博 士 （ 医 学 ） 王 景 信
学 位論文題名
Possible Roles of an Adult T‑Cell Leukemia (ATL)‑Derived Factor/Thioredoxin in the Drug Resistance of ATL to Adriamycln
（ 成人T細胞性自血 病由来因子／チオレドキシンの成人T細胞性 自 血 病 の ア ド リ ア マ イ シ ン 耐 性 に お け る 役 割 ）
学位論文内容の要旨
I．背景と目的
成人T細胞性自血病adult T‑cell leukemia(ATL)は癌化学療法剤（抗癌剤）に感受性が低 く、また、薬剤耐性を獲得しやすいために、治療成績が極端に悪い自血病とされる。ATL症 例の生存期間の中央値は8ケ月であり、長期生存率は約10％すぎないと報告されている。ATL 由来因子ATL‑derived factor(ADF)は、当初interleukin‑2 receptor‑ロの発現を誘導する因 子として同定された。その後これが抗酸化酵素チオレドキシンのヒトホモローグであること が明らかになり、活性酸素スカベンジャーとして働きうることが想定されている。抗癌剤 adriamycin(ADM)はATLの治療に中心的に用いられる薬剤であり、その作用機序のーっと して活性酸素によるDNA損傷が関与すると考えられている。従って、ATL細胞に大量に誘 導されるADFがADM耐性に直接関与している可能性が考えらる。そこで、ATL細胞のADM 耐性に おけるADFの役割を明 らかにする ために、ATL細胞のADF蛋白量とADM耐性の程 度との相関関係を検討すると共に、ADF蛋白量を人為的に減少させることによってADM耐 性が克服されるか否かを検討した。
II．材料と方法
1） 自血病細胞 株：ATL細 胞としてATL‑2、SALT‑3、ED‑Sの3株、T細胞性自血病細胞と し てJurkat、MOLT‑3の2株 お よび 前 骨髄 性 自 血病HL‑60の1株 とそ のADM耐性 株 HL‑60/ADMを用いた。
2） MTT法による薬剤感受性の測定：96穴プレートにて各細胞株を階段希釈した抗癌剤を 含む培地にて48時間培養後、MTT試薬を加えてさらに4時間培養し、HC1添加イソプロ バ丿ールを加えて細胞を完全に溶解した。マイクロプレートリーダーにてOD値を測定し、
50％の細胞を殺す薬剤濃度（ICso）を算定した。
3） ADM耐 性株の樹立 株：ATL細 胞株ATL‑2、SALT‑3、ED‑SをそれぞれADM存在下にて 培養し、増殖してくる細胞をさらにADMの濃度を上げた培地で培養することを繰り返し 耐性株を 樹立した。 樹立した耐性株をそれぞれATL‑2/ADM、SALT‑3/ADM、ED‑S/ADM と名付けた。
4） Western blot：各株細胞のcell lysateをSDSーPAGEにて泳動後、PVDFメンブレンに ブロットし、抗ADF抗体、抗GSH‑Px抗体を用いて検出した。
5） FACSによるP‑glycoprotein発現 の検討：そ れそれの細 胞を1次 抗体として 抗P‑
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glycoprotein抗 体 、2次 抗 体 と してFITC． 抗マ ウスIgG抗 体を 用い て免 疫染 色し た後、
FACSCanにてP‑glycoprotein発現を検討した。
6）トホイソメラーゼII活性の測定：各株細胞の核蛋自を回収した後、トポイソメラーゼII 測定キット（TopoGenInc．）を用いて測定した。
7） ADMの 細 胞 内 蓄 積 と 排 出 ：FACSCanを 用 い てADMの 螢 光 を 経 時 的 に 測 定 し た 。 III．結果
1）ATL細 胞株 であ るATL‑2、SALT‑3お よびED‑SのICsoは それ ぞれ0．759、0．399およ び 0．102魁Mで あり 、T細胞 性自 血病 株Jurkat、MOLT‑3の それ ぞれ0.050、0．028LtMに比 較して高かった。
2） ADM耐 性 株ATL‑2/ADM cl‑l、ATL‑2/ADM cl‑2、SALT‑ 3/ADMお よびED‑S/ADMのICso はそれそれ1．659、4．403、1．910および0．655ルMであり、それぞれの親株に比較して2 倍 、6倍 、5倍 、 6倍 に 増 強 し 、ADMに 対 し て 強 い 耐 性 を 獲 得 し て い た 。 3） ADF蛋 白 量 はATL‑細 胞 株ATL‑2、SALT‑3、ED‑Sで 、T細 胞 性 自 血病 由来 株Jurkatに 比較してそれそれ12．1倍、9．6倍、2．8倍多かった。また、ADM耐性株ATL‑2/ADM cl‑l、 ATL‑2/ADM cl‑2、SALT‑ 3/ADMお よ びED‑S/ADMのADF蛋 白 量 は 、 そ れ そ れ の 親 株 に 比 較 し て 4． 8倍 、 6． 6倍 、 4． 6倍 お よ び 5.2倍 に 増 加 し て い た 。 4）各細胞株におけるADF蛋白量とADMのICsoは正の相関を示した(r:ニ0．891、pく0．01)。 しかし、各細胞株におけるADMのICsoは、GSH‑Px量(r=0．22)ともトポイソメラー‐ゼ活性 (r=ニ0．19)とも相関していなかった。
