1緒 言
血 栓 性 疾 患 やDICな ど の 止 血 機 構 の 異 常 が 関 係 す る と 考 え ら れ る 病 態 の 発 現 あ る い は 発 達 に,ス ト レ ス 性 因 子 が 関 与 す る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る3'26'36'37'56'7° ・ 81‑83)
.こ の う ち 気 温 変 動 に 基 づ く環 境 ス ト レス と 止 血 異 常 と の 関 係 に つ い て は,ヒ トを 実 験 的 に 短 時 間 低 温 に 暴 露 す る と 線 溶 充 進7°),血 小 板 数 増 加,赤 血 球 数:増 加, 血 液 粘 度 上 昇,血 圧 上 昇82)な ど が 一 過 性 に 認 め ら れ る こ と や,ヒ ツ ジ を 過 度 の 高 温
に 急 激 に 暴 露 す る とDICを 発 現 して 死 亡 す る83)こ と な ど が 報 告 さ れ て い る.し か し, 長 期 間 反 復 して 起 こ る 気 温 変 動 の 止 血 系 へ の 影 響 は こ れ ま で ほ と ん ど 解 っ て い な か っ た 。 第1‑3章 に お い て 著 者 は,数 日 間 の 反 復 低 温 暴 露 に よ り,実 験 動 物 が 徐 々 に マ イ ル ドなDIC様 症 状 を 呈 す る よ う に な る こ と を 明 ら か に し た.こ れ を そ の ま ま ヒ ト に 外 挿 す る わ け に は い か な い が,気 温 変 動 の 激 し い 時 期 や 地 域 で は 血 栓 性 疾 患 に よ る 死 亡 率 が 高 く な る と の 疫 学 的 報 告3)と の 関 連 性 を 考 え る と 興 味 深 い 知 見 と い え る.
臨 床 に お い て,DICは シ ョ ッ ク 時 や 癌,肝 障 害 な ど の 基 礎 疾 患 の 上 に 何 ら か の 宜rlggerが作 用 し て 発 現 す る.Yoshikawaら84 86)は,DICモ デ ル と し て よ く 用 い ら
れ る エ ン ド トキ シ ン シ ョ ッ ク の 発 現 に 活 性 酸 素 が 関 与 す る こ と を 示 唆 して い る.ま た, 土 屋 ら56)は,ス ト レ ス 性 電 気 刺 激 に よ り微 小 循 環 障 害 を お こ し た 臓 器 か ら 採 取 し た 局 所 血 にDIC様 の 変 化 を 見 い だ し,そ の 変 化 の 発 現 に フ リー ラ ジ カ ル が 重 要 な 役 割 を 果 た す こ と 示 し て い る.こ れ らの こ と よ り,SARTス ト レ ス 動 物 お い て 認 め ら れ るDIC様 症 状 の 発 現 あ る い は 進 行 過 程 に お い て も フ リ ー ラ ジ カ ル が 何 ら か の 役 割 を 担 っ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る.
そ こ で 本 章 で は,SARTス ト レ ス に よ り 誘 発 さ れ る 止 血 系 の 異 常 の 発 現 に フ リ ー ラ ジ カ ル が 関 与 す る か 否 か を 検 討 す る 目 的 で,活 性 酸 素 の 補 集 剤 お よ び 生 成 阻 害 剤 の 効 果 を 調 べ る こ と と し た.す な わ ち,ラ ジ カ ル 補 集 剤 と し てsuperoxidedismutase
(SOD)とca佃ase,ま たxanthineoxidase経 路 を 介 す る ラ ジ カ ル 生 成 阻 害 剤 と し て allopurino1を 使 用 し,こ れ ら を ス ト レス 負 荷 期 間 中 反 復 投 与 し た 場 合 の 止 血 系 へ の 影
響 を検 討 し た.な お 本 実 験 系 に お い て は,SARTス トレス 動 物 に お け る止 血 系 の 異 常 の 指 標 と して,ス トレス に よ る変 化 の 幅 が 比 較 的 大 き く,か つ 安 定 して い た3っ の 典 型 的 な 変 化,す な わ ち血 小 板 数 の 減 少,血 漿fibrinogen量 の 減 少 お よ びFVIII:C活 性 の 低 下 を用 い る こ と と した.
