アガベシロップより分離された耐熱性好酸性菌の性状

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＝調 査＝

アガベシロップより分離された耐熱性好酸性菌の性状

松 永 藤 彦

・島 田 卓 興

_{・稲津早紀子}

Characteristics of Thermo-Acidophilic Bacilli Strain Isolated

from Agave Syrup

Fujihiko M

*

, Takaki S

and Sakiko I

緒 言 アガベシロップはメキシコ原産の甘味料である．竜舌 蘭に高濃度に含まれるイヌリンを加水分解して得た果糖 を濃縮して製造される．アガベシロップはグリセミック 指数（GI値）が低いことから，血糖値を上げにくい甘 味料として一般消費者の間でも認知度が高まっている． また，さまざまな加工食品や飲料でも甘味料として利用 されている3, 11）_{．酸性飲料等の甘味料としてアガベシ} ロップの利用を検討していたA社の依頼により，われ われはアガベシロップの微生物学的安全性を検討した． その過程で一部のアガベシロップが，果汁飲料等の変敗 原因菌として知られる耐熱性好酸性菌8, 10, 12） _{によって汚} 染されていることを見いだした．分離された菌株の遺伝 子解析による迅速同定4） _{を行ったところ，} もしくはその近縁種であることがわ かった．本報告では，アガベシロップから分離した耐熱 性好酸性菌の生育性状および耐熱性を報告する． 材料および方法 本報告の実験では，耐熱性好酸性菌統一検査法10） _に 従ってアガベシロップを検査し分離された菌株の一つで ある， sp. AG1（DDBJアクセッション 番号LC544081）を用いた．アガベシロップから分離さ れた菌株は三つあったが増菌培養後に得られたものだっ たこと，3菌株の16S rRNA遺伝子の配列は に対して同程度の高い相同性を示 したこと，基本性状が類似していたことから上記菌株に 絞って解析を進めた． 1. 生育可能な温度，pH, 水分活性条件の検討 sp. AG1が生育可能な温度条件を調べ るために，YSG平板培地（0.2％酵母エキス，0.1％グル コース，0.2％可溶性デンプン，1.5％寒天，pH3.7）で前 培養を行い，単独コロニーを新しいYSG平板培地に植 え継ぎ，25, 30, 35, 37, 45, 55, 65, 70, 72, 75℃で好気培養 した．最大5日間培養後，単独コロニーが形成された場 合を生育可能と判定した． 72℃と75℃で培養する場合 は酸性・高温条件で寒天の十分な強度を得られないた め，寒天の代わりに0.8％Gelrite（和光純薬工業株式会 社）を用いた．Gelriteの固化には0.1％CaCl2を添加し た．培養には，実験温度域に応じて低温恒温器IN604 （ヤマト科学）または恒温器IN604（ヤマト科学）を用 いた．どちらの恒温器も温度分布精度は±1℃である． 生育可能なpH条件を調べる場合は， YSG液体培地 （0.2％酵母エキス，0.1％グルコース，0.2％可溶性デンプ ン，pH 3.7）を用いた．pH 2.0, 3.0, 4.0, 4.8, 5.9における 生育を調べるにあたっては，希塩酸でYSG液体培地の pHを調整した．pHの測定には温度センサつきpH複合 電 極InLab Expert Pro (METTLER TOLEDO)を 用 い た．YSG液体培地で用意した前培養液をpH調整済み YSG培地に100倍希釈になるよう植え継ぎ，これを恒温 振とう培養機BR-22FH (TAITEC)にて好気条件下55℃ で振とう培養した．培養開始後0, 17, 23, 41時間後にマ クファーランド濁度計DEN-1B（測定範囲0.00 ∼ 15.00 マクファーランド係数； 精度±3％）（ワケンビーテッ ク）で濁度を測定した．植え継ぎ直後に0.10未満だった 濁度が，最大41時間の培養後に0.50以上に増加した場 合を生育可能と判定した． 生育可能な水分活性( w)を調べる場合は，グルコー スを添加し水分活性を調整したYSG液体培地を用意し 日本食品微生物学会雑誌 Jpn. J. Food Microbiol., 38(1), 9‒12, 2021 † _{連絡先 [email protected]} *1 _{〠666‒0026 兵庫県川西市南花屋敷4‒23‒2}

