物性,化学的特性および生理活性からみたブラジル産プロポリスの評価

ミツバ チ科 学

21

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物性,化学的特性および生理活性か らみた

ブ ラジル産 プ ロポ リスの評価

Y.

K.Par

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M.Al

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,F.

F.Mour

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プ ロポ リスはセイ ヨウ ミツパテによって様 々 な植物 か ら集 め られ る樹 脂状物 質 の総称 で あ る.プ ロポ リスは強 い粘着性を持 った樹脂状物 質で, ミツバチはこれを用 いて巣箱内の隙間を 塞 ぎ,内壁 を滑 らかに し,外敵が侵入す る巣門 を守 ろ. ミツバチは樹木 の樹皮の亀裂や葉の芽 か ら樹脂 を集 める. この樹脂 は ミツパテが岨噂 す ることによって唾液が加 わ り,部分的に消化 された原料 は蜂 ろうと混合 され巣内で用 い られ る

(

Ghi

s

al

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,1

979).

プ ロポ リスは樹木由 来 で, これ まで疹 出物 を出すの は温帯 原産 の 様 々なポプラ類 とされて きたが, これではポプ ラが存在 しない熱帯地域 でなぜ ミツバチがプ ロ ポ リスを生産で きるのかを説明す ることがで き ない.

J

ohns

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l.

(1

994)

はオ-イオ州の 巣か ら集 め られたプロポ リスは ジョー ジア州南 部の ものより化学的に多様であることを発表 し た.同様 に

Rudz

kiandGr

z

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1

983)

はワ ル シャワ地域か ら集め られたプロポ リスに互 い に少 な くとも若干のちが いがあることを見つ け た.プ ロポ リスのチ ンキか ら分離 される化合物 の中で最 も大 きなグループはフラボノイ ド色素 である. フラボノイ ドは植物界 に広範囲 に分布 し, ミツバチがプロポ リス原料 を集 める植物 に 含 まれるフラボノイ ド類 が当然のよ うにプロポ リスか ら分離 され ることになる. このよ うにプ ロポ リス中の化学物質組成 は植生 によって異 な る. そこで,私 たちはアフ リカ蜂化 ミツバチが ブラジルの南部,南莱部,中央部,西部,北東 部 で採集 した

400

余 りのプ ロポ リスを入手 し た.各サ ンプルをェクノールで抽出 し, エタノ ール抽出液

(

EEP

と略す)を物理化学的な方法 で分析, さ らに生物的活性を評価 した.

材料および方法

プ ロポ リスのエタノール抽出液

(

EEP)

の準 備乾燥 したプ ロポ リスを粉 砕 し,各 サ ンプル

(

2g)

を

80%

ェクノール水溶液

(

25m

L)に溶 解

,70

℃で

30

分振塗 した.抽 出後,遠心分離 を して上清 を取 り, これ を エ タノール抽 出液

(

EEP)

とした.

U

V分光光度計 による

EEP

の吸収 スペ ク トル の測定 プ ロポ リス抽出液の紫外部吸収スペク トルの 測定 には

,25F

L

L

の

EEP

と

30mL

の

96%

ェタ ノールを混合 した ものを用 いた. この混合液 に つ いて紫外部 分光 光 度 計 によ って

200-600

nm

の波長範囲の吸収を得た.

EEP

の逆 相 高性 能 薄 層 ク ロマ トグ ラ フ ィー

(

Rp-HPTLC)

Rp-HPTLC

には シ リカゲ

ル RPF2

5

･

Z

S

プ レ ー ト

(

Me

r

ck)

を用 いた.

EEP3〟L

をスポ ッ ト し,展開溶媒 はエタノール :水

(

55:

45)

を用 いた. フラボノイ ド類 は紫外線

366nm

照射下

で検 出 した. プ ロポ リス抽出液の逆相高速液体 クロマ トグラ フィー

(

Rp-HPLC)

フ ラ ボ ノ イ ド頬 の 定 量 分 析 に は

YMC

PACK ODS-

A

カラムを用 いて行 った.移動相 は酢酸 :メタノール :水

(

5:

75:

65)

, 流速 は

1mL/mi

n

,検 出 はダイオー ドア レイ検出器で 行 った. ク ロマ トグ ラムは

254nm

で記 録 し た.