さ らに,生 体 内 で フ リー ラ ジカ ル が 過 剰 に 生 成 さ れ る と脂 質 の 過 酸 化 が起 こ り生 体 に様 々 な 悪 影 響 を お よ ぼ す こ と が 考 え られ る.そ こ で,SARTス トレス 動 物 の 血 漿 中お よ び 組 織 内 の 過 酸 化 脂 質 量 を 測 定 し,非 ス トレス 動 物 の そ れ ら と比 較 検 討 した.
H実 験材料な らびに実験方法
1.実 験 動 物 と ス ト レ ス 負 荷 方 法
体 重20‑259のddY系 雄 性 マ ウ ス な ら び に 体 重200‑2509のWistar系 雄 性 ラ ッ ト (日 本SLC)を 使 用 し,SARTス ト レ ス の 負 荷 は そ れ ぞ れ 第1,2章 に 記 載 の 方 法 で 行 っ た.
2.採 血
ペ ン トバ ル ビ タ ー ル 麻 酔 下 で 開 腹 し た マ ウ ス お よ び ラ ッ トの 腹 大 動 脈 よ り そ れ ぞ れ 0.5お よ び5ml(最 終 容 量)の 血 液 を1/10容 量 の3.13%ク エ ン 酸Naを 含 む シ リ ン
ジ 内 に 採 取 し た.
3.血 漿fibrinogen量 な ら び にFV川:C活 性 の 測 定
血 小 板 数 算 定 後,ク エ ン酸 加 血 を1,700gで10分 間 遠 心 す る こ と に よ り乏 血 小 板 血 漿(PPP)を 採 取 し た.こ のPPP中 の 五brinogenを 本 章 で は 簡 易 的 にthrombin時 間 法15)に よ り ア ッ セ イ キ ッ ト(フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ンBテ ス ト ワ コ ー,和 光 純 薬 〉 を 用 い て 定 量 し,ま た,FVIII:C活 性 を 第3章 に 記 載 した 方 法 で 測 定 し た.
4薬 物 投 与 法
Superoxideanion(0ゴ)お よ びhydrogenperoxide(H202)の 補 集 剤 と し て そ れ ぞ
一46
れ ウ シ 赤 血 球 由 来SOD(Sigma)お よ び ウ シ 肝 臓 由 来catalase(Sigma)を,ま た xanthineoxidase阻 害 剤 と し てallopurinol(和 光 純 薬)を 使 用 し た.SODは 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し,ス ト レ ス 負 荷 開 始 日 か ら 採 血 前 日 ま で の7日 間,午 前9時 と 午 後4時 の 1日2回 宛 計14回 マ ウ ス に 皮 下 投 与 した.Catalaseは 原 液 を 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し, SODと 同 じ ス ケ ジ ュ ー ル で 投 与 した.AIlopurinolは0.5%CMC‑Na溶 液 に 懸 濁 し, ス ト レ ス 負 荷 期 間 中 毎 日 ユ 日1回 宛 計7回 マ ウ ス に 経 口 投 与 し た.ま た,非 ス ト レ ス マ ウ ス に 対 して も 同 様 の ス ケ ジ ュ ー ル で 各 薬 物 を 投 与 した.な お,対 照 群 の マ ウ ス に は 各 薬 物 の 溶 媒 の み を 投 与 し た.
5.血 漿 中 過 酸 化 脂 質 量 の 測 定
Yagi87)に 従 い,血 漿 中 の チ オ バ ル ビ ツ ー ル 酸 反 応 性 物 質(thiobarbituric acid‑reactivesubstances;TBARS)を 蛍 光 分 光 光 度 法 に よ り 定 量 し,脂 質 過 酸 化 の 指 標
と した.す な わ ち,20倍 希 釈 したPPP・0。5m1にphosphotungs{icacidを 添 加 す る こ と に よ り血 漿 脂 質 を 蛋 白 と と も に 沈 殿 さ せ た 後,沈 渣 に 蒸 留 水4mlお よ び0.335%
thiobarbituricacidlmlを 添 加 し95℃ で1時 間 反 応 さ せ た.こ の 反 応 生 成 物(蛍 光 物 質)を5m玉 のn‑butanolで 抽 出 し,蛍 光 強 度 を 励 起 波 長515nm,蛍 光 波 長553nm で 測 定 し た 。 な お 結 果 は,血 漿1mlあ た り のma亙ondiaidehyde量(nmo1)と し て 示 し た 。
6.組 織 中 過 酸 化 脂 質 量 の 測 定
動 物(ラ ッ トお よ び マ ウ ス)を 断 頭 に よ り致 死 さ せ,全 脳 心 臓 肺 お よ び 十 二 指 腸 を す ば や く摘 出 し,生 理 食 塩 水 で 洗 浄 後,湿 重 量 を 測 定 し た 、 次 い で,Ohkawa
ら88)の 方 法 に 準 じて,各 組 織 を9容 量 の1.15%KC1溶 液 中 で ホ モ ジ ナ イ ズ し,こ の 一 部(0.2ml)を&1%sodiumdodecylsulfateO,2mlお よ び20%acetatebuffer(pH 35)1.5mlと 混 合 し た.こ れ に0.8%thiobarbituricacid1.5m]お よ び 蒸 留 水0.6mi
を 添 加 し95℃ で1時 間 反 応 さ せ,反 応 生 成 物 を 距butano1とpyridineの 混 液(15:1)で 抽 出 後,上 記5.と 同 条 件 で 蛍 光 測 定 を 行 っ た.結 果 は,湿 重 量(g)あ た り の malondialdehyde量(nmol)と して 示 し た.
