鼻アレルギ-発症ならびに鼻粘膜過敏性出現における鼻粘膜神経系の役割に関する基礎的検討
68
0
0
全文
(2) 博士 学位 論 文. 鼻 ア レル ギー発症 な らびに鼻 粘膜過 敏性 出現 における 鼻 粘膜神経 系 の役割 に関する基礎 的検討. 平. 浪. 成4年11月. 松. 昭. 夫.
(3) 次. 目. 1. は じめに 第1章. モルモ ットにおけ る定量的鼻汁分 泌量測定方法 3. 1緒. 言 3. 皿 実験材料な らびに実験方法 3. 1.実 験動 物 QU 3. 2.使 用薬 物 及 び試 薬 a鼻. 汁 分 泌 量測 定 用fluorescein染. 色糸 の作 製 4. 4.抗 卵 白ア ル ブ ミン血 清 の作 製 5.受 動 感 作 モ ル モ ッ トに お け る鼻 ア レル ギ ー症 状 の誘 発 と鼻 汁 分 泌 量 の測定 …… …4 6.Methacholine及. びhist舳ine誘. 発 によ る鼻 汁 分泌 量 の測 定5 に﹂. 7.鼻 ア レル ギ ー症 状の観 察 ス コ ア. 匠 0. &薬 物の投与方法. ρ0. 9統 計処理. ハ 0. 皿 実験結果 1.鼻 汁 分 泌 に よ るflmrescein染. 色 糸 の染 色部 分 の伸長 と鼻 汁 分 泌量. の相関性. 6 7. Z鼻 汁分泌量 と鼻汁分泌 スコアの相関性 a抗. 原,histamine及. びmethac血01ine誘. 9. 発 に よ る鼻 汁 分 泌. 10. 4鼻 汁分泌に対す る抗ア レルギー剤の効果 w考. 察. 11. V小. 括. 13. 第2章. 鼻 ア レル ギ ーモ デ ル の鼻汁過 分 泌 反 応 と鼻 粘 膜muscarinicAChレ. セ プ ターの相 関 性. 71 π皿. 緒言. 14. 実験材料 ならびに実験方法. 14. 1.実 験 動 物. 14. a放 射性標識化合物及び試薬. 14. a卵. 白 アル ブ ミン能動 感 作 モ ル モ ッ トの作 製. 14. 4血. 清IgG1及. 15. びIgE抗. 体 価 レベ ル の測 定. 15. 5.受 動感 作 方法. (i).
(4) 6.鼻 汁 分泌 量 の測 定. 15. 7鼻. 15. ア レル ギ ー症状 の誘 発. &Methacholine誘 9粗. 発 に よ る鼻汁 分 泌量 及 び 閾値 の測 定. レセプ ター膜 の調 製. 15 15. 1α レセプ タ ー の定量. 16. 11.統 計 処理. 16. 皿 実験結果. 16. 1.能 動感作モルモ ッ トにおける鼻粘膜過反応性 と過敏性. 16. Z能 動感作モルモ ッ トにおけ る鼻粘膜 自律神経 レセプ ターの変動. 17. 翫 受動感作あるいは能 動感作モルモ ッ トにおける鼻汁分泌量 と血清抗体量 の関連性. 18. 4.能 動 感 作 モ ルモ ヅ トに おけ る鼻汁 過 分 泌反 応 と鼻 粘 膜mscarinicACh 20. 教 幅. W V. レセ プ ター の関連 性. 21 23. 第3章. 反 復 寒冷 暴 露(S岨Tス. トレス負 荷)に よ る鼻粘 膜 過敏 性 モデ ル と薬 物 効 果. 1 π 皿. 緒言. 24. 実験材料な らびに実験方法. 25. 1.実 験 動 物及 びス トレス負 荷方 法. 25. 2.使 用薬物,放 射性標識化合物及 び試薬. 25. 3.鼻 汁 分 泌量 の測 定. 25. 4.Methacholi皿e誘. 25. 5.Hist{皿i皿e誘. 発 に よ る鼻 汁 分 泌 量 及 び 閾 値 の 測 定 発 に よ る閾 値 の 測 定. 25. 6.粗 レセ プ タ ー膜 の調 製. 25. 7レ. 26. セプ タ ー の定 量. &抗 卵白アルブ ミン血清の作製. 26. a受 動感作による鼻 ア レルギー症状の誘発. 26. 1α 薬物の投与方法. 26. 11.統. 26. 計 処理. 26. 皿 実験結果 1.S岨Tス. トレスモ ル モ ヅ トの鼻粘 膜過 反応 性及 び過敏 性 の検 討. (ii). 26.
(5) 2.S岨Tス. トレス モ ル モ ッ トの鼻粘 膜 にお け る自律 神経 レセ プ ター及 び. hist細i皿eH1レ. セ プ ターの変 動. 29. 3.S駅Tス. ト レス モ ル モ ッ トの 鼻 ア レ ル ギ ー 症 状. 30. 4.S岨Tス. ト レ ス モ ル モ ッ トの 鼻 粘 膜 過 敏 性 に 対 す る薬 物 の効 果. 31. 5.s択Tス. トレ ス モ ル モ ッ トの 鼻 粘 膜muscarinicAChレ. セ プ ター量. の増加 に対す る薬物の効果. 33. 6.受. 動 感 作 に よ る鼻 ア レル ギ ー 症 状 に 対 す る薬 物 の 効 果. 7.受. 動 感 作S択Tス. ketotife且. 33. トレ ス モ ル モ ッ トの抗 原 誘 発 鼻 汁 分 泌 に 対 す る. あ る い はtra皿ilastとNeurotropinの. 36. 併用作用. 察 考. W V. 括 小. 37 40. 第4章. 鼻 粘膜知覚神経系を介 した鼻汁分泌反応 と薬物効果 11. 緒言. ・42. π 皿. 実験材料な らびに実験方法. 42. 1。 実 験動 物. 42. 2.使 用薬 物 及 び試 薬. 42. a受. 43. 動感作方法. 4.鼻 汁分 泌 量 の測 定. 43. 5.種 々の刺激剤によ る誘発鼻汁分泌量 の測定. 43. a薬. 43. 物の投与方法. 7.統 計処 理. 43. 皿 実験結果. 44. 1.種 々の 刺激 剤 に よ る鼻 汁分 泌反 応. 44. 2.鼻 汁 分 泌 機序 の 検討. 44. a種. 47. 々の誘発鼻汁に対す る抗ア レルギー剤の作用. 察 考. W. 48. 括 小. V. 50. 総括. 51. 参考文献. 53. 謝辞 略語一覧表. (iii).
(6) は じめ に. 鼻 ア レルギ ー は発 作性 反 復性 の く しゃみ,鼻 汁 分泌 及 び鼻 閉 を3主 徽 とす る鼻 粘 膜の1型 ア レル ギ ー性 疾 患で あ る.す な わ ち,抗 原 暴露 に よ り抗 原特 異 的IgE抗 に存 在 す る肥満 細 胞 の細 胞 膜 のIgE抗 レルギ ー性chemical鵬diatorsが. 体 と抗 原 の結 合 に よ り肥 満細 胞 の特 異 穎粒 に含有 され るア. 放 出 さ れ,こ れ らが 鼻粘 膜 の神経,血 管 及 び分 泌 腺 な どを刺 激. して発 症 す る と考 え られ て い る3一η.一 方,鼻. ア レルギ ー患者 の鼻粘 膜 で は非 特異 的 過敏 性 や過 反. 応 が 出現 す る ことが 経験 的 に知 られ てお り8一拗,ま い は悪 化 した り13-15},reserpineを くな い16}.事. 実,鼻. acetylcholineレ. 体 が 産生 され1・2⊃,鼻粘 膜 表 層. た鼻 ア レル ギ ーが妊 娠 を契 機 と して発 症 あ る. 長期 連 用 してい る高血 圧 康者 の中 には鼻 閉 を訴 え る人 も少 な. ア レル ギ ー 憲 者 で は 慢 性 副鼻 腔 炎 患 者 と比 較 して,鼻 粘 膜 の 皿uscari皿ic. セ プ ター(rACh・Rと. 略)量 の増 加,α1一 及 び β一adrenergicレ セプ ター(そ. れ ぞ れ α1・R及 び β・Rと略)量 の 減 少 が 認 め られ て い る 」6-2°,.ま た動 物 実 験 に お い て は, estrogen,progesterone及. びreserpine長. 期 投 与 モ ル モ ッ ト,な らびに 妊 娠 モル モ ッ トの鼻 粘. 膜 に お いて も類 似 の鼻 粘 膜 自律 神経 レセ プ タ ーの量的 変 動 が 認 め られ てい る16・21}.そ れ ゆ え,鼻 ア レル ギ ーにお い て観 察 され る特有 の鼻 粘 膜 過 敏性 の 出現 に は,種 々の因 子が 関与 してい る可 能 性 が 考 え られ て い るが,少 な くと もそ の1つ と して 自律 神 経 系 の ア ンバ ラ ンス が 考 え られ るよ うに な って きた. しか しなが ら,鼻 ア レル ギ ーに 関す る研 究 領 域に お い て は次 に示 す よ うな 問題 点 が存 在す る.す な わ ち,①. 鼻 ア レル ギ ー研 究 に は モル モ ッ トが汎用 さ れ て い るが,現 在 ま で の とこ ろ,そ の 症 状. 観察 に は く しゃみ以 外 に は有 用 でか つ定 量 的 な観 察項 目 はな く,今 後 の研 究 にお い て鼻汁 分 泌 量 の 定 量的 測 定 法 の 開発 が 望 ま れ て きた.② デ ル が な い,③. ヒ ト鼻 ア レル ギ ー に近 い実 験 的鼻 ア レルギ ーの適 切 な モ. ヒ ト鼻 ア レル ギ ーに近 い実 験 的 鼻 ア レル ギ ーモ デ ル動 物 を用 い て の鼻粘 膜 過 敏 性. の 出現 過 程,及 び ④ 鼻 ア レル ギ ー症 状 あ る い は鼻 粘 膜 過敏 性 と鼻粘 膜 自律 神 経機 能 の 関 連 性 を 明 らか にす るこ とが 必 要 で あ る.⑤ て い るが22朝),果. 鼻 ア レル ギー症 状 が 外 部 環境 によ り変 化す るこ とが 報 告 され. た して外 部環 境 変化 に よ り鼻粘 膜 過 敏 性 が 出現 す るのか,ま た鼻 ア レル ギ ー症. 状 の 出現 に どのよ う に影 響 を与 え て い るの か 未 だ不 明朗 で あ る.⑥ デ ィア ン(vidian)神. 鼻 ア レルギ ー患 者 にお け る ビ. 経 切 除 術 によ る観 察 か ら鼻汁 分 泌 は神 経 反射 を介 して 行 わ れ てい る可能 性 が. 示 唆 され てい るが25-28D,こ. の神 経反 射 を介 した鼻 汁 分 泌 機 序 は未 だ明確 で な い.そ こで,本 研究. で は鼻 ア レル ギ ー発 症 な らび に鼻 粘 膜過敏 性 出現 にお け る鼻粘 膜 自律 神経 系 及 び 知覚 神経 系 の 役 割 を明 らか にす るこ とを 目的 と して,上 記① ∼ ⑥ の問題 点 を モデ ル動 物 を用 い て実 験 薬 理学的 に検 討. 一1一.
