈. 漿fibrinogen量. な わ ち,pppを. 酸 を 添 加 す る こ と に よ りpHを5.9に 殿 す るeuglobulin分 の 水 浴 中 で,こ. 塊. 画 を 採 取 し,0.12M酢 のeuglobulin溶. 氷. 調 整 し た.こ 酸緩 衝液. 液 に ウ シ 由 来thrombin. 出 す るfibrin塊 が 完 全 に 消 失 す る ま で の 時 間 を 測 定 し,ELTと. し た.. よ び α2-plasmininhibitor. 活 性 の 測 定. 内 因 性 凝 固 系 に 属 す るF∼ αII:C,抗thrombin因 α2-pI活. のfib血. 画 を 用 い て,ELTを. 溶 活 性 の 指 標 と し た.す. 液 凝 固 第 皿 因 子(FVIIl:C),antithrombin川(ATIil}お (α2-Pり. 間 イ ン. と した。. り作 成 し たeuglobu玉in分. 方 法 に 従 っ て 測 定 し,線. 冷 蒸 留 水 で 希 釈(1:20)し,2%酢. 変 換 し た 後,こ. で1時. 測定. 方 法 に 準 じ てPPPよ. れ を 氷 冷 下1時. 混合. の 測 定. Tomikawaら65)の (Aldrich)を. ウ シ 由 来thlombin(Sigma)0。1miとPPPO,1m1を. 性 は,そ. 子 のATIIIお. よ び 抗plasmin因. れ ぞ れ 発 色 合 成 基 質 を 利 用 し た ア ッ セ イ キ ッ ト,TestzymeVIII,. 33. 子 の.
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