そ の 他,記 載 の な い もの につ い て は 前 章 ま で と 同 様 の 方 法 で 行 った.
皿 実験結果
1.ラ ッ トお よ び マ ウ ス に お い てSARTス ト レ ス に よ り 誘 発 さ れ る 血 小 板 数,血 漿 fibrinogen量 お よ びFVIII:C活 性 の 変 化 の 比 較
Fig.23は 止 血 系 の 異 常 を ラ ッ トと マ ウ ス で 比 べ た もの で あ る.各 パ ラ メ ー タ ー の 絶 対 値 は 両 動 物 種 間 で か な り 異 な っ て い た が,SARTス ト レ ス に よ る 血 小 板 数, fibrinogen量 お よ びFVIII:C活 性 の 変 化 の 大 き さ は,そ れ ぞ れ22‑26%,34‑37%お よ び 27‑32%で,種 差 は ほ と ん ど 認 め ら れ な か っ た.
2.Superoxidedismutase(SOD)の 効 果
Fig.24は,SODを1日2回 宛7日 間 反 復 皮 下 投 与 し た 場 合 の 血 小 板 数 へ の 影 響 を 示 し て い る.SOD30,000U!kgの 反 復 投 与 は,非 ス トレ ス マ ウ ス で は 何 ら影 響 を 示 さ な か っ た が,ス ト レ ス に よ る 血 小 板 数 の 減 少 を 有 意 に 抑 制 し た.ま た,ス ト レ ス に よ る 変 化 に 対 す る 薬 物 の 阻 止 効 果 の 程 度 を 意 味 す るSIN比(ス ト レ ス 群 の 非 ス ト レ ス 群 の 値 に 対 す る 比)は,対 照 群 で は0.8で あ っ た の がSOD30,000U/kg処 置 群 で は
0
肋t
〔xで044」}
501000
Mouse (x¶0怖1) 50100150
Pla量eletcount
O
(mg/mり 可2
★★
30
★ ★ {㎎/ml)
電2
Fib而ogenleveI
o FactorV邑ll:C
ac吐ivity
Fig.23.Plateletcoun重,fibrhloge皿levelandcoagulationfactorVIII:Cactivityhlratsand miceexposedtoSARTstress.Opencolumn,non‑stress;closedcolumn,SARTstress.n=
5‑8(ra重)and6(mouse).★P<0.05,★ ★P<0.01,★ ★★P<0.001.
48
{噛識＼噂O,X)咽̀,OOりO一〇一〇一ら
o C°nt「°13睾 器 ゜C°nt「 °11α ゜°呈
。言α゜°°{U/・g・2/d・ ・) Non‑stressSARTs電ress
Fig・24.EffectofrepeatedtreatmentwithsuperoxidedismutaseonSARTstress‑induced thrombocytopeniainmice・Superoxidedismutase(SOD)wasadministereds.c・twiceaday during7‑dayexposuretostress。Figuresinparenthesesindicatetheratio,stress/non‑stress・
n=ヱ1(con重rolgroup)and50r6(dosedgfoup).★Pく0.05vs.thenon‑stressedcontro玉;
#P<0.05vs。theSART‑stressedcontrol。
Table9.Effedohepea童edtreatmentwithsuperoxidedismutaseondecreasesinplasma fibri汎ogen」evelandfactorVHI:CactivityinSART‑stressedmice.