(7) す る こ とと した.す なわ ち,モ デ ル動物 を用 い て,症 状観 察,血 清抗 体 量,及 び鼻 粘 膜 自律神 経 レ セ プ ター の変 動 等 を指 標 と して,第1章 発,第2章. では モ ルモ ッ トにお け る定量 的 鼻汁 分 泌量 の測 定 方 法 の開. で は能 動感 作 モル モ ッ トを用 い,鼻 ア レル ギ ーモデ ル と して開発 し,次 いで この モデ ル. を用 い て鼻粘 膜 過敏 性 の出 現 と 自律 神経 系 機能 の関 連性 を検 討 した.第3章. では外 部 環境 変 化 を考. 慮に 入れ,反 復 寒冷 暴露 に よ る自律 神経 失調 性 動 物 を 用い て,鼻 ア レル ギ ー及 び鼻 粘 膜過 敏 性 出現 と自律 神 経 機 能 の関 係 に つ い て調 べ た.第3章. で は さ らに 自律 神 経 機能 異 常 を緩 解 して 鼻 ア レル. ギー症 状 を 改善 す ると臨 床上 考 え られ て い る鎮 痛 ・抗 ア レルギ ー剤 で あ るワ ク シニ ア ウイ ル ス接 種 家 兎炎 症 皮 膚 抽 出液Neurotropin29-31)が. 果 た して 自律 神経 系 に作 用 して鼻 ア レルギ ー症 状 を改 善. す るのか 否 か に つ い て も検 討 した.次 に第4章 で は鼻 粘 膜 知覚 神経 系 を介 した鼻汁 分 泌反 応 にっ い て調 べ ると と もに,魏. り伽. の実 験 系 に おいて 種 々の抗 ア レル ギ ー剤 の 作用 様 態 を 明 らか に す る薬. 効 の評 価 法 に つ い て も検 討 した.. 一2一.
(8) 第1章. モルモ ッ トにおけ る定量 的鼻汁分泌量 測定方法. 1緒. 言. く しゃみ,鼻 汁分 泌及 び 鼻 閉 は鼻 ア レル ギ ー に お け る典型 的 な症 状 で あ る.臨 床診 断上 で は それ ら症 状 の程 度 は奥 田の重 症 度 分 類法32・331に従 って判 定 され,ま た定量 的 に は鼻 汁分 泌 量,く. しゃ. み回数 及 び鼻 腔 抵抗 の測 定 に よ り評価 され て きた. 一方 ,動 物 実験 に おい て は 鼻汁 分泌 の定量 的 測 定 は困難 であ り,薬 剤 の効 力試 験 に は(1)入 船 ら の症状 観 察 ス コア34・39,あ. るい は(2)く し ゃみ及 び鼻 掻 き反 応 回 数 に対 す る抑 制効 果 鋤. な どが. その容 易 さ ゆえ に広 く使用 さ れ て きた.し か しなが ら,入 船 らの鼻 症 状 観察 ス コア は客 観性 や定量 性 に 関 して 異 論 の多 い と ころ で あ り,ま た鼻 掻 き反応 を鼻 症 状 の一 一っ の 指標 とす るの に も問題 が あ る と考 え る人 が多 い. 本 章 で は鼻 ア レルギ ー の研 究 に汎 用 さ れて い るモ ルモ ッ トに お け る鼻汁 分 泌量 の 簡便 でか っ客 観 的測 定 方法 の 開発 を一 っ の 目的 と し,臨 床 に お い て流 涙 や少 量 の 自発 鼻汁 な どの測 定 に使 用 さ れて い るflurescein染. 色糸 法37・38⊃を実験 動 物 に適 用す るこ とを検 討 した.ま た この 鼻汁 分 泌量 測 定. 方 法 の鼻 ア レルギ ーや抗 ア レル ギ ー剤 の研 究 分野 に おけ る有 用 性 につ い て も検 討 を 加 え た.. Il実 1.実. 験 材 料 な ら び に 実 験 方 法. 験 動 物. 体 重400∼600gのHartley系 70%,12:12の. 雄 性 モ ル モ ッ ト(日. 明 暗 サ イ ク ル(明. と水 を 自 由 に 摂 取 させ て5日 2.使. 期;午. 前8時. 本SLC)を. ∼ 午 後8時. 間 以 上 予 備 飼 育 した の ち,健. 購 入 し,室. の 間)に. 温24℃,湿. 度45∼. 調整 した飼育 室 内 で 固型飼 料. 常 な も の を 実 験 に 供 した.. 用 薬 物 及 び 試 薬. 薬 物 と し てketotifenfumrate(Zaditen⑪,サ (Flubron②,エ 工 業),ウ. ス エ ス)を. 使 用 し た.そ. ン ド薬 品)及. の 他 試 薬 と して 卵 白 ア ル ブ ミ ン(eggalbumin,生. シ 血 清 ア ル ブ ミン(Sigm),fluoresceinsodim(キ. carboxy皿et血ylcellulosesodium(CMCと histaminedihydrochloride(Histと 3.鼻. 略)(以 上,和. sodiumで. 綿 糸(横. 光 純 薬)を. 略)及. び. 使 用 し た.. 色 糸 の 作 製. 田 株 式 会 社)の. 染 色 し,染 色 部 分 の 長 さ を10皿. 化学. シ ダ 化 学),evansblue(Sig皿),. 略),methacholi皿echloride(MChと. 汁 分 泌 量 測 定 用fIuorescein染. 脱 脂 し たNo.40/2の. びflutropiu皿bro皿ide. 一・ 端 を 生 理 食 塩 液 で 希 釈 し た10%fluorescein. 全 長1㎝. 一3-一. 皿 に 切 断 して 鼻 汁 分 泌 量 測 定 用 染 色 糸 を 作 製.
(9) し た.. 4.抗. 卵 白 ア ル ブ ミ ン血 清 の 作 製. 寺 田 らの 方法39Dに 従 い,モ ルモ ッ トにal皿in皿hy己ride(硫. 酸 ア ル ミニ ウ ム と水 酸 化ナ ト リ. ウム を常 法 に従 って反 応 させ て作 製)10㎎ を ア ジュバ ン トと し,ldlの アル ブ ミン20μgを2週. 生理 食 塩 液 に溶 解 した卵 白. 間 間 隔 で7回 腹 腔 内醸 作 した.最 終 感 作 の2週 間後 よ り,超 音波 ネ ピ ュラ. イザ ー(オ ム ロン)を 用 い て1』躍 皿加の霧 化 量 で2分 間,計2窩4の 液 を連 日5日 間経 気道 感 作 した.さ. らに1週 間 後 に,1%卵. α ゐ%卵 白 ア ル ブ ミン生 理食 塩. 白ア ル ブ ミン生理 食塩 液50μ4を マ イ. ク ロ ピベ ッ トを 用い て両 側鼻 腔 内 に 注入 し,く しゃみ及 び鼻 汁 分 泌等 の典 型 的 な鼻 ア レル ギー症 状 の 出現 した モル モ ッ トの み か ら採血 を行 い,血 清 を採取 した後,プ ール血 清 と して 一80℃ で凍結 保 存 した.同 種 受 身 皮 膚 ア ナ フ ィ ラキ シ ー(homlogouspassivecutaneousanaphylaxis,以 homlogousPCA)反. 下. 応 はOvaryら の方 法4°⊃ に従 って観 察 した.す なわ ち,勢 毛 した モル モ ッ トの. 背部 皮 膚 に希 釈 した血 清 各0.1dlを 皮 内 注射 し,4時 含む1%evansMue加. 生理 食 塩液b4を. 間 あ るいは7日 後 に卵 白 ア ル ブ ミン500㎎ を. 前 肢 正 中静 脈 よ り投 与 した.そ の30分 後 に 断頭 放血 して. 皮 を剥 い で 皮膚 内面か ら観 察 し 皮 内注射 部 位 の青染 班 の直 径 が5㎜ 以上 の もの を 陽性 と した.な お作 製 したプ ール血清 の4時 間及 び7日 間h㎝010gousPCAtiterは. そ れぞ れ8,192及. び1,024倍. であ った. 5.受. 動 感 作 モ ル モ ッ トに お け る 鼻 ア レ ル ギ ー 症 状 の 誘 発 と 鼻 汁 分 泌 量 の 測 定. {. ABC FIG.1.闘ethodofmesure■entof暇. 瞳sals㏄retionind鰻oedbyalier8enin. passivelysensitizedguineapigs。 ム:Nasalprovocationuasdonebythe apPlicationof50メ40f1瓢ovalbo■inontheunilate,a亘anteriornaris2dbys fol且 ㎝i㎎intmperito㎜1sensitizationuithantioりalbu■inseru■.8:T㎝9in later,api㏄eofcottonthreaddye虹uithfluoresoein騨asplacedonthe unilateraianteriornaris.C:翼 副salseeretion脳as■ wi㎞f匪. 眠 ⊃re㏄e血. 層hid1冊s敗. 船. -二. 豚ぐ. rd. 紀pt伽refbr60s㏄.. 一4一. 陀駐s腿red賢ithathregddyed.
(10) 抗 卵 白 ア ル ブ ミン血 清24を. 腹 腔 内 感 作 し,そ の2日 後 に1%卵. 白ア ル ブ ミン生 理 食塩 液50μ4. を左 鼻 腔 内 に滴 下 して鼻 ア レル ギ ー症 状 を誘 発 した.誘 発 の10分 後,染 色糸 の染 色 端約15皿 を左 鼻 腔 内 に60秒 間挿 入 し,鼻 汁 に よ り伸 長 したfluorescein染 の指 標 と した(FIG.1及. 色 長 を測定 し,そ の 長 さ を鼻 汁分 泌量. び2).. 1.5uperindor,2.cho胸chanasiventrali5,3.こhoo⊂hanasidor5ali∼. び. 4.くhon⊂hanasiethmoidale5、5.くho"`ha,6.ath爬addyedwith. fl・。・…ei・. ・影:1・5e・ta・ea。fath・eaddyedwithfl・. FIG.2.Insertareaofathreaddyedwithf匿. 。re5・ei・. 馴囮res⊂ ￡inintheoasalcavityofa. 9μ1neap匿9・. 6.Methacholine及 MCh及 びHistを. びhlsta図ine誘. そ れ ぞれ 生 理食 塩 液 に溶解 し,そ れ ぞれ の 溶 液lo裡 を左 側 鼻 腔 内 に マイ ク ロ. ピペ ッ トを用 い て注 入 し,5分 3xlo-1g/4の. 発 に よる鼻 汁分 泌 量 の測 定. 間 隔 で鼻 汁分 泌 量 を測 定 した.誘 発 鼻汁 分 泌 の経 時変 化 の検 討 に は. 題Ch及 び10-1gん4のHist溶. lo'3∼3xlo-1g/切. 及 びHistlo-3∼1rlgん4の. 液 を使 用 し,ま た鼻粘 膜 反 応 陞 の 検 討 に は 麗Ch3x 希 釈 液 を低 濃 度 側 よ り順 次 左側 鼻腔 内に 注入 し,. 10分 間 隔に鼻 汁 分 泌量 を測 定 した. 了.鼻 ア レ ル ギ ー 症 状 の 観 察 ス コ ア 入船 らの鼻 ア レルギ ー症状 ス コア 鋤 鼻 汁 分泌 を 認 め ない,1;鼻 る,の4段 8.薬. に従 い,鼻 汁分 泌 の程 度 をス コア 化 した.す なわ ち,0;. 腔 入 口部 に認 め られ る,2;1と3の. 中間,3;鼻. 腔 外 まで流 れ 落 ち. 階 と した.. 物 の投 与方 法. 各薬 物 の投 与 量 は遊 離 塩 基量 に換算 して表 示 した.Ketotifenは0.5%C鵬 し,投 与 容 量 が54/kgと. 溶 液 に て懸 濁 溶 解. な るよ うに 調 製 して抗 原 に よ る症 状 誘 発 の60分 前 に 経 口投 与 した.. 一5一.
(11) Flutropiumは. 生 理 食塩 液 に溶 解 し,適 用容 量 が50μ1とな るよ うに調 製 して 症状 誘 発 の10分 前 に抗. 原刺 激側 に局 所 適用 した. 9.統. 計 処 理. 実験 成 績 は平 均値 ±標準 誤 差 で表 示 し,群 間 の比較 は一 元配 置 分散 分 析 を行 った の ち,2群 比較 に はStudeat'sHestを,多. 群 間 の比較 に はDunnettの. 間の. 多 重 比 較 を使 用 した.い ず れ の場. 合 も危 険率P〈0.05で差 が認 め られ る場 合 に有意 と した.. Ill実 1.鼻. 汁 分 泌 に よ るfluorescein染. 験 結 果 色 糸 の 染 色 部 分 の{申長 と 鼻 汁 分 泌 量 の 相 関 性. 染 色 糸 に0.5∼4.0μ4の 生 理 食 塩 液 を滴下 して30秒 後 新 た に伸 び たfluorescein染. 色 部 分 の長. さを測 定 した と ころ,0.5∼4.0μ4の 範 囲に お い て 液 量 と色 の伸 長 と の 間 に直線 性 が 得 られ,明 か な相 関 性 が 認 め られ た(FIG.3A).ま. た モル モ ッ トに10-2∼3x10幽1gん2のMChを. ら. 点鼻 し誘 発 さ. れ た鼻 汁 分泌 を この染 色糸 で 測定 し,染 色糸 の重 量 増加 と色 の伸 長 の 関係 を調 べ た と ころ,両 者 間 に 直線 性 が得 られ,明 らか な相 関 性 が 認 め られ た(FIG.3B).. 一6一.