日食微誌 Vol. 38 No. 1 2021 10

た．検討したグルコース濃度は1, 5, 10, 15, 20％である （それぞれ w 0.98, 0.98, 0.97, 0.97, 0.96）．各培地の水分活

性はLab MASTER-aw（測定精度±0.003）(Novasina)を

用いて測定した．培養方法，濁度の測定と生育判定の方 法はpHの生育条件を検討した場合と同様である． 2. グアイアコール産生能の検証 ペルオキシダーゼ法7, 10） _{による sp.} AG1のグアイアコール産生能の検討には，グアイア コール検出キット（極東製薬工業）を用いた．YSG平 板培地で前培養を行い，これを2 mLのVa-YSG培地 （100 ppmバニリン酸加YSG液体培地）に植え継ぎ，好 気条件で45℃, 3時間培養した．陰性コントロールとし て未接種の培地も用意した．培養後に1 mLの50 mMフ タル酸水素カリウム緩衝液，20 µLの1.3％過酸化水素 水，20 µLのペルオキシダーゼ・リン酸緩衝液を添加し 混合のうえ，室温で10分間反応を行った．この時，陽 性コントロールとして純水2 mLに1,050 ppmグアイア コール標準品を100 µL添加したものも用意し，同様に 反応させた．10分後に目視にて呈色の様子を観察し， 陰性コントロール（グアイアコールなし）よりも強い褐 色を呈した場合をグアイアコール産生陽性と判定した． 3. 酸性飲料および酸性調味料への接種試験 接種試験に使用した酸性飲料および酸性調味料は，ス トレートタイプ熱中対策飲料（pH 3.0, w 0.98），濃縮タ イプ熱中対策飲料（pH 2.5, w 0.91），濃縮タイプ生姜飲 料(pH 3.8, w 0.94), 濃縮タイプ黒酢入り飲料（pH 3.4, w 0.89），濃縮タイプ青じそ飲料（pH 3.3, w 0.94），ゆ ず果汁調味料（pH 2.4, w 0.97）である．どの検体も希 釈せずに使用した． はじめに sp. AG1の前培養液をYSG 液体培地で用意した．これをYSG液体培地で適宜希釈 したのち，試験管に入れた酸性飲料あるいは酸性調味料 に対して，終濃度103_{/mLになるよう接種した．芽胞を} 用いる場合は芽胞懸濁液を終濃度103_{/mLになるよう接} 種した．コントロールとして未接種の検体も用意した． これを好気条件下，65℃で5日間静置した．製品液中で 増殖したかどうかは，目視観察による外観の濁りの有無 と，製品液中の細胞濃度が上昇しているかどうかで判断 し た． 細 胞 濃 度 の 計 測 に は， 位 相 差 顕 微 鏡 BX51(Olympus)とバクテリアカウンター（サンリード 硝子）を用いた．濃縮タイプ生姜飲料の場合は原材料に 由来する濁りがあり，目視や顕微鏡観察では増殖の有無 を判断できなかったため，YSG平板培地を用い生菌数 検査を行った． 4. 芽胞の調製方法と 値の測定方法 直径90 mmのシャーレに作成したYSG平板培地の表 面に，1％MnSO4を20 µL滴下し塗り広げ，そこに sp. AG1を塗抹した．これを好気条件下 55℃で5日間培養し芽胞形成させた．培養後の平板培地 上 にPBSを 滴 下 し 芽 胞 を け ん 濁・ 回 収 し，1,940×g, 20℃, 15分間の遠心分離を行った．上清を捨て，沈殿し た芽胞をPBSに再懸濁し，2 mmの滅菌ガラスビーズ （相 互 理 化 学 硝 子）を 等 量 加 え てVORTEX-GENIE 2 (Scientific Industries)で10分間撹拌処理した．撹拌後， Microson XL (Misonix)を 用 い て 出 力8W, 周 波 数 22.5 kHzで5分間（インターバル30秒間）の超音波処理 を行った．芽胞懸濁液を新しい遠心チューブに移し，遠

心分離機himac CR22GII (HITACHI)を用いた遠心分離

（1,940× , 20℃, 15分間）と沈殿した芽胞のPBS中での 再懸濁を2回繰り返すことで芽胞を洗浄した．最後に， 芽胞懸濁液を70℃で20分間加熱処理した．