Fibrinogenleveユ 《mg/m1)
《U/kgx2/day) Non‑streSS(N) Stress(S) Ratio(S/N)
Controユ SODlO.000
30,000
1。90主O.07
2。44±O。20★ ★
1。36±0.09歯 ★
1.26±0.08 2。08±0.09##
0。72 0。85 FaCtOrVI工1:Cactivity(号)
(U/kgx2/day) Non‑streSS(N) Stress(S) Ratio(S/N)
Control・
SOD10,000 30,000
8260±2。7
95.6±8.7 045 ★# #
●●■458
±±±
922
■■●250669
0.77 0.95
Superoxidedismutase(SOD)wasadminis重ereds.c.twiceadayduring7‑dayexposureto
stress.n=8一 ユ1(contro三group)and50r6(dosedgroup).★P<0.05,★ 嚢P<0・Olvs.tlle no皿 一stressedcon重ro1;##P<0.01vs.窪heSART‑stressedcontrol.
1.05と な っ た.す な わ ち,SARTス ト レス マ ウ ス に お け る 血 小 板 数 の 減 少 はSODの 反 復 投 与 に よ り 完 全 に 阻 止 さ れ た.
Table9に,血 漿fibrinogen量 お よ びFVIII:C活 性 に 対 す るSODの 効 果 を 示 した.
SOD30,000U!kgの 反 復 投 与 に よ り 非 ス トレ ス,ス ト レ ス 両 マ ウ ス の 血 漿fibrinogen 量 は 有 意 に 増 加 し た が,対 照 群 で は0.72で あ っ たSIN比 が0.85に 上 昇 し た.ま た, 同 用 量 のSODに よ っ て は,非 ス ト レス マ ウ ス のFVIII:C活 性 は 有 意 な 影 響 を う け な か っ た が,ス ト レ ス に よ る 同 活 性 の 低 下 は 有 意 に 阻 止 さ れ,S/N比 は0.77か ら0.g5 に 上 昇 し た 、
な お,SODは10,000U!kgの 用 量 で は い ず れ の パ ラ メ ー タ ー に 対 し て も有 意 な 影 響 を お よ ぼ さ な か っ た,
3.Catalaseの 効 果
Fig.25に み ら れ る よ う に,catalaseは,4,000お よ び40,000U!kgの 用 量 でSART ス ト レ ス マ ウ ス の 血 小 板 数 を 増 加 さ せ る 傾 向 を 示 し,SIN比 を 上 昇 さ せ た.
Fig.25.EffectofrepeatedtreatmentwithcatalaseonSARTstress‑induced thrombocy童openiainm三ce.Catalasewasadministereds.c.twiceadayduring7‑day exposuretostress.Figuresinparenthesesindicatetheratio,stress/non‑stress.n=5‑7.
★P<0
.01vs.thenon‑stressedcontro].
一50一
Table≦0.Effectofrepeatedtreatmentwithcata】aseondecreasesinplasmafibrinogen levelandfactorVIII:CactivityinSART‑stressedmice.
Fibrinogenleveユ(mg/m工) (U/kgx2/day)
Control Catalase4,000
40,000
Non‑streSS(N) Stress(S) Ratio(S/N)
1.44±0.05 1.42士0.05 1.58士0。05
1.07±0.06★ ★
1.22±0.10 1●31±OgO5##
0.74 0.86 0。83 FactorV工 工1:Cactivity(忌)
(U/kgx2/day) Control Catalase4,000
40,000
Non‑streSS(N) Stress(S) Ratio(S/N)
636
0●.332
土+凹土
188
卿00141767 ★057
晒σ●332
±±±
824
00切410556
0。77 0.79 0。84 Caξalasewasadminis重ereds.c。twiceadayduring7‑dayexposuretostress.n=9‑12
(controlgroup)and5‑8(dosedgroup)。 需★Pく0・01vs・thenon‑stressedcontrol;存#P<0。01 vs.theSART‑stressedcontrol。
Tableユ0はfibhnogen量 とFVIII:C活 性 へ の 影 響 を 調 べ た 結 果 で あ る が,catalase
40,000U/kgの 反 復 投 与 は,ス ト レ ス ラ ッ ト の 行brinogen量 の み を 有 意 に 増 加 さ せ た 。
一 方 ,FVm:C活 性 に つ い て は,catalaseの 投 与 に よ りS/N比 は 若 干 上 昇 し た も の の
有 意 で は な か っ た.