(12) 2.鼻. 汁 分 泌 量 と鼻 汁 分 泌 ス コ ア の 相 関 性. 抗卵 白 ア ル ブ ミン血 清 で受 動感 作 した モル モ ッ トを使用 し,抗 原 誘 発 によ る鼻 汁 分泌 量 の 鼻汁 分 泌 ス コア との相 関 性 に つ い て検 討 した.抗 原 誘 発 鼻 汁 分 泌 に よ る色 の伸 長 を 見 る と,正 常(非 感 作)動 物 に おい て は卵 白ア ル ブ ミン及 び ウ シ血 清 ア ルブ ミンは ともに軽 度 の鼻 汁 分 泌 を引 き起 こ し たにす ぎなか った.一 方,受 動感 作 動物 にお い て は抗 原 とな る卵 白ア ル ブ ミン の適用 時の み 多量 の 鼻汁 分 泌が 引 き起 こされた(FIG.4). 次 に種 々 の希釈 濃度(希 釈 倍数:1∼1/32)の. 抗 血 清 で受 動感 作 した モ ルモ ッ トに お け る鼻 汁 分泌. 量 の鼻汁 分 泌 ス コア との相 関 性 を見 る と,感 作 抗 血清 濃度 が薄 くな るにつ れ て鼻 汁分 泌 症状 が弱 く な り,ス コア0お よ び1の 出現 が 多 く見 られ た(FIG.5).ま. た 鼻 汁 分 泌 ス コア と平均 鼻 汁 分 泌量 の. 間 に は明 らか な 相 関牲 が見 られ た もの の,ス コア0に お いて も鼻 腔 内 で はか な りの鼻 汁 分 泌 の あ る こ とが 明 らか とな った(FIG.6).な. お鼻 腔部 に 生 理 食 塩 液50μ2を注 入 して10分 の観 察 時 間終 了後 に. お け る鼻 汁 の 糸 の染 色 に与 え る影 響 を調 べ た ところ,0∼3㎜. とわ ずか な色 の伸 長 が見 られ た にす. ぎなか った(FIG.6).. lnta(t τhreaddyedwithfluores`ein. P「ovo`ationtest A.lnanormalgulneapig. 8・hapa55ivelysensitizedguineapig .Control{Saline}. (ontro1(Sallne). Afterprovoζationby. Afterprovocationby. ovalbu団in. ovalbuminくallergen》. bOvineserumalbumin. bovineserumalbumin. ほ. ロ. ほ. ユ. し. ロ. ロ. ユ. 050. な. ロ. ユ. ら. 100mmO. FIG.4.Thestfetdlofoolorofathreaddレe己 seO1℃tiOnind酬byalle㎎. μ 盒inpaSS董. ロ. ロ. ロ. ロ. ニ. ニ. ロ. . 50. 騨ithflmresceind賦etomsa藍 ▼e且ySe田 四董tiZedg瞬iOeapigS・. 一7一. コ. サ. 100m鵬.
(13) 0 0 る 0 ユ 0 0 び リ 0 ムコ 0 ユ 0. 宕 ∈︾己旧 gい 2 0三主 り三 ﹁o言 コ⑩9 =二 9 0でご o モ ヴ o﹂ 蟹2 ↑. Dilutionofantise四m(1:N). 0123 只hinorrhea(5ζore}. FIG.5.駐e且ationshipbet貿eenoasa置seeretionsandsooresofrhinorrheain passive旦ys㎝sitizedg腿ineapigS(ID.. 3(s⊂ore). Saline. Ovalbumin{AIIergen). FIG.6.Relationshipbetりeennasalseeretionsandsco1℃50frhinorrheain passivelysensitized8μinGapigs(皿D.Datarepres㎝tthe■eanvaloes±S.E.。. 一8一.
(14) 3.抗 原hist㎝ine及. びmethacholine誘. 受動 感 作 モ ル モ ッ トに 対 す る抗 原誘 発,あ. 発 に よ る鼻 汁 分 泌 るい は正 常 モル モ ッ トに対 す るHist及. び 鵬h誘 発. に よ る鼻 汁 分 泌量 を誘 発 後5分 間隔で経 時的 に測定 した.抗 原 誘 発 によ る鼻 汁分 泌 は誘 発後30分 ま で続 い たが,最 大反 応 は10分 以 内に認 め られ た.Hist誘 が,経. 時的 に その量 は少 な くな った.㎜h誘. 発 に お いて も30分 ま で 鼻 汁分 泌 が 続 い た. 発 で の鼻 汁 分泌 は10分 後 ま でで,そ れ以 降 は認 め られ. な か っ た(FIG.7).. FI6.7.Ti圃eoou2sesofnasals㏄ gethaeholioeingμineapigs.EadlLeo1町. 『etiooi血ce6byallergα 亘,histagineand ■na口dve『t重calba『rqpPes㎝tthege田ln. va1"es±S.E.of7-99腿ioeapig箪.. 次 に抗 原,Hist及. びMChを. 一 側 鼻 腔 に 適 用 し,刺 激 側 と非 刺 激側 の鼻 汁 分 泌 量 を測 定 した.. 受 動 感 作 モ ル モ ヅ トに 対 す る抗 原 誘 発 及 び 正 常 モ ル モ ッ トに対 す る低 濃 度(10-2gノ 認 以 下)の. 一9一.
(15) Hist誘 発 に よ る鼻汁 分 泌 量 は刺 激側 と非刺 激 側 の 間 で は何 ら差 異 は認 め られ なか ったが,高 濃 度 (3x10-29ん. 似 上)のHist誘. 発 で は刺 激 側 の 方 が 鼻 汁分 泌 量 が 多 く見 られ た.一 方,鵬h誘. 発. で は刺 激 側 の みに鼻汁 分 泌 が 見 られ,非 刺 激側 では ほ とん ど鼻 汁 分 泌 は見 られ な か った(FIG.8).. 3x1α31α23x1ぴ210・3x1ぴ1{91ml) Con⊂entration FIG.8.Nasalse肥retionind艦ce己byanergen,hista口ineand■ethad的linein guineapigs.Ead馳oolo■oandverticalbarrqpresα 109購ineapigs.. 4.鼻. 亘tthe■. ㎜values±S.E.of. 汁 分 泌 に対 す る抗 ア レルギ ー剤 の効 果. 8倍 希 釈 の抗 卵 白 ア ル ブ ミン血 清 で 受 動 感 作 した モ ル モ ヅ トの 抗 原 誘 発 鼻 汁 分 泌 に 対 す る ketotifen及. びflutropiumの. 作 用 を検討 した.Ketotifenの. 的 に抗 原 誘 発 鼻 汁分 泌 を 抑 制 した.Flutropiu皿. 抗 原 誘 発 前 の 経 口 投与 は用 量 依 存. の局 所適 用 もまた 鼻 汁分 泌 を抑 制 した(FIG.9).. 一10一.
(16) Drug. Dose. 0. 1 0.5%⊂MC {Control). 5m1/kg. P・o・. Ketotifen. O・3mg/kg. P・0・. 1. P・o・. 3. P・o・. Saline. % lnhibition 50 1. Nasalseαetion(mm). Route. 50pl!naris. topkal. O.1mg!naris. topkal. 10 1. 40 1. 2030 11. H H. 15.0. }-i*. 42.2 51.4. ト1**. H. にontrol) Flutropium. **. 57.1. FI6.9.Eff㏄tofketotifenorflutropiu■onnasalseoretioninducedby allergeninpaSSiveiySen喧itiZedg聾ineapigs.Ketotifen塾. 職Sa己. ■inistere{1P.o.. 60咀inpriortonasalpro配ocation.Fiutropiu■uasa藺Pliedtopically10彊in priortonasalpro㎜tion舎Eadboo艮 唱 劃■nandhoriz㎝talb6rrel躍 values±S.E.of8goineapigs.寧,騨:significantiydifferentfro■ead塵. ゜esentthe■ean. ㎝tmolatp〈0.05{血P〈0.01,麟tiveiy.. lV考. 察. 臨 床 に お け る 鼻 汁 分 泌 量 の 測 定 法 に は 吸 引 管28,,滅. 紙41⊃ 及 びfluorescein染. 色 糸37・38,な. どを用い る方法があ る.吸 引管及び麹紙 を用い る方法 は抗原誘発試験時などの多量の鼻汁分泌量の 測 定 に有 効 で あ り,flmrescein染. 色 糸 では 自発 鼻 汁 分 泌 な どの少 量 の測 定 に有 効 で あ る と され て. い る.. 一方,動 物実験では麻酔下で抗原やHist等 の刺激剤を鼻腔灌流 し,鼻 粘膜の血管透 過性及び分 泌 の充進 を色 素 漏 出 を指標 と して測 定 す る方 法42一樹 が 報告 され てい るが,麻 酔下 で は鼻 汁 分 泌反 応 に関 与す る副 交 感神 経反 射 が 抑制 され る4η の に加 え,そ の操 作 は非 常 に煩雑 で あ る.無 麻 酔下. での鼻汁分泌 の定量的測定 は従来 困難であ ったた め,鼻 ア レルギ ーにお ける薬剤の効力試 験には (1)入 船 らの 症 状 観 察 ス コ ア34〕,あ るい は(2)く. し ゃみ及 び鼻 掻 き回 数 に対 す る抑 制効 果36)な. どが使用 され て きた.し か しなが ら,入 船 らの鼻 汁 分 泌 ス コア で は0;鼻 鼻 腔 入 口部 に 認 め られ る,2;1と3の. 中 間,及 び3;鼻. 一11一. 汁 分泌 を認 め な い,1;. 腔外 に まで流 れ 落 ち る,の4段. 階 で あ り,.