5） ADMの 細 胞 内 蓄 積 と 排 出 は 、ATL‑2とATL‑2/ADMと の 間 で 差 を 認 め な か っ た 。 6） P‑glycoproteinは 、陽 性コ ント ロール のHL‑60では 発現 されており、HL‑60/ADMでは さらに増加していたが、ATL由来細胞株では親株でも耐性株でも発現されていなかった。
7） こ れ らADM耐 性ATL細 胞 のADM以 外 の 抗 癌 剤 に 対 す る 耐 性 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 耐性株はVP ‑16およびcisplatinum（CDDP)に対してはそれぞれの親株に比較すると耐性を 示したが、bleomycinに対しては一定の傾向を示さなかった。また、各細胞株におけるADF 蛋 白 量 お よ びGSH‑Px量 とVP‑16、CDDPのICsoと の 間 に 相 関 は 認 め ら れ な か っ た 。 8） Selenite及 びDiamide処 理 に よっ て、ATL細胞 株お よび そのADM耐 性株 にお けるADF 蛋 白 量 が 減 少 さ せ る と 共 にADMのICsoも 減 少 し 、ADM耐 性 が 克 服 さ れ た 。 IV．考案
以 上の 結果か ら、ADFノチ オレ ドキ シンがATL細胞 のADMに対 する 自然 耐性 と獲 得耐 性 に重 要な 役割 を果 たし てい るこ とが明らかになった。一方既知の薬剤耐性困子であるP・ glycoprotein、GSH‑Px、ト ポイ ソメ ラー セ活性 など は、ATL細胞のADM耐性にはほとんど 関与 して いな いと 考え られ た。 また 、ADF蛋白 量を 減少 させ るSeleniteおよびDiamideに よ っ てATLのADM耐性 を 克 服 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。ADF蛋 白 がADMに 対 する 耐 性 に ど の よ う に 関 与 し て い る の か の 詳 細 な 機 序 は不 明 で あ る が 、Mitsuiら はADF蛋 白 が hydrogen peroxideなどの活性酸素を減少させると報告している。彼等の報告と今回の結果 を合 わせ ると 、ADF蛋白 カs活性 酸素スカペンジャーとして働くことによって、ADMの活性 酸素 を介 したDNA損 傷を 回避 させ る可 能性 が考 えら れる 。し かしADF蛋白は、活性酸素の 介在 が否 定的 なFasやTNF‑aによ る癌 細胞 のアポ トー シス をも 阻害するとの報告もある。
従っ て、ADFが活性 酸素 スカ ペン ジャ ー作 用以 外の 機構 によ りADM耐性に関与する可能性 も考 慮す る必 要が ある 。こ の点 を考える上で、耐性となった細胞においてはADMが核内ヘ 移行 せず 細胞 質に のみ 存在 し、 同時にADF蛋白が細胞質に局在することを観察した申請者 の 未 発 表 の 成 績 は 興 味深 く 、 今 後 こ の 親 点 か ら も 検 討 す る 必 要 がある 。ADF蛋 白は 、 protein‑refolding活性を有するとされており、ADMの核内への移行に何らかの働きをして
いるのかもしれない。また、今回の研究によって得られたATLのADM耐性をSeleniteに よって克服できるという成績は、SeleniteがすでにHBs抗原陽性患者の肝癌発症予防に安全 に使用されており、今後ATLの薬剤耐性克服方法の開発に寄与するものと期待される。
V． 結 語
成 人T細 胞性 自 血 病（ATL）細胞が産 生するADF／チオレド キシンが、ATL細胞の adriamycin耐性 に 関 与す る こと を 明ら か にし た 。
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学位論文審査の要旨
学位 論文題名
Possible Roles of an Adult T‑Cell Leukemia (ATL)‑Derived Factor/Thioredoxlnlnthe