EEP

中の フラボノイ ド類 の定量 には標準

品 (ExtrasynthesA.A.社製) を使用 した.

抗酸化活性の測定

抗酸化 活性 は βカ ロチ ンの酸化 結合 と リノ ール酸 の測定 (Hammerschmidtand Pratt,

1978;Pratt and Paula,1979;Pratt and Watts,1964;Parkandlkegaki,1998)によ

って定量 した.60mgの リノール酸,200mgの Tween40,5mgの βカ ロチ ンを5mLの クロロ ホル ムに溶解 し,50oCの ロ-タ リーエバ ポ レー ターで濃縮 した. クロロホルム除去後,残留物 に酸素添加脱 イオ ン水50mLを加 えて強振宣 下 で溶解 した.得 られ た5mLの懸濁 液 を0.5 mLのEEPサ ンプルを含 ん だ試 験 管 に移 し, 470nmでの吸収 を分光光度計 です ぐ読 み とっ た.酸化反応 を進 め るため試験 管 を40℃ に加 温 し,その後60分間隔で吸光度 を読 み とった. 病原性細菌 に対す る抗菌活性 ブロス培地 で活発 に成長 して いる黄色 ブ ドウ 球菌 と連鎖球菌 を, ブロス培地 に浸漬 した滅菌 綿棒 で寒天培地 に移植 した.移植 した培養皿 に はEEPを含 ませ たデ ィス クをお き,37℃ で一 晩培養 した.EEPデ ィスクは滅紙 (Whatman No.3 (￠5×1mm))をプ ロポ リス抽 出液中 に 浸潰 し,室温で一晩中低真空下 で乾燥 させ, さ らに60℃ に4時間放置 して作製 した (Blairet a1.,19??;Parketa1.,1998). EEPによる ヒアル ロニクーゼ活性 の抑制 ヒア ル ロニ ダー ゼ活 性 の抑 制 はPark and lkegaki(1998),Aronson etal.(1967),Rei -ssig etal.(1955)に したが って測定 した. 各 EPP50iLLと,0.5mLの ヒアル ロ ン酸 カ リウ ム 溶 液 (0.6mgをpH3.6の0.1M酢 酸 緩 衝 液 ･0.15M塩化 ナ トリウム溶液 に溶解 して あ る もの), ヒアル ロニ ダーゼ (タイプ

Ⅳ-S:

午 精巣 由来 品,Sigma社)を350ユニ ッ ト含んで い る同 じ緩衝液50pL)の混合液 を37℃で40 分 培 養 した.培 養 後0.8Mカ リウ ム ホ ウ酸 塩 0.1mLを加 え,3分煮沸 し,さ らに3mLの p-ジメチ ル ア ミノベ ンズ ア ル デ ヒ ドを加 え た. 37℃ で20分反応 させ た後,すべて試験 管 は水 を対照区 と して585nmで吸光度 を測定 した. 細胞毒性の分析 実 験 下 で細 胞 毒 性 の分 析 はRubinstein et al.(1990)の方法 に したが った.20pg/mLで のEEPの細胞毒性 はマイ クロタイ タープ レー ト上 の ヒ ト腫癌培養細胞株 (HTCL)のスルホ ロー ダ ミンB染色 で調 べ,反応終点 で の562 nmの吸収 を測定 した. 培養細胞株 には以下 の よ うな ものが使 われた.KB(鼻咽頭の癌腫), HCT-8(回 盲 の 腺 腫 :ATCC CCL244), MCF-7(乳房腺腫 :ATCCHTB22)とCAKL 1(腎臓腺腫 :HTB46).細胞毒性試験 で は抗 ガ ン剤 のエ トポ シ ド(VP-16)を細胞毒性測定 の 陽性対照 と して使 った. この試験 はアメ リカの