(17) そ の客観 的評 価 や定量 性 に対 して 異 論 の多 い ところで あ った.ま た鼻掻 き回数 を鼻 ア レルギ ーの1 っ の症状 の指標 とす る こ とに も異論 が あ る.そ こで今 回,鼻 汁 分泌 量 の 客観 的 測定 方 法 を確 立 す る 目的 で,臨 床 で主 と して流 涙量 測 定 に用 い られ て い る方法 で,毛 細 管現 象 を利 用 したfluorescein 染 色 糸 に よ る鼻 汁 分 泌量 の測定 を モ ル モ ッ トに適 用 す る こ とを試 み た.そ の結 果,① 限界 は0.5μ1で. 本法の検出. あ り,液 量 と染 色 部 分 の伸 長 の 間 に は 明 らか な相 関 性 が 認 め られ た.②. 発 鼻 汁分 泌 によ る染 色 部 分 の伸 長 は鼻 汁 に よ る糸 の重 量 増加 と明 らか に 相 関 した.③. 蘭Cb誘. 受 動 感作 モ. ル モ ッ トの 抗原 誘発 に よ る鼻汁 分泌 に お いて は,染 色糸 を用 いて測 定 した平 均 鼻汁 分 泌量 と入船 ら の ス コアに 相 関性 が認 め られ た.し か し,ス コア は鼻外 へ 流 出 した鼻汁 の観 察 で あ り,著 者 の方 法 は鼻 孔 内 の 鼻汁 分泌 量 の測 定 であ るた め,個 々の例 に お い て は必ず しもス コ ア と相 関 して い る とは 言 い難 か った.す な わ ち,入 船 らの方 法 は鼻 腔 外 にま で鼻 汁 流 出 の見 られ る激 しい症 状 の判 定 に の み使 い得 るが,著 者 の方 法 で は軽度 ∼重 度 のい ず れの 症状 に も使用 可能 で あ り,か つ 定量 的 に測 定 す る ことが で きた. 以 上 の 成 績 よ り,染 色 糸 を用 い た鼻 汁 分泌 測定 方法 は極 めて 簡便 で あ り,ま た客 観的 か っ 定量 的 にモ ルモ ッ トの鼻 汁 分 泌 を測 定 す る方 法 で あ る ことが 明 らか とな った.ま た操作 面 で は鼻 汁 に よ る 糸 の重 量 増 加 を測定 す るよ りも鼻汁 に よ り伸 長 した色 の長 さ を指標 に す る方 が よ り簡便 であ る と考 え られ る. 次 い で本 法 の有 用 性 を検 討 す る 目的 で,抗 原,Hist及 抗原 及 び低 濃 度(10 2g/徊似 下)のHist誘. と,ま たHist量. は明 らか に 刺 激側 の方 に多量 の鼻 汁分 泌 が認 め ら. 発 に よ る鼻汁 分 泌 反 応 は神経 反 射 を介 して行 わ れ て い るこ. が 多 くな る と,刺 激 側 で は血 管 に対 す る直接 作用 に よ る血 漿成 分 の漏 出 分 が 加. わ ってい る可 能性 が 考 え られ る.一 方,圓h誘 この場 合 はmhの. よ る鼻 汁 分 泌 反 応 を調 べ た.. 発 に よ る鼻 汁 分 泌 で は非 刺 激 側 に おい て も刺 激側 とほ. ぼ同程 度 の分 泌量 が あ った が,高 濃 度 のHistで れ た.こ れ らの結 果 は抗 原及 びHist誘. びMChに. 発 で は適 用 側 に のみ鼻 汁 分 泌 が見 られ た こ とよ り,. 鼻 腺 へ の直接 作 用 に よ り鼻 汁 分泌 が 行 わ れ て い る と考 え られ た.ま た受 動 感 作. モル モ ッ トの抗 原 誘 発鼻 汁 分 泌反 応 は抗 ア レルギ ー剤 や 局 所抗 コ リン剤 の 前処 置 で抑 制 され た.な お これ ら鼻 汁 分泌 機 序 を さ らに 明 らか にす るた め,種 々の 刺 激剤 に よ る鼻 汁分 泌反 応 にお け る神 経 節遮 断剤,局 所麻 酔 剤,抗. ヒス タ ミン剤及 び抗 コ リン剤 等 の作 用 を第4章 に お いて検 討 して い る.. 以上 の成 績 か ら,今 回 開発 した鼻 汁 分泌 測定 法 は鼻 ア レル ギ ーモデ ル に お け る鼻 汁 過分 泌 反 応 の 研 究 や鼻 ア レルギ ーに お け る抗 ア レル ギ ー剤 の薬 効評 価 に 有用 で あ る と考 え られ た.. 一12一.
(18) V小. 括. モ ル モ ッ トの誘 発鼻 汁 分 泌量 の 簡便 な測 定 方 法 を開発 した. 1)一. 端 をfluoresceinで. 染色 した脱 脂 糸 の染 色部 分 を一・ 側 鼻 腔 に60秒 間挿 入 し,色 の伸 長 を 測. 定 した.そ の 時の色 の伸 長 は液 量及 び鼻汁 に よ る糸の重 量 増 加 と明 らか な相 関 を示 した. 2)外. 観 上 か ら観 察 す る鼻 汁分 泌 ス コ ア との相 関 性 も認 め られ,ま たス コァで は判 定 す るこ との で. きな い鼻 腔 内 の鼻 汁 分 泌 量 の測 定 も可 能 で あ った. 3)抗. 原 及 びHist等. の 鼻汁 分 泌誘 発 物質 に よ る刺 激側 及 び 非刺 激 側 の鼻 汁 分泌 量 をそれ ぞ れ独 立. して測 定 す る ことが可 能 で あ った. 4)Ketotifen及. びflutropiu皿. の前投 与 は受 動感 作 モデ ル に お け る抗 原 誘発 鼻 汁 分 泌を有 意 に 抑. 制 した. 以 上 の成 績 か ら,fluorescein染. 色 糸 の 色 の伸長 は鼻 汁 分 泌 に よ る と考 え られ,そ の伸 長 の程. 度 は鼻 汁 分 泌量 を表 す こ とが 示 唆 され た.本 法 は鼻 ア レル ギ ー モデ ル に おけ る鼻 汁 分泌 反応 や抗 ア レル ギ ー剤 の薬効評 価 に有 用 であ ると考 え られ た.. 一13一.
(19) 第2章. 鼻 ア レル ギ ー モ デ ル の 鼻 汁 過 分 泌 反 応 と 鼻 粘 膜muscarinicAChレ. セ プ タ ー の 相 関 性. 1緒. 言. 鼻 ア レル ギ ーの発 症 因子 と して は,抗 原 抗 体反 応 に よ る肥満 細 胞 か らのchemicalmediatorsの 遊 離 とい う免 疫 学的 因子1一ηに加 え,修 飾 因 子 と して の 目律神 経 系 の役割 もま た重 要 視 され てい る 48-51,. .事 実,鼻 ア レル ギ ー 患者 や 実験 的鼻 ア レル ギ ー モル モ ッ トの鼻粘 膜で はm-ACh・R量. 加,α1・R及. び β・R量 の減 少 が認 め られ16-2q39・52,,鼻. の増. 粘 膜 過 敏性 の出 現 や 鼻 ア レル ギ ー症状. の悪化 に鼻 粘 膜 自律 神経 レセプ ター量 の変動 が 関 与 してい る と推 察 され て い る16・39・531.し か し なが ら,実 際 に 自律 神経 レセプ ター量 の変動 が鼻 粘膜 過敏 症状 や鼻 ア レル ギ ー症 状 に どの程 度反 映 して い るか は 明 らか で な い.そ こで本 章 で は鼻 ア レルギ ーモ ル モ ッ トの鼻 粘膜 自律 神経 レセプ タ ー 量 の測 定 を 行 い,鼻 粘 膜 過 敏性 の出現 と鼻粘 膜 自律 神経 系 機能 の関 連性 を検 討 した.ま た鼻 粘 膜過 敏性 の 出 現 時 に 見 られ る鼻 汁 過 分 泌 反 応 に 関 して,血 清 抗体 量 あ る い は鼻 粘 膜m-ACh・R量. との. 相関性 に つ い て も種 々 の検 討 を加 え た.. ll実 1.実. 験 動 物. 体 重400∼500gのHartley系 70%,12:12の. 雄 性 モ ル モ ッ ト(日. 明 暗 サ イ クル(明. と水 を 自 由 に 摂 取 さ せ て5日 2.放. 験 材 料 な ら び に 実 験 方 法. 期;午. 前8時. 本SLC)を. ∼ 午 後8時. 間 以 上 予 備 飼 育 し た の ち,健. の 間)に. 購 入 し,室. 度45∼. 調 整 した飼 育 室 内 で 固型 飼料. 常 な も の を 実 験 に 供 し た.. 射 性 標 識 化 合 物 及 び 試 薬. 放 射 性 標 識 化 合 物 と して2-quinuclidinyl[phenyM3H]benzilate([3H]QNBと TBq/㎜ol,、. ㎞ersham),[7-methoxy-3H]prazosin([3H]prazosinと. EnglandNuclear)及 ㎞ersham)を. 略,1.70 略,3.03TBq/㎜01,Ne四. び2-[propy1-2,3-3H]dihyroxyaleprenolol([3H]DHAと. 略,2.22TBq/m1,. 使 用 した.. そ の 他 試 薬 と し て 卵 白 ア ル ブ ミン,MCh,Hist,evansblue(以 じ),atropinesulfate(和. 光 純 薬),phentolaminehydrochloride(日. DL-propranololhydrochloride(Sig囮)を 3.卵. 温24℃,湿. 上,第1章. に 記載 の もの と同. 本 チ バ ガ イ ギ ー)及. び. 使 用 し た.. 白 ア ル ブ ミ ン 能 動 感 作 モ ル モ ッ トの 作 製. 寺 田 ら の 方 法39)に. 従 い,モ. ル モ ッ トにalumi皿nmhydride10㎎. 一14一. を ア ジ ュ バ ン ト と し,1紹. の.
(20) 生 理 食塩 液 に溶 解 した 卵 白 アル ブ ミン20μ9を2週. 間 間 隔 で7回 腹 腔 内感 作 した.最 終 感 作 の2週. 間 後 よ り,超 音 波 ネ ビュ ラ イザ ー(オ ム ロ ン)を 用 い て1紹/minの. 霧 化 量 で2分 間,計2認. の. 0.25%卵 白ア ル ブ ミン生 理 食塩 液 を連 日5日 間経 気 道感 作 し,そ の1週 間後 よ り実 験 に供 した. 4.血. 清lgG1及. びlgE抗. 2回 目抗原 誘 発 の2∼3日. 体 価 レベル の測定 後 に個 々の 動 物 よ り採 血 を 行 い,血 清 を分 離 した.Ovaryら. を一部 改 変 して,個 々の動物 にお け るIgG、 及 びIgE抗 び7日 聞homlogousPCAtiterを. の 方法4°〕. 体価 レベ ル の測 定 に は それ ぞれ4時 間及. 用 い た.す なわ ち,生 理 食塩 液 で2倍 毎 の希釈 系 列 で250∼. 16,㎜ 倍 に 希釈 した抗 血 清 を勢 毛 した モル モ ッ トの背 部 皮 膚1こ各 α1謝 るいは7日 後 に卵 白 アル ブ ミン500㎎ を 含 む1%evansblue加. っ 皮 内注射 し,4時. 間あ. 生 理 食 塩液1紹 を前 肢正 中静 脈 を. 介 して投 与 した.そ の30分 後 に 断頭 放 血 して皮 を剥 いで 皮膚 内面か ら観察 し,皮 内注射 部 位 が 直径 5㎜ 以 上 の青 染班 を呈 す るもの を陽 性 と した. 5.受. 動 感作 方 法. 卵 白ア ル ブ ミン能 動感 作 モ ル モ ッ トか ら採取 したプ ー ル血 清 を生 理 食塩 液 に て種 々の濃 度 に 希釈 (希釈 率:1/1∼1/16)し,鼻. 症 状 誘発 の2日 前 に これ ら希 釈 血清1畝/kgを. した.な お 非希 釈 プ ール血 清 の4時 間及 び7日 間homologousPCAtiterは. 耳 介静 脈 を介 して 投与 そ れ ぞれ8,000及. び. 1,000倍 で あ った. 6.鼻. 汁分泌量 の測定. 鼻 汁分 泌 量 の測 定 は第1章 に記 載 の方 法 に よ り行 った。 7.鼻. ア レル ギ ー症 状 の誘 発. 感 作 モ ル モ ッ トの両 側 鼻 腔 内 に1%卵. 白 ア ル ブ ミン生 理 食 塩 液50μ1を マ イ ク ロ ピペ ッ トを 用 い. て滴下 して鼻 ア レル ギ ー症 状 を誘発 し,そ の10分 後 に鼻 汁 分泌 量 を測 定 した.こ の抗 原誘 発 操 作 は 3日 間 隔で計2回 行 っ た. 8.Methacholine誘. 発 に よ る鼻 汁 分 泌量 及 び閾 値 の測 定. 初 回抗 原誘 発 鼻汁 分 泌 量測 定 の1日 後 に,鵬h誘. 発 に よ る鼻 汁分 泌 量 及 び 閾値 を測 定 した.生 理. 食 塩 液 に 希 釈 したMCh3×10-3,1r2,3x10-2,10-1,3×10-1gん2溶. 液 各10μ4を 順 次 マ イ ク. ロ ピペ ッ トを用 いて 低 濃 度側 よ り10分 間 隔 で左 鼻腔 内に 注 入 して鼻 汁 分泌 を誘 発 し,10分 間 の鼻 汁 分 泌量 を測 定 した.ま た5皿 以上 の伸 長 を 引 き起 こすMChの 9.粗. 最 小 濃度 を 閾値 と した.. レセ プ タ ー 膜 の 調 製. 生 に記載 の 採血 直 後 に,モ ル モ ッ ト鼻 腔 全 体 よ り鼻粘 膜(1匹. あた り200∼350㎎. 湿 重 量)を 摘. 出 し,Ishibeら の方 法1η を一一部 改 変 して レセ プ タ ー膜 を調 製 した.す な わ ち,摘 出 した鼻 粘 膜 を. 一15一.