DrugReSiStanCeofATLtOAdriamyCln
（ 成人T細 胞性自血病 由来因子／チオレドキシンの成人T細胞性 自 血 病 の ア ド リ ア マ イ シ ン 耐 性 に お け る 役 割 ）
成人T細胞性自血病adult T‑cell leukemia(ATL)は癌化学療法剤（抗癌剤）に感受性が 低く、また、薬剤耐性を獲得しやすいために、治療成績が極端に悪い自血病とされる。
HTLV―I感染に よって誘発 されるATL細胞で強い 発現が予想 されるATL由来因子ATL− derived factor(ADF)は、当初、interleukin‑2 receptor‑ぱの発現誘導因子として同定さ れたものであるが、その後、これが抗酸化酵素チオレドキシンのヒトホモ口ーグであるこ とが明らかになり、活性酸素スカベンジャーとして働きうることが想定されている。一方、
ad riam ycin (ADM)はATLの治療に中心的に用いられる抗癌剤であり、その作用機序のー っ として活性酸素によるDNA損傷が関与すると考えられている。従って、ATL細胞に大 量 に誘導されるADFがADM耐性に直接関与している可能性が考えられる。そこで、申請 者 はATL細 胞のADM耐 性にお けるADFの 役割を明ら かにするた めに、ATL細胞のADF蛋 白 量とADM耐 性の程度との相関関係を検討すると共に、ADF蛋白量を人為的に減少させ ることによってADM耐性が克服されるか否かを検討した。
実験 には、ATL細胞とし てATL‑2、SALT−3、ED‑Sの3株、T細胞性自血病細胞として Jurkat、MOLT‑3の2株 お よ び 前 骨 髄 性 自 血 病H1‑ 60の1株 と そ のADM耐 性 株HL‐ 60/ADMなど の自血病細 胞株を用い た。MTT法 により、各 細胞株のADM感受性を測定し 50％の細胞を殺す薬剤濃度（ICso）を算定し、その薬剤耐性の程度を比較した。また、
ATL細胞株ATL‑2、SALT‑3、ED―SをそれぞれADM存在 下にて培養 し、増殖してくる細 胞をさらにADMの濃度を上げた培地で培養することを繰り返し、新たに、それぞれの耐 性 株ATL‑ 2/ ADM、SALT‑3／ADM、ED‑S／ADMを 樹立 した 。各細胞株 におけるADF、 GSH‑Px、P‑glycoproteinなど の蛋白分子 産生量は、Western blot法およびFACScanに より、半定量的に測定した。また、トボイソメラーゼII活性は各細胞株の核蛋白を回収し た 後、トポイ ソメラーゼII測 定キット(TopoGenInc．）を用 いて測定し 、ADMの細胞
夫 敬
博
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山 木
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授 授
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査 査
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主 副
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内 蓄 積 と 排 出 をFACScanを 用 い てADMの 螢 光 を 経 時 的 に 測 定 し た 。 各 細 胞 をDiamideあ る い はSeleniteに て 処 理 し 、ADF発 現 量 を 低 下 さ せ た 細 胞 のADMのICso検 討 し た 。 実験 の結 果、1)ATL細胞 株で あるATL‑2、SALTー3お よびED‑SのICsoは それ ぞれ0.759、 0.399お よ び0.102从Mで あり 、T細 胞 性 自 血 病 株Ju rkat、MO LT−3のそ れそ れ0.050、 0.028ルMに 比 較 し て 高 か っ た 。2)ADM耐 性 株ATL‑2/ADM cl‑l、ATL‑2/ADM cl‑2、 SALT‑3／ADMお よ びED‑S／ADMのICsoは そ れ ぞ れ1.659、4.403、1．910お よ び0.655皿 Mで あ り 、 そ れ そ れ の 親 株に 比 較 し て2倍 、6倍 、5倍 、6倍 に増 強し 、ADMに対 して 強い 耐 性 を 獲 得 し て い た 。3)ADF蛋 白 量 はATL細 胞 株ATL‑2、SALT‑3、ED‑Sで 、T細 胞 性 自 血病 株Ju rk atに 比較 してそれぞれ12．1倍、9.6倍、2.8倍多かった。また、ADM耐性株 ATL‑2/ADM cl‑l、 ATL− 2/ADM cl―2、SALT‑3/ADMお よ びED‑S/ADMのADF蛋 白 量 は 、そ れぞ れの 親株 に比 較して4.8倍、6.6倍、4.6倍および5.2倍に増加していた。