値 の 測 定 は 以 下 の よ う に 行 っ た． ま ず105_∼

106 _{CFU/mLになるようにPBSで調整した芽胞けん濁液}

を用意し，Thermal death time (TDT) 試験管（内径

5 mm, 外径7 mm, 長さ105 mm； コスモスビード）に 0.5 mLずつ分注し，バーナーで溶封した．そして，精 密高温油槽オイレックスEHT-25（使用温度範囲室温＋ 10∼200℃, 温度調節精度±0.05℃； 東洋製作所）で芽胞 を溶封したTDT試験管を加熱した．加熱条件は，110℃ で2.5∼12.5分間である．加熱後に内部の芽胞懸濁液を 取り出し，PBSで適宜希釈を行ってからYSG平板培地 を用いて生菌数を測定した（好気条件下55℃, 2日間培 養）．得られた生菌数を基にした加熱生残曲線から 値 を算出した． 結 果 1.  sp. AG1が 生 育 可 能 な 温 度， pH, 水分活性の範囲 アガベシロップから分離された sp. AG1が生育可能な温度範囲，pHの範囲，そして水分活 性( w)を検討した結果，生育温度は37∼72℃, pHは3.0 ∼4.8, wは0.97以上であった．また，旺盛な増殖が見 られたのは，55∼65℃, pH 3.7の条件であった． 2. ペルオキシダーゼ法によるグアイアコール産生能 の検証 は薬品臭のするグアイ アコールを産生し果汁ジュース等で変敗を起こすことが 知られている8, 10, 12）_{．そこで， sp. AG1} が増殖する際にバニリン酸を代謝してグアイアコールを 産生するかどうかペルオキシダーゼ法を用いて検証した ところ，グアイアコール産生は認められなかった． 3. 酸性飲料および酸性調味料への接種試験 今回の調査の発端となったアガベシロップは，酸性飲 料等の甘味料として利用することが検討されていた．そ こで， sp. AG1が酸性飲料や酸性調味料 中で増殖するかどうかを明らかにするため，6種の製品 に対して栄養細胞の接種試験を行った． sp. AG1の栄養細胞を接種して好気条件で5日間静置し たところ，六つの検体のうちストレートタイプ熱中対策 飲料において接種菌株が増殖し，製品液が混濁した．そ

11 の他の飲料や調味料においてこの菌株は増殖しなかった （表1）． sp. AG1の栄養細胞がストレートタイ プ熱中対策飲料中で増殖したので，この飲料中で芽胞が 発芽可能かを検討した．ストレートタイプ熱中対策飲料 に sp. AG1の芽胞を接種し好気条件で5 日間静置したところ，栄養細胞の場合と同様に接種菌株 の増殖と製品液の混濁が観察された（表1）． 4. 芽胞の耐熱性 sp. AG1は芽胞を形成したため，芽胞 の耐熱性を測定した．芽胞のPBS懸濁液を110℃で加熱 し，加熱生残曲線から 値を求めたところ， 110=4.9± 0.3分（平均値±標準誤差； =4）であった． 考 察 本 報 告における接 種実 験から， sp. AG1はストレートタイプ熱中対策飲料（pH 3.0, w 0.98） 中で生育可能なことがわかった（表1）．薬品臭のオフ フレーバー変敗を引き起こすグアイアコール産生は認め られなかったものの，増殖に伴い製品液の混濁がみられ ため変敗クレームの要因となることが予想される．ここ で用いたストレートタイプ熱中対策飲料のpHと wは， sp. AG1が生育可能な条件（pH 3.0∼ 4.8, w 0.97以上）を満たしていた（表1, 図1）．これに 対して，接種実験で増殖しなかった酸性飲料・調味料の pHと wは， sp. AG1の生育に適さない 条件であった（表1, 図1）．したがって，アガベシロッ プを用いた製品の変敗リスクを推定するに当たり，製品 のpHと wの測定が有用であることが示された．ただ し， やその近縁種の増殖 には浸透圧，果汁，アスコルビン酸，ポリフェノールが 複合的に関与すると報告されている6）_{．製品を設計する} 上ではこれらの要素も加味して 属の増 殖性を評価していく必要がある． PBSに懸濁した sp. AG1芽胞の耐熱 性は 110=4.9±0.3分であった．したがって，この芽胞の 殺菌条件を5Dまたは6Dに設定するならば，それぞれ 110℃で約25分間以上または約30分間相当以上が必要で ある．酸性飲料の殺菌工程は，一般に低温殺菌が採用さ れることが多い．清涼飲料水の製造基準では，pHが4.0 ∼4.6の場合は85℃で30分間相当以上の殺菌条件，pH が4.0未満のものは65℃で10分間相当以上の殺菌条件が 求められている．本研究で分離された sp. AG1の芽胞が酸性飲料を汚染した場合は，これらの 最低加熱殺菌条件では殺菌不足となることがわかった． 一般に，芽胞を形成させる培地や，芽胞を加熱する際の けん濁液の成分とpHが芽胞の耐熱性に影響することが 知られている．本報告における耐熱性調査は中性緩衝液 を用いた基礎データの一つと捉え，実用上の加熱殺菌条 件を検討するにあたっては，製品液中にけん濁した芽胞 表1. 酸性飲料および酸性調味料への接種試験 検体 pH w 外観変化 （濁り）1） 細胞濃度 _(/mL)2） 増殖の有無3） ストレートタイプ熱中対策飲料 3.0 0.98 あり 2.2×108 _＋ ストレートタイプ熱中対策飲料（芽胞接種） 3.0 0.98 あり 8.7×107 _＋ 濃縮タイプ熱中対策飲料 2.5 0.91 なし ND ̶ 濃縮タイプ生姜飲料 3.8 0.94 ND ̶ 濃縮タイプ黒酢入り飲料 3.4 0.89 なし ND ̶ 濃縮タイプ青じそ飲料 3.3 0.94 なし ND ̶ ゆず果汁調味料 2.4 0.97 なし ND ̶ 1）_{検体に菌体を接種後65℃で5日間静置培養した後の外観の変化（濁りの有無）を示した．濃縮タイプ生姜飲料はもともと原材} 料に由来する濁りがあるため結果を判別できず，空欄とした． 2）_{静置培養した後の顕微鏡とバクテリアカウンターによる観察結果を示した．細胞が確認できなかった場合はND (Not Detected)} と表示した．濃縮タイプ生姜飲料は生菌数検査の結果を示した． 3）_{外観変化と細胞濃度の結果をもとに，検体中で増殖を認めた場合は＋, 認められなかった場合は−と示した．} 図1. 接種実験で用いた飲料・調味料のpH, wと sp. AG1の生育条件との関係 sp. AG1が増殖可能なpHと wの下限を破線 で示した

