博 士 （ 医 学 ） 小 林 威 夫
学 位 論 文 題 名
骨髄異形成症候群における赤血球フェリチン H ， L サブュニットの臨床的意義に関する研究
学位論文内容の要旨
目 的
フ ェ リ チ ン は 分 子 量 約45万 の 鉄貯 蔵 蛋 白 で ，H，L2種 類 の サブ ュ ニ ッ ト24
ト量を直接測定し，その臨床的意義を検討し を 用 い た 免 疫 化 学 染 色 （APAAP法 ） に よ 方 法
，さらに骨髄塗沫標本について同抗体 る 検 索 を 行 っ て 検 討 し た ． 1） 対 象 ： 対 象 は ， MDS（ RA23例 ， RAEB8例 ， CMML2例 ） 33例 その他各種血液疾患，および健常人で，原則として，未治療で輸血の既往がなく，
重篤な感染症，肝障害のないものとした．
2）被検 赤血 球溶 血液： 患者 より 得ら れたヘパリン加静脈血をBeutlerらの方法 に 従 いmicrocrystalline cellu｜oseとぱ‑celluloseを重 量比1:1に混 合し たカ ラムを通して自血球および血小板を除去し，低張液処理による溶血の後，10，OOOG 20分間遠心し上清を検体とした．
3）ELI SA法 ： ボ リ ス チ レ ン 製 マ イ ク ロ タ イ タ ー プ レ ― ト （Nunc社 ） を 固相に用いた．5 0mlq炭酸水素ナトリウム緩衝液pH 9.6に溶解した家兎抗ヒト胎盤 フェリチン多ク口一ン性抗体（IgG:コスモバイオ社）150ハg/m｜各wellに付着させ 4℃ で24時 間静 置し た．O．05％Tween−20，0.1％ウシ 血清 アル ブミ ン（BSA），
O．85％NaC｜ を 含 む り ン酸 緩 衝 液 で 洗 浄 し ， つ い で‑1％BSAを含 むり ン酸 緩衝 液を加え，室温で1時間静置した．
洗浄 後， 赤血球溶血液を添加し37℃，2時間インキヱペ―トし，再び洗浄後，単 ク 口一 ン性 抗ヒトフェリチンHサブヱ二｀yト抗体（r H02；Ramco社）1皿g/rriI，
―162―
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ま た は 単 ク 口 ー ン 性 抗 ヒ トフ ェ リ チ ンLサ ブ ヱ ニ ｀yト 抗体 （LF03；Ramco社）
2ハg/mlを 各welIに 添加し，37℃，2時間インキュペートした．各we｜Iを洗浄後，
ア ル カ リホ スフん ター ゼ標 識家 兎抗マ ウスIgGlまた はIgG 2bを 加え ，室温 で2時 間 静置 した ．再 び洗浄 後，基質としてp−nitrophenylphosphateを37℃，30分から 2時 間 反 応 さ せ ，EDTAに よ り 反 応 を 停 止 さ せ ，405nmで 吸 光 度 を 測 定 し た ， 被検溶血液を還元しない状態で測定するために，標準フェリチンとしてnativeの 肝 フ ェ リ チ ン を 用 い た ． こ の 肝 フ ェ リ チ ン を ，SDS―PAGE後coomassie bri II iant blueで染 色され たH，Lを デンシ トメ ータ ーで 測定す るとH／L比が 16:84で あ っ た の で ，ELISAの 値 は こ れ に よ り 換 算 し て 各サ ブ ュ ニ ｀yト値 とし た，有意差検定は，Studenttーtestにより行った．
4） 免 疫 化 学 染 色 （APAAP法 ） ： DAKO社 製APAAPキ ｀yト を 使 用 し ， 一 次 抗 体 にELISA法 で 用 い たRAMCO社 製 抗 ヒ ト フ ェ リ チ ンH，Lサ ブ ュ ニ
｀、ノト抗体を使用した．
結 果
健 常人 男性 では ，H 10.5土1．3attogram（ag）/cell（mean土S[），L5.9士O．7 ag/cel｜ ， 女 性 で はH5.4土O．8ag/cell，L3.9土0.5 ag/cellとH，Lと も 女 性 は 男 性 に 比 ぺ 有 意 に 低 値 を 示 し た ．RAで はH138.2土72.0 ag/cell，L 57．O土 20．9 ag/cel｜ ，RAEBで はH97．4土36.9 ag/celI，L49.3土 18．4 ag/celI，AMLで はH69．8土15.5 ag/cell，L30.1土9．7ag/cellと 男 女 合 わ せ た 健 常 人H 8.0土O．8ag/cell，L4．8土O．4ag/celIに 対し ，い ずれ も 有意 な上 昇を 示した ．