41各細 胞 株に おけ るADF蛋 白量とADMのICsoは 正の 相関 を示し た(r=0.8 91、pく0.01）が、GSH― Px量（rニ0.22)ともトポイソメラーゼ活性（rニ0.19）とも相関していなかった。5)ADMの細胞 内 蓄 積 と 排 出 は 、ATL‑2とATL‑2／ADMと の 間 で 差 を 認め な か っ た 。6)P‑ glycoprotem は 、 陽 性 コ ン ト 口 ー ル のHL‐60では 発現 され てお り、HL‐60／ADMで はさ らに 増加 して い た が 、ATL由 来 細 胞 株 では 親 株 で もADM耐 性 株 で も 発現 さ れて いな かっ た。71こ れら ADM耐 性ATL細 胞 のADM以 外 の 抗 癌 剤VP―16お よ びcisplatinum（CDDP） に 対 し て は そ れ それ の親 株に 比較 する と耐 性を 示し たが 、bleomycinに対しては一定の傾向を示さなか っ た 。 ま た 、 各 細 胞 株 に お け るADF蛋 白 量 お よ びGSH−Px量 とVPー16、CDDPのIC50と の 間に 相関 は認 めら れな かっ た。8）Selenite及 びDiamide処理によって、ATL細胞株およ び そ のADM耐 性 株 に お け るADF蛋 白 量 を 減 少 さ せ る こ と に 伴 いADMのIC50も 減 少 し 、 ADM耐性が克服された。
以 上 の 結 果 か ら 、ADF／チ オ レ ド キ シ ン カ 浴TL細 胞 のADMに対 する 自然 耐性 と獲 得耐 性 に重 要な 役割 を果 たし ていることが明らかになった。一方、既知の薬剤耐性因子である P−glycoprotein、GSH―Px、 ト ポ イ ソ メ ラ ー セ 活 性 など は 、ATL細 胞のADM耐 性に はほ と ん ど 関 与 し て い な い と考 え ら れ た 。 ま た 、ADF蛋 白量 を 減 少 さ せ るSeleniteお よ ぴ Diamideに よ っ てATLのADM耐 性 を 克 服 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。ADF蛋 白 がADMに 対 す る耐 性に どの よう に関 与しているのかの詳細な機序は本研究では明らかにされていない が 、申 請者 は、ADF蛋白が 活性 酸素 スカ ベン ジャ ーと して 働く こ、 とに よっ て、ADMの活 性 酸 素 を 介 し たDNA損 傷 を回 避 さ せ る こ と を 介 し 、 あ る い はADF蛋白 が癌 細胞 のア ポ卜 ー シ ス を 阻 害 す る こ と を 介 し て 、ADM耐 性 ヘ 関 与 す る 可 能 性 を 推 察 し た 。 公 開 発 表 に お い て 、 副査 浅 香 正 博 教 授 よ り 、1）ADF遺 伝 子 導 入 に よ るADM耐 性 の 獲 得 、2）ADF低 下 に 利 用 し たSeleniteやDiamideの 臨 床 へ の 応 用 の 可 能 性 、3）ADFの 抗 酸 化 作 用 に つ い て 、 ま た 、 副 査 吉 木 敬 教 授 よ り 、4）ADFの 抗 ア ポ プ テ イ ッ ク 作 用 に つ い て 、5）ATL以 外 の 癌 で のADFとADM薬 剤 耐 性 と の 関 係 に つ い て 、6）ADM薬 剤 耐 性 細 胞 に お け るHTLV‐I遺 伝 子Taxの 発 現 に つ い て、 主 査犬 山征 夫よ り、7）ATL症 例 にお ける 薬剤 感受 性試 験の現状についてなど質問があったが、申請者は、豊富な研究経 験 に よ り 得 た 知 識 と 文 献 的 考 察 を 駆 使 し 、 ほ ぼ 妥 当 な 回 答 を な し 得 た 。 本 研 究 は 、 成 人T細 胞 性自 血 病 （ATL） 細 胞 が 産 生 するADF／ チオ レド キシ ンが、ATL 細 胞のadriamycin耐 性に 関与 する こと を初 めて 明らか にし たも ので ある 。こ の成 果は、
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通常の化学療法では治療の困難なATLの薬剤耐性克服方法の開発に重要な示唆を与え、
ATLの今後の治療に寄与するものと期待される。
審査員一同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども 併せ申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。