日食微誌 Vol. 38 No. 1 2021 12 を加熱するアプローチをとることも重要である． これまでの報告でも，酸性飲料で品質劣化を起こさず に 属の芽胞を加熱殺菌することは難し いとされている8, 12）_{．そこで，製品に添加する前のアガ} ベシロップを殺菌することも考えられる．アガベシロッ プを121℃で15分間加熱し成分分析を行った研究では， 糖類の成分構成が加熱により変化することが明らかと なっている5）_{．また，糖類の褐変が進むことも予想され} る．これらの理由からアガベシロップの加熱処理は利用 者に好まれない可能性があり，アガベシロップの特性を 活かすには非加熱殺菌が望まれる．アガベシロップの紫 外線処理によって一般生菌や真菌に対する一定の殺菌効 果が得られたとの報告があるが，芽胞に対する効果は不 明である9）_{．蜂蜜では限外ろ過処理による芽胞の除菌技} 術が開発されており2）_{，アガベシロップへの応用が期待} される． やその近縁種は，酸性 飲料の原材料や製造環境から分離されており，酸性飲料 を製造する際に潜在的なリスクとなっていることが示さ れている6）_{．本報告で用いた sp. AG1は} アガベシロップ( w 0.66)中で，休眠芽胞として存在し ていたと思われる．この菌株の芽胞はストレートタイプ 熱中対策飲料で発芽・増殖可能であった．したがって， sp. AG1の芽胞がアガベシロップを介し て製品を汚染し加熱殺菌をかいくぐった場合，製品の pHや w等の条件が発芽・増殖に適していれば変敗につ ながるリスクがある．他方で，休眠状態の芽胞が存在し ても製品の成分や流通温度が発芽・増殖に適さない条件 であれば休眠状態のままで，いわゆる商業的無菌状態を 保てると考えられる．アガベシロップを甘味料として包 装食品に利用した製品は種々市場に出回っており，その 中には清涼飲料水も含まれる．本報告で明らかになった ように，アガベシロップを利用する際は耐熱性好酸性菌 による変敗リスクを考慮した製品設計や，製造環境の衛 生管理，殺菌方法や流通条件等を総合的に考慮すること が必要である1, 6, 8, 12）_． 文献

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