両サブュニ｀yトの構成比を比較するためにH／L比を求め る と ， 健 常 人1．8土o.1に 対 し ， RA2.7土O．5，AML3．3土O．8と 有 意 に 高 値 を 示 し た ， こ の こ とか らHサ ブ ュニ ット の相 対的増 加が 示さ れ，MDSにお け る 赤 血 球 フ ェ リ チ ン の 荷 電 の 酸 性 化 と の 関 連 が 強 く 示 唆 さ れ た ， APAAP染 色 で は ，MDS患 者 の 骨 髄 赤 芽 球 の 陽 性 率 は ， 正 常 検 体 に 比 し てH， Lと も高値 を示 す傾 向がみられた．また赤芽球系細胞でもその成熟段階により差異 がみられ，より幼若な細胞ほど陽性度の強い傾向がみられた．症例数が少なく統計 的 検討 はな され ていな いが ，HがLに比 較し てや や高 率に陽性を示す傾向がみられ ELISA法 に よ り 測 定 し た 赤 血球 フ ェ リ チ ンH、Lサ ブ ュ ニ ｀yト 値 の 傾 向 と ほ ぽ 一致する結果であった．
考 案
血清フェリチンは，体内貯蔵鉄を反映する指標として日常臨床の場で広く用いら れている，しかし，その値が感染，炎症，組織破壊，悪性腫瘍などの諸因子に少を からず影響を受ける点が問題とされる．赤血球フェリチンはこれらに影響されるこ とが少なく，より正確に体内の鉄動態を反映すると考えられている，フェリチンの 測定はこれまで，抗肝また｜ま脾フェリチンを用いた塩基性フェリチンを用いる方法 が主に利用されていた，しかし，この方法では悪性腫瘍と関連するとされる酸性フ ェ リ チ ン を 測 定 し き れ な い可 能 性 が あ った， さら に， 抗心 ，また は抗HeLa細胞 フェリチン抗体を用いて酸性フェリチンを測定する方法もあるが，測定値に変動が 多 く実 用に は至 ってい ない，その点H，Lサブュニ｀yトに対する単クローン性抗体 を用いた本測定法は，これらの問題点を解決し得るものと考えられる，正常赤血球 では，酸性フェリチンが塩基性フェリチンより多く，種々の病態で変動することが 知 ら れ て い る ． 私 は こ れ ま で に ，MDSのRAに お い て 赤 血 球 フ ェ リ チ ン の 著 明 な増加と荷電の酸性化を報告してきたが，本測定法により両サブュニットがいずれ もRA，RAEB，AMLで 健 常 人 に 比 ぺ 有 意 に 高 値 で ，H／L比 も 有 意 に 高 値 を 示 す こ と か ら ，Hの 増 加 が 荷電 の 酸 性 化と 関連 があ ること が示 唆さ れた，MDSに おける赤血球フェリチンの増加の機序は不明であるが，近年，鉄の変動とは関係な く サ イ トカ イン， ホル モン ，お よび分 化に 際し て， フェリ チンHサ ブヱ ニッ トの
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結 言吾
フェリチンH，Lサブヱニ｀ソトに対する単クロ―ン性抗体を用い，2抗体サンド イ ッ チELISA法 を 確 立 し ，MDSに お け る 赤 血 球 フ ェ リ チ ン に つ い て 検索 し た その 結 果 ，RAでH，L両 サ ブ ュニ ッ ト と も 著 明 な 増 加 を 示 し，H／L比の 有意 な 増加か ら，Hサ ブュ ニッ トの 相対的 増加 が示 された ，こ れら の変 動はMDSにおけ る造赤血球能の異常，無効造血と関係するものと考えられ，サブヱニットレペルで の赤血球フェリチンの解析は，その病態を明らかにする上で有用なものと考えられ た，
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進 の 究 研 の 後 今 り ぉ て き て れ さ に か ら 明 が と こ る す 進 亢 が の も の そ 写・ 転る のれ Aた N待 Rが m展
学位論文審査の要旨 主 査 教 授 宮 崎 保 副 査 教 授 齋 藤 和 雄 副 査 教 授 西 信 三
学 位 論 文 題 名
骨髄異 形成症候群における赤血球フェリチン H ， L サ ブ ュ ニッ ト の 臨 床的 意 義 に関 す る 研究
目 的
体 を 用 い た 免 疫 化 学 染 色 （ APAAP法 ） に よ る 検 索 を 行 っ て 検 討 し た ． 方 法
1） 対 象 ： 対 象 1ま ， MDS（ RA23例 ， RAEB8例 ， CMML2例 ） 33例 そ の 他 各 種 血 液 疾 患 ， お よ び 健 常 人 で ， 原 則 と し て ， 未 治 療 で ， 輸 血 も さ れ て お ら ず ， 重 篤 な 感 染 症 ， 肝 障 害 の な い も の と し た ，