4.Allopurinoiの 効 果
Fig,26に 示 し た よ う に,allopurino】 の 連 日経 口 投 与 で は,非 ス ト レ ス マ ウ ス に お い て は 有 意 な 影 響 は 認 め られ な か っ た が,ス ト レス に よ る 血 小 板 数 の 減 少 が 有 意 に 抑 制 さ れ,SIN比 は0.70か ら0.86に ま で 上 昇 し た,
Table11は 非 ス ト レ ス,ス ト レス 両 マ ウ ス のfibrinogen量 とFVIII:C活 性 に お よ ぼ すallopurinolの 効 果 を 示 し た も の で あ る,Allopurino1は,ユOmg/kgで は 有 意 な 影 響 を 示 さ な か っ た が,20mg!kgで は ス ト レ ス マ ウ ス の み な ら ず 非 ス ト レ ス マ ウ ス の 両 パ ラ メ ー タ ー を も著 し く増 加 させ,ス ト レ ス に よ る 変 化 に 対 す る 特 異 的 な 阻 止 効 果 は
あ ま り認 め ら れ な か っ た.
150
OO1 05
(鴨ぐ,07X}劇ζコOO彰①謄〇一〇■﹂
OC ontrol20ControlIO20
AlbP・ ・i・。lAlbP.・i.。1{mg/kg/d・y) Non‑stressSARTstress
Fig.26.Effectofrepeatedtreatmentwi重hallopurinolonSARTstress‑induced
t㎞ombocytopeniainmice.Allopurinolwasadministeredorallyonceadaydurillg7‑day exposuエetostress.Figuresinpalenthesesindicatetheratio,stress/non‑stress・n=6・
★P<0
.05vs.thenon‑slressedcontrol;#P<0.05vs.theSART‑stressedcontrol.
1
■
甲 T
〔086)
# T {O,70}
★T
T
TabieltEffectofrepeatedtreatmentwitha110purino】ondecreasesinplasmafibrinogen levelandfactorVIII:CactivityinSART‑stressedmice.
Fibrinogenleve1(mg/ml)
(mg/kg/day) Non‑streSS(N) Stress(S) Ratio(S/N) Control
Alユopurinol10
20
1.66±0.04
2.45±0.17★ ★
1.26±
1.54±
1.87士
0.06★ 禽
0.09 0.ユ7##
0.76 0.76 Factor▽1工1;Cactivity(暑)
(mg/kg/day) Non‑streSS(N) StreSS(S) Ratio(S/N) Control
Allopurinol10 20
84.2±4.0
107.9土9.9★ ★
士±±
430
●OO653679 #嚢#580
■O■346
0.79 0.86
Allopurinolwasadministereds・c・onceadayduring7‑dayexposuretostress・n=15‑16
(controlgroup)and9‑10(dosedgroup)・ ★P<0・05,嚢 ★P<0・01vs・ 重henon‑s重ressedcontro1;
辮P<0.01vs.theSART‑stressedcontrol.
一52一
5.血 漿 な らび に 組 織 中 過 酸 化 脂 質 量 の 変化
SARTス トレス を 負 荷 した ラ ッ トと マ ウ スの 血 漿 お よ び 組 織 中 の 脂 質 過 酸 化 の 程 度 を,TBARs値 を 指 標 と してFig.27に 示 した,血 漿TBARs値 に つ い て は,ラ ッ トお よび マ ウス の いず れ に お い て もス トレス,非 ス トレス 両 群 問 で有 意 な 差 は 認 め られ ず, 血 中 で は 脂 質 の 過 酸 化 は 生 じて い な い こ とが 示 唆 され た.一 方,組 織 で は,脳,肺 お
よ び 十 二 指 腸 のTBRAS値 は ス トレス に よ って 変 化 しな か っ た が,心 臓 のTBARS値 は ラ ッ ト,マ ウ ス い ず れ に お いて も有 意 に増 加 して お り,ス トレス の 影 響 は 臓 器 に よ って 異 な って い た.
Plasma
Fig、27,Plasmaandtissuelipidperoxidelevelsinratsandmiceexposedto SARTstfess.Opencolumn,non‑stress;closedcolumn,SARTstress.TBARS (thiobafbituricacid‑reactivesubstances)valuesweleexpressedas malondialdehydeconcentrations.n=7‑9(plasmaTBARS)and50r6(tissue
TBARS).P<0.05,P<0.01.