ChapelHillに あ るNorth Carolina大 学 の

Bastow博士 によ って行 われた. ヒ ト免疫不全症 ウイルス (HIV)に対す る増殖 抑制の分析 抗HIV活性 の試験 はChenetal.(1996)に したが って行 った.サ ンプルはまずDMSO(ジ メチルスルホキ シ ド) に溶解 した. サ ンプルの 調 整 中 に,T細 胞 株HSlの一 定 量 をHIV-1 (ⅠⅠIB分離)に感染 させ,一方 を培養培地 で偽感 染 させた.偽感染 した方 は毒性 を判定す るため に使 われた.使用 した ウイルスの系統 は標準 で 104感 染 ユ ニ ット/mLのTCID 50値 を示 す. さ らに,AZTにつ いて も陽性対 照 と して各実 験 で分析 した. この実験 はアメ リカ, メ リー ラ ン ド州 のBiotech Research Laboratoryの MarkCosentino博士 によ って行われた.

結果および考察

エ タノール抽出のプ ロポ リスの分析 400のプ ロポ リスのサ ンプルは抽 出物 の視認 (色),紫外部分光光度計 (紫外部吸収 スペク ト ルのパ ター ン),逆相薄層 クロマ トグ ラフ ィー によ って分析 され,表 1,および図1,2に示す よ うに,12の グループに分類 された.この うち

蓑 1 ブラ ジル産 プ ロポ リスの グループ分 け グループ (代表 サ ンプル) EEPの特徴 色彩 可 溶分 (%) 産地 (州名) 1 BGl 黄色 2 RSl 淡褐色 3 PR7 濃褐色 4 PR8 淡褐色 5 PR9 緑褐色 6 BAll 赤褐色 7 BA51 線褐色 8 PE5 濃褐色 9 PE3 黄色 10 CE3 濃褐色 11 PIl 黄色 12 SP12 緑色∼緑褐色 63.0 南部 バ ジェ (リオ ･グラ ンデ ･ド･スール) 57.5 南部 (リオ ･グラ ンデ ･ド･ス-ル) 65.0 南部 (パ ラナー) 54.5 南部 (パ ラナー) 58.7 南部 (パ ラナー) 45.9 北東部 (バ ーイ7) 43.8 北東部 (バーイ ア) 41.3 北東部 (ベルナ ンプッコ) 46.7 北東部 (ベルナ ンプ ッコ) 24.1 北東部 (セア ラ) 231 北東部 (ビアウイー) 61.0 南西部 (サ ンパ ウロ) n ixiji i i i iiR (ltJl)ZlllI ZパLl1Elt) ｣.Lll _qヱtI (ItM lll】 入278tlnl tこH 6OUZut)ZttLI 3bU JJU 52L16OU 2NtJ 361JJJU5ZU6ULIZLIひ 28LI36L)JJL152tJ 波長(llm) 図 1 ブラ ジル産 プ ロポ リス (EEP)の紫外部吸収 スペ ク トルのパ ター ン 1 2

3

4 5 6 7

8

9 10 1

1

12 図2 Rp-HPTLCによる成分展開 パ ター ン 第6グループ (G6)は BAllであ るが, フラボ ノイ ド化合物 が ほとん ど含 まれて いな いのがわか る

表2 EEPによる抗微生物活性 阻止円直径(mm) 黄色ブドウ球菌 連鎖球菌 BGI RSl m m m BA1l 慧 m 諾 m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 日 12 性 跡 . 0 . 0 0 . 0 . 0 0 跡 跡 跡 . 0 陰 痕 2 1 3 6 6 2 . 痕 痕 痕 3 跡 性 8 跡 跡 0 5 . 0 性 性 性 o 痕 陰 2 . 痕 痕 9 . 0 1 陰 陰 陰 L 5つの グループは ブラジル南部産 で あ り, 6つ の グループのプ ロポ リスは ブラジル北東部産 の ものである (表 1).表 中のサ ンプル名 は採集地 とサ ンプル番号 で示 してある.また別 の1グル ープが ブラジル南西部 の ものであ る. これ らの 結果 はブラジル南部 と北東部 か らのプ ロポ リス は異 な っていることを示 す. プ ロポ リスの多様 性 は植生 によるが, まれに例外的なプ ロポ リス が地位置 とは無関係 に見っか る.今回 はこのよ うな例 外 的 なプ ロポ リス は含 めて扱 わ なか っ た. エタノール可溶成分 につ いて も地理的 な差 異が反映 されて いる. グループ10, 11を除 く す べての グル ープ は41.3%か ら63%の エ タノ ール可溶成分 を含 むが, ブル -プ10とグルー プ