2） 被 検 赤 血 球 溶 血 液 ： 患 者 よ り 得 ら れ た ヘ パ リ ン 加 静 脈 血 をBeutlerら の 方 法 に 従 いmicrocrystalline celluloseと ロ ―celluloseを 重 量 比1:1に 混 合 し た カ ラ ム を 通 し て 自 血 球 お よ び 血 小 板 を 除 去 し ， 低 張 液 処 理 に よ る 溶 血 の 後 ，10，OOOG 20分 間 遠 心 し 上 清 を 検 体 と し た ，
3）EしISA法 ： マ イ ク 口 タ イ 夕 ― プ レ ― ト に ， 多 ク ロ ー ン 性 抗 胎 盤 フ ェ リ チ ン 抗 体 を 炭 酸 緩 衝 液 に 溶 解 後 ， 付 着 さ せPBS Tweenで 洗 浄 後BSAに て ブ ロ ｀yキ ン グ を 行 い 検 体 を 添 加 し た ， っ ぎ に 、 ラ ム コ 社 よ り 入 手 し た 単 ク 口 ― ン 性 抗 ヒ ト フ ェ リ チ ンHサ ブ ュ ニ ッ ト 抗 体 ， ま た は Lサ ブ ュ ニ ッ ト 抗 体 を 加 え 反 応 さ せ た ， そ の 後 ， ア ル カ リ ホ ス フ ん タ ー ゼ 標 識 家 兎 抗 マ ウ スIgG1ま た はIgG 2bを 添 加 し 反 応 後 ， 基 質 と し てp−nitrophenylphosphateを 反 応 さ せ ，EDTAに よ り 反 応 を 停 止 さ せ ， 405nmで 吸 光 度 を 測 定 し た ， 被 検 溶 血 液 を 還 元 し な い 状 態 で 測 定 す る た め ， 標 準 フ ェ リ チ ン と し てnativeの 肝 フ ェ リ チ ン を 用 い た ． こ れ をSDSーPAGE後 デ ン シ ト メ ー 夕
― で 測 定 す る と H， L比 が 16:84と な りELISAの 値 は こ れ よ り 換 算 し 各 サ ブ ュ ニ ッ ト 値 と し た ，
4） 免 疫 化 学 染 色 （ APAAP法 ） ： DAKO社 製 APAAPキ ｀ yト を 使 用 し ，
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一 次 抗 体 にELISA法 で 用 い たRAMCO社 製 抗 ヒ ト フ ェ リ チ ンH，Lサ ブ ュ ニ ット抗体を使用した．
結 果
RAで は H138.2士 72． Oag/cel｜ ，L57．O土20.9 ag/celI，RAEBで はH 97．4土36．9 ag/cell，L49.3土18．4ag/cel｜ ，AMLで はH69.8土15．5 ag/ce｜ ｜ ，L30.1土9．7ag/cel｜ と 健 常 人H8．O土O．8ag/celI，L4．8土 O．4 ag/cellに対し，いずれも有意な上昇を示した．両サブヱニ｀yトの構成比を比 較 す る た め にH／L比 を 求め る と ，健 常 人1．8士O．1に 対 し，RA2，7土O，5， AML3.3土O．8と 有 意 に 高 値 を 示 し た ． こ の こ と か らHサ ブ ュ ニ ッ ト の 相 対 的 増 加が示 され，MDSにおける赤 血球フェリ チンの荷電 の酸性化と の関連が強 く 示唆された，
考 案
結 語
フェ リチンH，Lサ ブュニット に対する単 クロ―ン性 抗体を用い，両サブュニッ ト を 個 々 に 測 定 す るELISA法 を 確 立 し ，MDSに お け る 赤 血 球 フ ェ リ チ ンH， Lサ ブュ ニット 値を測定し て検討した ．その結果 ，RAで両サブ ュニットと も著明 な 増 加を 示し，H／L比の有意な 増加から，Hサブュ ニットの相 対的増加が 示され た ． 骨髄 塗 沫標 本 に対 す る免 疫 化学 染 色 にお い てもELISA法と ほ ぼ一 致す る結 果 が 認め られた． これらの変 動はMDSに おける造赤 血球能の異 常，無効造 血と関 係す るものと考 えられ，H，Lサブュニッ トレペルで の赤血球フェリチンの解析は その 病態を明ら かにする上 で有用なも のと考えら れた．
以上 より，本研 究は博士（ 医学）の学 位論文とし て妥当なものと判断される．
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