(21) 氷 冷50醐Tris-HClbuffer(pH7,4)で. 洗 浄 し て血 液 成 分 を除 去 し,湿. 100容. 加 え,Polytron(Kine阻ticaCo.Inc.,PT10/35)を. 量 の 氷 冷50磁Tris-HClbufferを. てhomgenizeし,ナ. イ ロ ン メ ッ シ ュ で 粗 大 成 分 を 除 去 した 後,濾. 心 分 離 した.沈. 渣 を 氷 冷 ㎜Tris-HClbuffer(pH7.4)に. い う操 作 を3回. 繰 り返 した.最. 用い. 液 を50,000xg,4℃. 再 浮 遊 さ せ,同. 量 後,. で20分 間 遠. 条 件 で遠 心 分 離 す ると. 終 沈 渣 をincubationbuffer(5咄Tris-HClbロffer,12α. 5副KCl,2画CaC12,1曲MgCl2,pH7.4)で 1α. 重 量 を 測 定 し た.秤. 懸 濁 化 し,こ. 函N包C1,. れ を レ セ プ タ ー 膜 標 本 と した.. レ セ プ タ ー の 定 量. レ セ プ タ ー の 定 量 はIsMbeら. の 方 法17Dを. 改 変 し て 行 った.rACh・R,α1・R及. 量 に は放 射 性 標 識 化 合 物 と して そ れ ぞ れ[3H]Q冊,[3H]prazosin及 ACh・Rの. 定 量 は[3H]Q冊(0.25∼2.OnM)100耀. 1mg)をincubationbuffer中 91assfiberfi1εerを bufferで3回 冷 却 後,ト. 洗 浄 後,filterを. び[3H]DHAを. β ・Rの 定. 使 用 し た.r. と レ セ プ タ ー 膜 標 本150μ4(protein量. で25℃,30分 用 い て[3H]QNBの. び. 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た.次. いで. 結 合 型 と 遊 離 型 を 分 離 し,3認. カ ウ ン テ ィ ン グ ・バ イ ア ル に 入 れ,60℃. ル ェ ン ベ ー ス シ ン チ レ ー タ ー で あ るSci皿tisolAL-1(同. と して 約 恥atmanGF/F. の 氷 冷Tris-HC工. で6∼12時. 仁 化 学)を5認. 間 乾 燥 し た. 加 え,放. 性 を 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー(PackardinstrumentCo.Inc.,TRIC皿84640)で 特 異 的 結 合 量 は,2×1r6Matropine存 求 め た.α1・R及 行 い,非. び β ・Rの 定 量 は そ れ ぞ れ イ ン キ ュ ベ ー ト条 件25℃,30分. 他 の 操 作 はm-ACh・Rの. 定 量 と 同 様 に し て 行 っ た.蛋. Schatchardanalysis55⊃. に よ り 皿xi皿1specificbinding(Bm。. い ず れ の 実 験 もduplicateで 11.統. 測 定 した.. 在 下 で 求 め た 非 特 異 的 結 合 量 とtota1結. 特 異 的 結 合 量 は そ れ ぞ れ10-5Mphe皿tolamine及. 合 量 との差 よ り. 間 及 び37℃,10分. び10-6Mpropranololの 白 量 はLo町yら. の 方 法5の. 、)とKD値. 間で. 存 在 下 で 求 め た. で 測 定 し,. を算 出 し た.ま. た. 行 っ た.. 計 処 理. 実 験 成 績 は 平 均 値 ± 標 準 誤 差 で 表 示 し,群 間 の 比 較 は 一 元 配 置 分 散 分 析 を 行 っ た の ち,2群 比 較 に はStudent's￠-testを,多. 群 間 の 比 較 に はDunnettの. 合 も危 険 率P〈0.05で 差 が 認 め ら れ る場 合 に 有 意 と した.ま. lll実 1.能. 射活. 多 重 比 較 を 使 用 した.い. 間の. ず れ の場. た 回 帰 直 練 は 最 小 二 乗 法 に よ り算 出 した.. 験結 果. 動 感 作 モ ル モ ッ トに お け る 鼻 粘 膜 過 反 応 性 と 過 敏 性. 鼻粘 膜 過 反 応 性 に はMChに るMChの. よ り誘 発 され る鼻汁 分 泌 量 を測定 し,過 敏 性 に は鼻汁 分 泌 を誘 発 す. 最 小 濃 度,す な わ ち 顛Ch閾 値 を パ ラ メ ー一夕 一 と して測 定 した.FIG.10に. 一16一. お い て腹 腔 内.
(22) 感作後に経 気道感作及び抗原誘 発を行い鼻症状を誘発 した能動感作群(■ 及 び●)の 麗Ch各濃度 におけ る鼻 汁分泌量 は非感作群(口 及び○)と 比較 して有意に多量 となり,ま た 鵬h閾 値は有意 に低 値 とな った.一 方,腹 腔 内感 作 の みの 群(團 及 び⑭)で は非 感 作 群 と比 較 してMCh誘 分泌量 及 びmh閾. 発鼻汁. 値 の いず れ に も有 意 の変 化 は認 め られ なか った.. FIG.10.Reactivityan{1sensiti▼ityto■ethad国31i瞼einthenasa1■. 腿oosaof. 9組ineapigSaetively瓢itizedwithoサalbu■in.Nasa1■ s㎝6itivitywere■easuredbyapPlyi㎎10μ40f■etbacho亘i皿eintothe閥nilateral anteriornarisldayfo且 置o騨i㎎amsalchalle㎎euithovalb聰 ui血 期t血11i㎎e.Adiluti㎝serieso『1聡 ㎜entratiOOjUStreq巳1iredtOCaOSen圖6alSee1℃. 伽. 瞳α}s戯1reactivitya1匿1 ■in,orgro購ps. 伽1ine順 隔susdto{bteMnethe ピti㎝.Obta1℃preSU阻tthe■ean. values±S.E.of89餌ineapigs.拳,脚:significantlydifferentfroo㎜. 一. sensitize4gro叩atP〈0.05andP〈0.01,re騨tively.. 2.能 動感作 モルモ ッ トにおける鼻粘 膜 自律神経 レセプターの変動 FIG.11に. 示 した よ うに抗 原 誘発 後 の卵 白 ア ル ブ ミン能 動 感 作 モ ル モ ッ トのrACh・Rに. [3H]QNBのB鵬..は. 非 感 作 群 に 比 較 し て 有 意 に 増 加 し た が,α1・Rに. 一17一. 対 す る[3H]prazosin及. 対する び.
(23) β・Rに 対 す る[3H]DHAのB_は [3H]QNBのBm、. 有 意 に減 少 した.な. 、 と個 々の[3H]prazosinあ. お 図 に は示 して い な い が,個. るい は[3H]DHAのBm、. は なか った.ま た親和 性 の指 標 とな る レセプ ターに お け るKD値. 々の. 、 の 間 に は必 ず しも相 関 性. に はい ずれ も両群 の間 に有 意 の 変. 化 は見 られな か った.以 上 の実験 成績 よ り,以 後 の卵 白ア ル ブ ミン能 動感 作 モ ル モ ッ トは経 気道 感 作 及 び初 回抗 原誘 発後 の ものを使 用 す る ことに した.. FI砿1LCha㎎esinautom■icnervereoeptorsintbemsa1日oeosaofguineg pigsactivelyse【 四itized"itho解a1㎞in.Aetivelysensitizedgui㎜pigsfor ■easure配otsofa眠to㎜icner▼ereoeptors鴨resacrificed3daysfollo騨i㎎a nasalcha11αLgewithovalbuoin.唖choolu■nandverticalbarrepresentthe 凹eanvalues±S.E.of70r8gμineapigs.ゆ,騨:significantlydiffer㎝t fro■. 3.受. ㎜. 一sensitizedgro腿patP〈0.05andP〈0.01,reミpeetively.. 動 感 作 あ る い は 能 動 感 作 モ ル モ ッ トに お け る 鼻 汁 分 泌 量 と 血 清 抗 体 量 の. 関 連 性 種 々の 希釈 濃度 の抗 血 清 に よ り受 動 感 作 した モル モ ッ ト及 び能 動感作 モ ルモ ッ トの2種 の モデ ル 動 物 を 用 い て,個 々の 動 物 に おけ る抗 原誘 発 鼻汁 分泌 量 と血 清 抗 体 量 の関連性 を検 討 した.受 動 感 作 動 物 で は抗 原誘 発鼻 汁 分泌 量 は血清IgG、 動 感 作 動 物 で は個 々のIgG、. 及 びIgEレ. 及 びIgEレ. ベ ル に比 例 して いた(FIG.12).一. ベ ル は それ ぞれ2,㎜. 及 び250倍. 方,能. 以 上 で あ っ たが,. この 範 囲 で の血 清 抗 体 量 で は 抗原 誘 発 鼻 汁 分 泌 量 と の 間 に 相 関 性 は ほ とん ど 見 られ な か った (FIG.13).. 一18一.
(24) (500:62.5)(2000:250}(8000:1000) lgGllevel:lgEleveI (4。hrP⊂Atiter)(7-dayPCAtiter). FIG・12・Relationshipbetweennasalsecretionandse㎜{mtibodyleワelsin 9覗ine駐pigspassiveiyse脆sitizedwithantio▼alb姻 wascarrie虚outbyapPlicationof50μ40f1%ovalbu■inontheunilateral anteriornaris2〔 肱ysfollowi㎎intrav㎝oussensitizati㎝. ■inseru■.N翁sa蓋provocati㎝ 轍h1璽1!㎏bo{妙. weightofdilutedantiova重bu8insero凹(diluti㎝s:1/1-1/16;4一. めror7-day. ho■01090usPCAtiter=8,0000r1,000,respeetively}.0馳tarqpresentthe囮ean values±S.E.of8guinGapigs.. IgE6evel. lgGIIevel. Nasalse⊂retionindu(edbyallergen(mm} FI6.13.Re艮ationshipbetweenmsa量seeretionandseru■antibodylevelsin guineapigsactive塵ysensitizedwitho彫albu■in.Nねsalpro脳ocati㎝uascarried ㎝t匿 狸a屡P監icatiollof50μ40f1瓢ovalb咀 ■inontheuni旦ater&1anteriornaPis. Antise買. 駐for■. 陀駐su1㎜tofse㎜antibodyleve且s騨ereoolloetdfm■actively. sellsitizo己9購i㎜pigs2(bys」R⊃11㎝i㎎ G20rIgE量evelinthesero■ofindiv蓋{halguineapiguereesti■. 囮easu㎜tofnasalseeretion.Thelg. or7-dbyho■o且o酬5PCへtiter,respeetively.[htarqp8es㎝tthe■eanvaloe5± S.駐... 一19一. 励tedby4一. ㎞.
(25) 4.能. 動 感 作 モ ル モ ッ トに お け る 鼻 汁 過 分 泌 反 応 と 鼻 粘 膜muscarinicκh レセ プ タ ー 量 の 関 連 性. 鼻 汁 分 泌 反 応 を 誘 発 す るMCh閾. 値 あ る い はMCh誘. 性 を検 討 した.い ず れ に も直線 性 が 得 られ,鵬h閾 量 と相 関性 を示 す ことが 認 め られ た(FIG.14).な. 発 鼻 汁 分 泌 量 と鼻 粘 膜rACh・R量. の関 連. 値 あ るいは誘 発 鼻 汁分 泌 量 は鼻 粘 膜m鴫Ch・R お図 には示 して い な いが ・KD値. と・㎜h閾 値 あ. るい は鼻 汁 分 泌量 の間 に はほ とん ど相 関性 は見 られ な か った. また 抗原 誘発 鼻 汁 分 泌量 と鼻 粘 膜rACh・R量. の 間 に も明 らか な 直線 性 が 得 られ,相 関 性 が鋸 め. られた(FIG。15).. FI{L14.晩1ationshipbetu㎝nasal聴rseeretioniodb囲by■ethaφplineand thedαEity・f瓢scarinic為. αげ ㏄ 〔 りt・rsin離ineapigs麗tivelysα. ova直b㎝ ■in.調hsal㎜salreactivityandse㎝. 遮it・ 刎. 騨lth. 匿itivity冊re■easuredbyapPIy1㎎. 1雛 惑諾鵯 窒i論n器識e譜認羅 醒綴 器。 曾島u謡 離 島s器i謎u塾 nasalsec1℃tion.Activelys㎝6itizdg瞳ineapigsfor■. 髄so】 ㎜tof■. AChr㏄qptorsueresacrifieed20r3daysfolloui㎎ ㎜11℃getivityan4segsitivity・. 凪scarinic. 塵easure■entofnasa1. 一20一.