1

1は それ ぞ れ24.1%と23.1%とい うよ う にエタノール可溶画分が非常 に少 なか った. エタ ノール抽 出プ ロポ リスの抗菌活性 全 プ ロポ リスグループの抗菌活性 は病原性黄 色 ブ ドウ球 菌 と連鎖球 菌変 異株 で確 か め られ た. この結果 を表2に示す. グループ 1のプ ロ ポ リスは黄 色 ブ ドウ球菌 の成長 を抑制 しなか っ た. グル ープ 2, 9,10, 11はわずか に抑制 を 示 し,グループ3, 4, 5, 8, 12が中程度 の, グループ

6

,7

は強度 の生長抑制効果 を示 した. グル ープ6の プ ロポ リス は連 鎖球 菌 に対 して も強 い抗菌活性 を示 したが,グループ 1

,4,5

, 7, 8, 12の活性 は最小 であ った. loo (%) 80 60 -10 20 一oo 80 60 40 20

1

2 3

1

0

1 2 3 経過時間 (h) 図3 ブラジル産プロポリスの抗酸化活性 A ▲■Gl(BGl),▲G2(RSl),OG3(PR7),

*

C4(PR8),●G5(PR9),+G6(BAll),◆対牌区

ち :△G7(BA51)

,

×G8(PE5),▲G9(PE3),■G10(CE 3),□Gll(PIl),●G12(SP12),◆対将区 蓑 3 抗炎症活性 ヒアルロニダーゼ 活性阻止率 (%) BGI R-l m m m BA1l 笠 間 諾 m I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 . 1 8 9 . 1 4 8 6 8 6 . 1 4 3 6 L 7 7 6 0 8 0 0 0 2 8 1 1 3 1 3 4 4 4 1 2 3 抗酸化 と抗炎症性活性 抗酸化活性 の結果 を図

3

に示 した.グループ 9, 10を除 くすべて の グル ープが80%以上 の

表4 ヒト腫療培養細胞株に対する細胞毒性 20FLg/mLで阻止された細胞株の割合 良咽頭癌腫 回盲腺腫 腎臓腺腫 乳房腺腫 1 BGl 1 RSl 1 PR7 1 PR8 1 PR9 2 BA11 2 BA51 6 PE5 6 PE3 7 CE3 8 PIl 10 SP12 VP-16* 8 0 3 0 4 5 4 8 5 7 3 7 0 6 5 5 5 1 7 3 8 8 9 4 3 9 9 8 5 7 9 2 9 9 7 5 1 2 6 1 4 4 4 3 3 7 7 9 3 2 4 1 - 1-8 1-馳 7-74 94 1-25 査 査 査 検 -7 -1 -3 18 棚 糊 -7 -0 -6 43 -1 4 未 *制癌剤 (Etoposide),2/Jg/mLでの活性 抗酸化活性, グループ10は80%以下 の活性 を 示 した.グループ