(26) 書V考. 察. 一 般 に鼻 ア レルギ ーは鼻粘 膜上 皮 に存 在 す る肥 満 細 胞 表面 にお け るTypeIの であ り,こ の 反 応 に お い てIgEが. ア レル ギ ー反 応. 重要 な 役 割 を果 た す と考 え られ て い る1 2).一 方,鼻. ア レル. ギ ー患者 の 鼻粘 膜 では非 特異 的 過 敏性 や過 反 応 の出現 す るこ とが経 験 的 に 知 られ て お り8-12・鋤, これ らの症 状 の 出現 に は鼻 粘 膜 に お け る 自律神 経 系 の ア ンバ ラ ンスが 関 係 してい る可 能 陞 が従 来 よ り考 え られ て きた.最 近 にな り,鼻 ア レル ギ ー 患者 の 鼻粘 膜 に お い てm-ACh・R量. の増 加 と α1・. R及 び β・R量 の 減 少 が認 め られ16 20⊃,鼻 粘 膜過 敏 性 の出 現 や鼻 ア レル ギ ー症 状 の 悪 化 に鼻 粘 膜 自律 神 経 レセ プ タ ー量 の変 動 との 関 連 性 が 示唆 され るよ うに な って きた53》.そ こで本 章 で は, これ らの こ と を考 慮 して,未 だ 明 らか で な い 点 ①. 自律神 経 レセ プ タ ー量 の変 動 の 過 程 や ②. その変 動 が鼻 粘 膜過 敏 性 や鼻 ア レル ギ ー症状 に どの程 度 反 映 してい るか を検 討 した. 最初 に卵 白 アル ブ ミン能 動 感 作 によ る鼻 ア レル ギ ー モル モ ッ トを 用 い て鼻 粘 膜過 敏 性 の 出現 と鼻 粘 膜 自律 神 経 系 機 能 の関連 性 を検 討 した.卵 白ア ル ブ ミンによ る鼻 症 状誘 発 の前 後 に お け るMChに. 一21一.
(27) 対 す る反 応性 と過敏 性 を指 標 に鼻 粘 膜 過敏 性 の出現 の過 程 を検討 した と ころ,抗 原 に よ る鼻 症 状 出 現 後 で は鼻粘 膜過 敏 性 が 見 られ る と と もに,鼻 粘 膜 で のm-ACh・R量. の増 加 と α、・R及 び β・R量. の減 少 を伴 って い た.し か し,卵 白ア ル ブ ミンの感作 の みで は鼻 粘 膜過 敏性 は観 察 され な か った. 典 型 的 な 喘息 症 状 を示 す が,鼻 症 状 を 呈 さ ない 細 菌結 晶性 で はm-ACh・R量. は 変 化 して いな い と報 告 され てい る56}.す. α一a剛lase感 作 モル モ ッ トの鼻 粘 膜 な わ ち,鼻 粘 膜 過 敏性 は単 に感 作 の. 成立 の みで は出 現 しないが,鼻 粘 膜 に お け る抗原 抗体 反 応 によ る鼻症 状 の 出 現 に よ り鼻 粘膜 自律 神 経 レ セ プ タ ー量 の 変 動 を 伴 って 出 現 す る.こ che皿icaI鵬diatorsの. の こ とか ら,抗 原 抗 体 反 応 の 結 果 遊 離 さ れ る. 関与 が重 要 で あ る と考 え られ る.ス ギ や カ モガ ヤ 花 粉 症 な どの季 節 性 鼻 ア. レル ギ ー恵者 の 鼻粘 膜 過敏 性 の程 度 は 花粉 飛 散期 で は非 飛 散期 とは 明 らか に異 な り,鼻 粘膜 過 敏 性 の著 明 な元進 が認 め られ てい る11・5η.今 回 の卵 白 アル ブ ミン能 動感 作 モ ル モ ッ トで は鼻 粘 膜 に抗 原 を 反 復誘 発 す る ことに よ り鼻 粘 膜過 敏 性 が生 じた ことか ら,ヒ. トの鼻 ア レル ギ ー病 態像 に近 い 鼻. 粘 膜 過 敏 性 を伴 った実 験的 鼻 ア レル ギ ー モデ ル であ ると考 え られ た.そ こで,以 後 の実験 で は この 鼻 粘 膜 過 敏性 を伴 う抗 原誘 発後 の 動 物 を用 いて,鼻 粘 膜 過敏 性の 出現 時 に見 られ る鼻汁過 分 泌 反 応 に 関 して,血 清 抗 体 量 あ るい は鼻 粘 膜rACh・R量. との 相 関性 につ い て も種 々の検 討 を行 った.. 血 清抗 体 量 と抗 原誘 発 鼻汁 分 泌量 の 間 に は受 動感 作 動物 で は相 関性 が 認め られ たカ㍉ 能 動 感 作 動 物 で は認 め られ なか った.2種. 類 の感 作 動 物 に おけ る結 果 の相 違 に関 して は今 回 の実 験か らは 説 明. で きな い が,今 回の能 動 感 作 モル モ ッ トのIgG1及 2,000及. び250倍. びIgEレ. ベ ル は個 々 の動 物 に おいて そ れ ぞ れ. 以 上 で あ り,一 ・ 定 レベ ル以 上 の血 清 抗 体 量 で は抗 原 誘 発 鼻 汁 分泌 量 との 間 に. は相 関性 が 見 られ な い のか も しれ な い.ま た この能 動 感作 動 物 の成 績 は鼻 ア レル ギ ー患者 の 鼻症 状 は必 ず し も血清 抗 体量 に相 関 しな い と い う臨床 上 の報告58-6ω と類 似 してい た. 今 野 ら16・18・21・56)は 鼻 ア レル ギ ー様 モ デ ル モル モ ッ ト鼻 粘膜 でm-ACh・R量. の増 加 と α、・R量. の減 少 を認 め,こ れ らが 鼻汁 分泌 や鼻粘 膜腫 脹 を促進 す るの で はな いか と推 測 して い る.ま た レセ プ ター量 と鼻 症 状 の 関連 性 にっ い て の 報告 は ほ とん ど ない.鼻 粘膜 に お け るm-ACh。R及. び他 の レ. セ プ タ ーの局 在性 に関 して は,レ セ ブ ター バイ ンデ ィン グア ッセ イのみ で は 明 らかに で きな いが, 免 疫 組 織学 的 手法 によ り,副 交 感 神経 は主 に鼻腺 周 囲を 支 配 し,交 感 神経 は主 に血 管周 囲を 支 配 す る こ とが 確 認 さ れて い る61-63).そ れ ゆ え,臨 床上 で は 蘭Ch誘 発 によ る鼻 汁 分 泌 は鼻腺 の 反 応 性 を よ く反 映 す る とさ れて お り53),一 方,α 及 び β刺 激 剤 やそ の 拮抗 剤 は鼻 汁 分 泌 には ほ とん ど影 響 を 及 ぼ さ ない と報 告 されて い る51・6ω.そ こで著者 は能 動感 作 モ ルモ ッ トの鼻 汁過 分泌 反 応 が鼻 腺 の 反 応性 の元 進 に よ る もの か どうか を検 討 した.㎜h閾 膜m-ACh・R量. 値 あ るい はMCh誘. 発 鼻 汁分 泌 量 は 鼻粘. との 間 に も,ま た抗 原 誘 発 鼻汁 分 泌量 との 間 に も有 意 な相 関 性 が 認め られ た.こ れ. 一22一.
(28) らの こ とか ら,㏄h閾. 値 あ るい はMCh誘. 発 鼻 汁 分 泌 量 は鼻 ア レルギ ーモデ ル モ ル モ ッ トに お い て. も鼻 腺 の反 応 性 を よ く反 映 す るとと もに 鼻 粘 膜過 敏 状 態 の検討 に も有 用で あ る と考 え られた.ま た 抗 原 誘 発 鼻 汁 分泌 量 と鼻 粘 膜rACh・R量. の 間 に も有 意 な相 関性 が 認 め られ た.. 以 上 の成 績 か ら,卵 白 ア ル ブ ミン能 動 感 作 鼻粘 膜過 敏性 モ ル モ ッ トにお け る鼻 汁 過 分泌 反 応 は鼻 粘 膜m-ACh・R量. の増 加 と密 接 な関係 に あ る こ とが 示 唆 さ れ,鼻 ア レルギ ー に お け る鼻 粘 膜過 敏性. や鼻 粘 膜 過 分 泌反 応 の 出現 の一 因に鼻粘 膜rACh・R量. の増 加 が 考 え られ た.. と ころ で,鼻 ア レル ギ ー 患者 で は く しゃみ あ るい は鼻 汁 分泌 反 応 を誘発 す るHist閾 認 め られ て い る.ま た鼻 ア レルギ ー発症 のtriggerは. 値 の低 下 が. 抗 原 抗 体 反 応 によ り遊 離 さ れ た ヒス タ ミン. によ る知 覚 神 経終 末へ の刺 激 で あ る&21・65,と 一 般 に は考 え られ てお り,鼻 粘 膜 過 敏性 の出現 に は 知 覚神 経 末 端 のhistamineH、 な が ら,H1・Rは. レセ プタ ー(H、 ・Rと 略)の 関 与 も重要 な検 討 課 題 で あ る.し か し. 知覚 神 経 終 末 以外 に も血 管 や鼻 腺,そ の他 組 織 に も多 く存 在 す るた めに,特 異 的. に 知覚 神 経 末 端 のH1・Rの 測 定 は不可能 で あ る.事 実,レ セ プ タ ーバ イ ンデ ィン グア ヅセイ の成 績 で は鼻 ア レル ギ ー凄者 やモ デ ル動 物 のH、 ・R量 は変 動 しない とい う報告2°・52・66)が多 い.最 近 の 免 疫 組 織 学 の 進 歩 に よ り,acetyltransferaseあ. るい はcalcitoningene-relatedpeptide. (CGRP)抗 体 を使 って の 副 交 感 神経 や知 覚 神 経 の分 布及 び神経 密 度 の検 索 が可 能 とな って きて お り, 今後,レ. セプ ターバ イ ンデ ィン グア ッセ イ に加 え て免疫 組織 学 的 検 索 によ り,鼻 粘 膜過 敏 性 に お け. る 自律 神 経 系 及 び知 覚神 経 系 の 役割が さ らに 明 らか に な る と考 え られ る.. V小. 括. 卵 白 アル ブ ミン能 動感 作 モ ル モ ッ トを用 い て,鼻 粘膜 過敏 性 の出 現 と鼻 粘 膜 自律 神経 系機 能 の関 連性,及 1)卵. び鼻 汁過 分泌 反 応 と鼻粘 膜 自律 神 経 レセ プ ターの相 関 性 に つ いて検 討 した.. 白 アル ブ ミン能 動 感 作 モ ルモ ッ トは感 作 の みで は鼻 粘膜 過 敏 性 を示 さ なか ったが,抗 原 誘 発. を 反 復 す る こ とに よ り鼻 粘 膜m-ACh・R量. の増 加,α1・R及. び β・R量 の減 少 を伴 っ た鼻 粘 膜 過. 敏性 モデ ル とな るこ とが 明 らか とな った. 2)こ. の鼻 粘 膜 過 敏性 モデ ル で は,鼻 汁 分 泌 を 誘 発 す るMCh閾. と鼻粘 膜m鴫Ch・R量. 値 あ るい は 團Ch誘 発鼻 汁 分 泌 量. の 間 に は有意 な相 関 性 が 認 め られ た.. 3)抗. 原誘 発鼻 汁 分 泌量 と鼻 粘 膜rACh・R量. の 間に も有 意 な正 の相 関 性 が認 め られ た.. 4)血. 清 抗 体 量 と抗原 誘 発 鼻 汁分 泌量 の 間 に は 明 らか な相 関性 は見 られなか った.. 以上 の 成績 よ り,鼻 粘 膜 過 敏 性 出現 時 の 鼻 汁 過分 泌 反応 と鼻 粘 膜m-ACh。R量 関連 性 の あ るこ とが示 唆 され た.. 一23一. の増 加 に は密 接 な.
(29) 第3章. 反復寒冷暴露(鋸rス. トレス負荷)に よる鼻粘膜過敏性モデル. と薬 物 効 果. 1緒. 言. 前章 で は能 動 感作 に よ る鼻 ア レルギ ー モデ ル動 物 を用 い て,鼻 ア レルギ ー症状 の発 現 に よ り二次 的 に鼻 粘 膜 自律 神経 レセ プ ター量 の変動 及 び鼻 粘膜 過 敏性 が 生 じ る こ と,及 び鼻 粘 膜 過 敏 性出 現 時 に見 ら れ る鼻 汁 過 分泌 反 応 に 鼻 粘 膜rACh・R量. の増 加 が 関 連 して い る こ とを 明 らか に した.一. 方,鼻 ア レルギ ーが 妊娠 を 契 機 と して発 症 あ るい は症 状 の悪 化 す る現 象 は臨 床家 の 中で は古 くか ら 知 られ て お り13-15},ま た 降圧 剤 のreserpineを え る人 も 少 な く な い16,.今 pmgesterone及. びreserpineを. 鼻 粘 膜 で はrACh。R量. 長 期 連用 して い る高 血圧 窓者 の 中 に は鼻 閉 を訴. 野 ら16・21)は こ れ ら の 現 象 を 解 明 す る 目的 でestrogen, 長 期 投 与 した モ ル モ ッ トな らび に 妊 娠 モ ル モ ッ トを用 い,そ の. の増 加 や α1・R量 の減 少 が見 られ た こ とを報 告 して い る.こ の よ うに鼻 ア. レル ギ ー の発 症,症 状 の悪 化 あ るい は鼻 粘 膜 過 敏性 の出 現 に関 して 自律 神経 機能 の変 化 が深 く関与 してい る可 能 性 が考 え られ る. と こ ろ で,反 temperature)ス. 復 寒 冷 ス トレ ス の 一 種 で あ るSART(specificalternationofrhythmin トレス6H°)は. 動 物 の 自律 神 経 系 に おい て 種 々 の機 能 変 化 を引 き起 こす71-79,こ. とが知 られ て い る.ま た この ス トレスを負 荷 され た動 物 で は免疫 学 的 検 討 の結果,抗 体 産生 能 が低 下 して い るの に対 し,皮 膚 の即 時型 ア レル ギ ー反 応 で は過 敏 性 を 示 す こ とが報 告 され てお り8ω, 免疫 ・ア レルギ ー反 応 は 自律 神経 機 能 変化 に よ り大 き く影 響 を受 け る と考 え られ て い る.そ こで本 章 で は前 章 に 引 き続 き,鼻 ア レル ギ ー発 症 及 び鼻 粘 膜 過敏 性 出現 に お け る自律神 経 系 の役割 を さ ら に明 らか にす る 目的 で,SARTス. トレス を モル モ ッ トに負荷 し,そ の鼻 粘 膜過 敏性 を調 べ る とと もに. 鼻 粘膜 過 敏 性 が鼻 ア レルギ ー症状 の発現 にい か な る影響 を及 ぼ すか 検 討 した. 鎮痛 ・抗 ア レルギ ー剤 に 分 類 さ れ るワ ク シニ ア ウイル ス接 種 家 兎炎 症 皮膚 抽出液Neurotropinは 臨床 上,疹 痛 及 び ア レルギ ー疾 患 に使用 され29-31・8H8〕,鼻. ア レル ギ ー に も有 効 性 が 認 め られ て. い るに もかか わ らず,そ の作 用機 序 は十 分 に 解 明 され て い な く,臨 床 経 験上,自 律 神 経 系 を介 した 作 用 で は な い か と推 察 され て きた2°・29-31).ま たNeurotropinはS皿Tス. トレス動 物 に おい て. 観 察 され る種 々の機 能変 化 に 対 して も改善 作 用69・鳳75・78・↑9・89-92,を示 す.こ れ らの臨 床 経験 及 び基 礎 デ ー タか ら,S▲RTス. トレス モル モ ッ トを用 い て 鼻 ア レルギ ーあ るいは 鼻 粘 膜過 敏 性 の発. 現 状態 な らび にそ の病 態 に関 して基 礎的 検 討 を 加 え,次 い でそ の病 態 モデ ルに お け るNeurotropi皿 の効力 検 討 は その作 用様 態 を 明 らか に す る上 に有 用 であ ると考 え られ る。 さ らにS1町. 一24一. ス トレス モ.
(30) ル モ ッ トを 用 い て,抗. ア レ ル ギ ー 剤 と して 汎 用 さ れ て い るketotifen及. な ら び に こ れ ら の 薬 剤 と の 併 用 実 験 を 行 い,Neurotropinの. II実 1.実. びtranilastと. の 比較. 作 用 様 態 に つ い て 検 討 した.. 験材料 ならびに実験方法. 験 動 物 及 び ス トレ ス 負 荷 方 法. 体 重400∼600gのHartley系 70%,12:12の. 雄 性 モ ル モ ッ ト(日 本SLC)を. 購 入 し,室 温24℃,湿. 度45∼. 明 暗 サ イ クル(明 期;午 前8時 ∼ 午 後8時 の 間)に 調 整 した飼 育 室 内 で 固型 飼料. と水 を 自由 に摂 取 させ て5日 間以 上 予備 飼 育 した の ち,健 常 な もの を実 験 に供 した. S岨Tス. トレス の負 荷93)は 特 記 しな い 限 り,モ ル モ ッ トを 毎 日午前10時 か ら午後5時. までの間. は1時 間毎 に24℃ と0℃ の飼育 環境 温度 に交 替 させ,午 後5時 か ら翌 朝 午 前10時 の間 は0℃ の環 境 にお い て,5日. 間 飼育 す る こ とによ り行 った.寒 冷 ス トレス の負荷 は測定 時 を除 き,モ ル モ ッ トを. 常 時0℃ の環 境 下 で飼 育 す る ことに よ り行 った. 2.使. 用 薬 物,放. 射 性標 識 化合 物 及 び試 薬. 薬 物 と してNeurotropin⑪(日 tranilast(Rizaben②,キ. 本 臓 器),ketotifenfu皿arate(Zaditen⑪,サ. ッセ イ 薬 品)及 びatropinesulfate(和. 性 標識 化合 物 と して[3H]0冊,[3田prazosin,[3H]DHA(以 [pyridiny1-5-3H]pyrilamine([3H]pyri1細ineと. ン ド薬 品),. 光 純 薬)を 使 用 した.放 射. 上 は第2章 に記 載 の もの と同 じ)及 び. 略,962kBq/m1,舳ersh細)を. 使 用 した.そ. の 他 試 薬 と して 卵 白 ア ル ブ ミン,MCh,Hist,CMC,phentolamine血ydmchloride,DLpropramlolhydrochloride(以. 上 は第1章 及 び第2章. に記 載 の もの と同 じ)及 びtripmlidine. (Sigm)を 使 用 した. 3.鼻. 汁 分 泌 量 の測 定. 鼻 汁分 泌量 の測 定 は第1章 に 記載 の 方法 に よ り行 った. 4.撫thac㎞. ・line誘 発 に よ る 鼻 汁 分 泌 量 及 び 閾 値 の 測 定. 鵬h誘 発 に よ る鼻 汁 分泌 量 及 び閾 値 の測 定 は第2章 に記 載 の方 法 に よ り行 った. 5.Hist㎝ine誘. 発 によ る閾値 の測 定. Histを 生 理 食 塩 加 リン酸 緩 衝 液 で 溶解 し,1r3,3xlo-3,1r2,3xio-2,1rlg/♂ 類 のHist希. 釈 液 を 調製 した.Hist希. 釈 液10μ姥 低濃 度側 よ り10分 間 隔 で 順次 両側 鼻腔 内 に マ イ. ク ロ ピペ ッ トを用 い て 注入 し,く しゃみ反射 を誘 発 す るHistの 6.粗. の5種. レセ プ タ ー 膜 の 調 製. 粗 レセ プ タ ー膜 の調 製 は 第2章 に記 載 の方 法 に よ り行 った.. 一25一. 最小 濃 度 を 閾値 と した..
(31) 7.レ. セプ ターの定量. レセ プ タ ー の定 量 はIshibeら. の 方 法17・66)を 改 変 して行 った.匪ACh・R,α. H1・Rの 定 量 に は そ れ ぞ れ[3H]Q冊,[3H]prazosin,[3H]DHA及 化合 物 を使 用 した.rACh・R,α1・R及. び[3H]pyrilamineの. 放射性標識. び β・Rの 定 量 は 第2章 に記 載 の方 法 によ り行 った.H、 ・R. の定 量 で は イ ンキ ュベ ー ト条 件 を25℃,30分 の存在 下 で求 め た 以 外 の 操作 は,第2章 8.抗. 、・R,β ・R及 び. 間 と し,非 特 異 的 結 合量 を2x10-6Mtriprolidine. に記 載 のm-ACh・Rの. 定量 と同 様 に して行 った.. 卵 白 ア ル ブ ミ ン血 清 の 作 製. 抗卵 白ア ル ブ ミン血 清 の作製 は第1章 に記 載 の方 法 に よ り行 った。 な お作 製 さ れ た血 清 の4時 間 及 び7日 間homlogousPCAtiterは 9.受. そ れ ぞ れ8,192及. び1,024倍. で あ った.. 動 感 作 に よ る 鼻 ア レル ギ ー症 状 の 誘 発. 抗卵 白 アル ブ ミン血 清2』84を腹 腔 内感 作 し,そ の2日 後 に1%卵. 白ア ル ブ ミン生理 食 塩液50μ4. を左鼻 腔 内 に滴 下 して 鼻 ア レル ギ ー症 状 を誘 発 し,左 鼻 腔 内 の鼻汁 分 泌 量 を測 定 した.S岨Tス. ト. レス モル モ ッ トに対 す る感 作 はス トレス負荷 開始3日 後 に 行 った. 1α 薬 物 の 投 与 方 法 原 則 と してS岨Tス. トレス負 荷前 に 個 々の動 物 のMCh閾. 値 を調 べ,10-2∼3xlrlgん4の. 閾値. を示す もの を実験 に供 し,ま た各群 の 閾値 の平均 値 が 同 程度 に な るよ うに群 編 成 を行 った. 各薬 物 の 投 与量 は遊 離塩 基量 に換 算 して表 示 した.経 口(p.o.)投 与 に使 用 す る薬 物 はα 砺C㎜ に 懸 濁 して 投 与 容 量 を5詔 Atmpineは. ノkgと な る よ うに 調 製 し,鼻 症 状 誘 発 時 の60分 前 に 投 与 した.. 生 理 食 塩 液 に溶 解 して 投 与 容 量 を1認/kgに. 調 製 し,鼻 症 状 誘 発 時 の30分 前 に 皮 下. (s.c.)投 与 した.ま たS畑 丁 ス トレス動 物 へ の連 日投 与 の 場合 には前 述 の投 与方 法 に加 え て,ス トレス 負荷 開始 日よ り1日1回 11.統. 連 日5日 間投 与 を行 った.. 計 処理. 実 験成 績 は平 均 値 ±標 準 誤差 で表 示 し,群 間 の此較 は一 元 配 置分散 分 析 を 行 ったの ち,2群 比 較 に はStudent's重. 一testを,多. 群 間 の比 較 に はDu皿ettの. 間の. 多重 比 較 を使 用 した.い ず れ の場. 合 も危 険率Pく0.05で差 が 認 め られ る場合 に有意 と した.. Ill実 1.SA肝 S岨Tス. 験結 果. ス ト レ ス モ ル モ ッ トの 鼻 粘 膜 過 反 応 性 及 び 過 敏 性 の 検 討 トレス モ ル モ ッ トの鼻粘 膜 過 敏性 を 明 らか に す る目的 で,鼻 粘 膜 の 鵬h閾 値 を経 日的. に調 べ た.SARTス. トレス 群 で は閾 値 は ス トレス負 荷 開始1日. 一26一. 後 よ り低 下 し始 め,3∼5日. 後 には.
(32) 著 明 な(Pく0.01)閾. 値 低 下 が 認 め られた.ま た ス トレス負荷 を5日 間行 った後 中止 して も,そ の7. 日後 に おい て もなお閾 値 の低 下 は見 られ た.一 方,常 時0℃ で飼 育 した寒冷 ス トレス群 で は負荷5 日後 に わず か な閾 値低 下 が見 られたが 有意 な変 化 で は なか った(FIG.16). いり コ m O 91 1 - X. 3 3 3 窪 =2 り⑩ξ o∈ 2 喜 ≧毫 5 ご 。 コ。`帆①主 ↑. 4 0 1. 迂 0 1 ×. 4 0 1. 弓 0 1 ×. 0135 ㌻,翻h㊧. ㍑D、y,∼.ll.wi。. ♂_ati認.f,t,e弱14. F'IG.16.n頃ily{螂intheth置 ℃sboldo『seositivityto■ethadnhneinthe nasal㎜saofgμineapi8ssubjectedto㎜stressorooldstress●Ehdbpoint representsthe凹eanval"esof8gui瞼eapigs.㍉. 牌:si訓fi㎝tlydifferent. fro■nor■a1脚atP〈0.05aodP〈0.01,respeetive置y・. 司い 何刈 3. 害 =2 u2 葛 E ￡ 診 ξ 旧 控 Φご 。コ 。f 。﹂`ト. 司 0 1 ×. 塗 0 1. 3. 辺 0 1 コ. 3.. 0 1 ×. 3. 一 一. 012345. μD、y、. 6. 7. 8. 9. 10. 。f、,,e,.1。 。di.g. FI6.17.0賊nydham騨inthethresholdo『se望1βitivityto■ethad91董neinthe nasal■. ㎜saofgμineapil隅. βsuhjeetedtot冊10呼t{ヨ. stress.Eachpointrepresentsthege駐nva1帆esof89眠ineapigs・ si即ifi㎝tlydiff㎝tfro■oo帽alg脚atP〈0.05剛P《0.01,剛t圃y.. 一27一. 曝翼∋1塾tulre《畑it董onsof㎜ ・,鶴:.
(33) 次 にS岨Tス. トレス負 荷 の温 度条 件 と して24℃ と0℃ で行 って きたが,低 温側 の条 件 と して0℃. が必 要 で あ るか ど うか を検 討 した.た だ し0℃ 以 下 の条件 で は 死 亡例 が見 られ た た め,0℃ で のMCh閾. 値 を比 較検 討 した.0℃. のS駅Tス. 2日 後 よ り有意 に(P<α05∼ α01)低 下 し,5日. トレス群 で は 閾値 は負 荷1日 後 よ り低下 し始 め, 後 で は非 ス トレス群 の約1/10に ま で低 下 した.5. 日以 降 は10日 ま で負 荷 し続 け て も,そ れ以 上 の 変 化 は見 られ ず,5日 た.一 方,4℃. と4℃. 後 と同程度 の値 が 持続 して い. のS択 丁 ス トレス群 で は4日 後 よ り閾値低 下 が 見 られ た ものの,著 明 な低下 に は8. 日間以 上 の 日数が必 要 で あ った(FIG.17). 上 記 の 実 験 成績 に基 づ き,以 後 のS岨Tス の負 荷 期 間 で 行 い,ス. トレス 負荷 は従 来 通 り24℃ と0℃ の温 度 変 化 で5日 間. トレス負 荷 開始 よ り6日 目に 種 々の実 験 を 行 った.. Methac卜o駈ne(91ml》. Condition 3x103 ■. Ψ23×. 、104 o o O o o. NormaI. ● SART。5tre5sed. FI6.18.㎞ctivityandsα S」膿 『-stresse組9鯛ineapigs.Nasa豆. ● ● ○ ●. Thre5卜old. 1q-1. ≡. 墜. (91mり. 3×10・1 盒. O 0 0 0 0. 9.71×10・Z. ●. 蔓3 重3 ●. ●. 1.25x10・2**. ●. 製5iti▼ityto■ethad脚DIine董nthenasa置9㎜aof ■髄cosalregctivityaodsensitivityuere. 囮easu剛byamlyi㎎10幽of2tha伽line諭ich"asusedtodeter8inetbe ㎜t7atiψt剛r幽sem関1s蜘 values±S.E.of189購inegpigs.廓,寧. 寧:signif董. gro明patp〈0.05andPく0.01,㎎tively.. 一28一. ・ 鵬 ㎝tlydifferentf1て. ㏄ 曲. 一 遇no1-亘1.
(34) 次 にS岨Tス 及 びMChに. トレス モル モ ッ トの鼻 粘 膜過 敏 性 を検 討 す る 目的 で,鵬h誘. 発 に よ る鼻 汁分 泌 反 応. 対 す る閾値 を調 べ た.鼻 汁 分 泌 は用 量 依 存的 に認 め られ,各 濃 度 に お け る鼻汁 分 泌量. は ス トレス群 の方 が 非 ス トレス群 に比 べ て有 意 に(Pく α05∼ α01)多 か った.ま たS嬢Tス 群 で は有 意 な(P<0.01)MCh閾. 値 の低 下 が 認 め られ た(FIG.18).. 次 に く しゃみ反 射 を指 標 と してHistに 群 に比 べ て有 意 な(P〈 α01)Hist閾. 対 す る閾値 を調 べ た.s岨Tス. Hi$tamine(9!ml) 1ρ". 3苓104. tocausesnee2ere5po駆. o O. ● ● ●. 1.11x10・2. 0.14×10-2**. ■絶osa1出. ㎜aofS囲RT-. 明pers《 罰siti▼ity1畷 ㎜t劇. 藁∋.Oatarqpfeseotthe■. 亘s■厳≡ 駐s叫redbya藺Plyi㎎ 耐r脚. ㎝valmes±S.E.o『189叫inea ㎜19叫atP《0・01・. ト レ ス モ ル モ ッ トの 鼻 粘 膜 に お け る 自 律 神 経 レ セ プ タ ー. 及 びhista皿ineH1レ. セ プタ ーの変動. トレス モ ルモ ッ トの 鼻粘 膜過 敏 性 の 発 現 が 鼻 粘 膜 自律神 経 レセプ ター及 びH1・Rの 変 動. に 関 連 す るか 否 か を検 討 した.SARTス [3H]qNBの. C C. ● ● ● ● ●. pigs.騨:sig顧ifi㎝tlydifferentfro■. SARTス. o Q O O o. (91ml). 10'11. ・esholdforsensitiv董tytohista■ioeinthenasa1■. stressedg阻inoapigs.Nasa1回 10鱗 伽ioe蜘susedt劇net㎞. 2.SARTス. 3苓10遭. 昏. o. 蔓 至. Threshold. C C. o o. 0. ● ● ● ● ●. り?塗. 3x10・3 璽. 0. NormaI. FI〔L19.T㎞. トレス群 で は非 ス トレス. 値 の低 下 が 認 め られ た(FIG.19).. Condition. SART・5tre弱ed. トレス. 最 大 結 合 数(Bm、. トレス 群 の 鼻 粘 膜 で は非 ス トレス 群 の そ れ と比 較 して. 、)が 有 意 に(P〈0.01)増. しか しなが ら,[3H]pyrilamine,[3H]prazosin及 と の 間 に ほ とん ど差 異 は な く,H1・R,α. 加 し,m-ACh・R量. び[3H]D肌. のBm.、. の 増 加 が 認 め ら れ た.. は非 ス トレス群 の そ れ ら. 、・R及 び β・Rに は量 的 変 化 は認 め られ なか っ た.ま. たK。 値 に は いず れ に おい て も有 意 な差異 は なか った(FIG.20).. 一29一.
(35) 0. α 1●adrenergkβ. 口 FIG.20.Cha咀. ゆadrenergk. ・N・・m・1■. ・SAR予. 勾雪 輝inautom■icnerveandhista回ineHIrα. 』■loosaofS角 」 艀 一stressed[9題ineapigs.Eadboo璽 囮eanvalues±S。E.of70r8帥ineapigs-8:si帥ifi㎝tlydiffer㎝tf期. ・t・e・ ・ed 三qptorsinthenasa1 電 鯛nandlverticalbarrelD㎜tt量. 蟹∋. nor■nlgro咀patp〈06016. 3.SARTス SARTス. ト レ ス モ ル モ ッ トの 鼻 ア レ ル ギ ー 症 状 トレス モル モ ッ トの鼻粘 膜過 敏性 が 鼻 ア レル ギ ー症 状 の 発現 に ど の よ うに関 連 す るか を. 明 らか にす る目的 で,受 動感 作 に よ る鼻 ア レル ギ ー症 状 を く しゃみ と鼻 汁 分 泌 量 を指標 と して調 べ た.2,8及. び32倍 の いず れ の希 釈 抗 血 清 に よ る症 状 発 現 に お い て もス トレス群 の方 に 有 意 に. (P〈0.05)多 い 鼻 汁 分 泌量 が 認 め られ た.く. しゃみ 回 数 は 有 意 で は な い が,増 加 傾 向 が 見 ら れ た. (FIG.21).. 一30一.
(36) 4.SARTス. ト レ ス モ ル モ ッ トの 鼻 粘 膜 過 敏 性 に 対 す る 薬 物 の 効 果. S択 丁 ス トレス モル モ ッ トで は鼻汁 分 泌 反 応 を誘発 す るMCh閾. 値及 び く し ゃみ反 応 を 誘 発 す る. Hist閾 値 の低 下 が見 られ,鼻 粘膜 過敏 性 が 示 唆 さ れた の で,次 に この鼻 粘 膜過 敏 陞 に対 す る薬 物 の改 善 作 用 をMCh閾. 値 及 びHist閾. 値 を指 標 に して検 討 した.. MCh閾 値 低下 に対 して,Neurotropin50及 を 示 し,特 に100㎎/kg/dayで lmg/kg/day及. び100㎎/kg/dayの. は非 ス トレス群 レベ ル に ま で有 意 に改 善 した.一 方,ketotifen. びtranilast300mg/kg/day投. atmpineα5mg/kgの1回. 連 日投与 は用量 依存 的 な改 善作 用. 投 与群 で は,MChに. 与 群 で は そ の 作 用 は 極 め て 弱 か っ た.ま. よ る鼻 汁 分 泌 が 著 明 に抑 制 され,鼻 汁 分 泌 反 応 は. ほ とん ど認 め られ な か った(FIG.22).Ne腫mtropin50及. び100㎎/kg/dayはHist閾. 量 依 存 的 か っ有 意 に(P〈 α05∼ α01)改 善 した.ま たketotifenの 有 意 に(P<α01)改. た. 善 した(FIG.23).. 一31一. 値 低 下 を も用. 連 日投 与 もHist閾. 値低 下 を.
Outline
関連したドキュメント
謝辞 SPPおよび中高生の科学部活動振興プログラムに
このたびは充電式 充電式 インパクトドライバを インパクトドライバ
河野 (1999) では、調査日時、アナウンサーの氏名、性別、•
The results showed that Burow’s solution had larger average zones of inhibition than the other antibacte- rial agents (gentian violet). No difference was found in the
日本フォーマットには現在、トルコの一般的な検体方法である、咽頭ぬぐいと鼻ぬぐいの混合 Combined Throat And Nose
放射能に関する記事も多くあった。 「文部科学省は 20
なお、具体的な事項などにつきましては、技術検討会において引き続き検討してまいりま
【大塚委員長】 ありがとうございます。.