9

は抗酸化剤 と して作用 しな か った.抗炎症性 につ いて は,グループ

3,5

, 6,7,8,12のプ ロポ リスが グループ1,2,4, 9,10,11と比較 して活性が高か った ことが証 明 された (表3). 細胞毒性 の分析 材料 および方法で述べ たプ ロポ リスの粗抽 出 物 は表4に示 したEEPを除 いて培養細胞株試 験 で は一般 に細胞毒性が弱 いか, あるいはま っ た くな い ことが示 され た.表4にあ げたEEP は成長 の速 いがん細胞 株 の成長 を抑 制率 14-97%の範囲で抑制 して いた.抗 がん剤 のエ トポ シ ド (VP-16)はこれ らと比較す ると約 10倍 も低 い濃度 (2pg/mL)で同様 の細胞株 に対 し て活性 を示 した. しか しなが ら細胞毒性 のスペ ク トル はEEPの もの とは異 な り, プ ロポ リス は新 しい種類 の細胞毒性活性 に富んでいるとも いえ る.今後,分画 や単離 した成分での研究が 望 まれ る.グループ 1,2,7,6は興味深 い結果 で あ った. それ らは50%あ るい はそれ以上 の 高 い抑制効果 をKB細胞 (鼻咽頭の癌腫) に対 して示 した. さ らに グル ープ7と6もHCT-8 (回盲 の腺腫),CAKI-1(腎臓 の癌腫),MCF-7 (胸部 の腺腫)腫蕩培 養細胞株 に も高 い活性 が ある.最終 的 に細胞毒性活性 の見 られたすべて のプ ロポ リスサ ンプル は産地別 グループで比較 検討 を行 った.グループ6と 7か らのプ ロポ リ スは4種 の腫癌細胞 に高 い活性があ ったか (義 4), HPTLCのパ ター ンはまった く異 な ってい た . 表5 抗 HIV活性 グループ IC5｡bg/mL) EC50bg/mL) 治療指数(TI) 1 RS5 5.95 2 PR9 17.9 3 PR9 18.8 3 3 3 2 8 5 1 2 2 3 2 2 8 3 4 4 6 7 IC50 :50%阻害濃度-偽感染H9細胞に較べて50%の細胞毒性が見られた試料破産 EC吉O :50%抑制値-HIVの増殖を50%抑制 した試料濃度 治療指数TIが5.0を超えたものについて再試験を行 った.

90 抗HIVの分析 い くつか選抜 したEEPのサ ンプル につ いて 実 験 下 でH9リンパ球 の中で のHIV複製 に対 す る抑制効果 を調 べた.結果 は表5の通 りであ る.EEPサ ンプルの中で,グループ 1と5に含 まれ るプ ロポ リスでEC50値 が それぞれ2.83, 2.53,1.23JJg/mLで抗HIV活性 を示 し, 治療 指標 (TI) は6.32, 7.42, 4.83であ った. 抗 HIV活性 はいず れ もグル ープ

1

と5に属 し, ま た活性 の強 さは グル ープ1にお いて グル ー プ5よ りもやや高 い といえ る. これ はプ ロポ リ スが選択 的 な抗HIV活性 を示 す ことを報告 し た最初 の実験 データであ る. さ らに精製 の上, 有効成分 の同定が望 まれ る. (著者の住所 は下記参照) (翻訳 笠原 凝美) 引用文献

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YoNG KuN PARK,MASAHARU IKEGAKl,SEVERINO MATIASDEALENCAR and FABIANA FoNSECA DE MouRA.Evaluation of Brazllian propolis by both physicochemicalmethods and biological activity.HoneybeeScience(2000)21(2):85190. BiochemistryLaboratory,CollegeofFoodEngi -neering, State University of Campinas,

Campinas,SP,Brazll.

We have collected 400 propollS Samples which were collected by Africanized Apis mellifera in Southern, Southeastern,Central western,and Northeastern Brazil.The respe c-tivesampleswereextractedwithethanol.The ethanolic extracts of propolis (EEP) Were analyzed by physICOChemicalmethodssuch as appearanceofEEP,measurementofabsorption spectra by UV-spectro-photometry, Reversed phase-thin layerchromatography (Rp-HPTLC),

Reversed phase high performance liquid chromatography (Rp-HPLC)andthentheEEPs were evaluated their physiological activities such as Antioxidantactivities,Anti-mlCrObial activities,Assayofcytotoxicactivitytocancer cells,andHIV-Growthinhibitionassays.Inac -cordancewith resultsofEEP appearance ,UV-absorption spectra,Rp-HPTLC,and Rp-HPLC,

the propolis were classified as 12 groups. Among 12 groupsofpropolis,負vegroupsof propolis were collected from Southern Brazil,

whereassix groupsofpropoliswerecollected from Northeastern Brazil. Furthermore. one group ofpropoliswasfound in Southeastern Brazil.Itwasfoundthatthevarietyofpropolis isdependingonplantecology,Althoughrarely exceptionalpropoliswasfoundinspiteofge O-glaphiclocations,these propollSWerenoti n-cludedinthisstudy.PhyslOloglCalactivitiesfor 12 groups of propolis were also variables,

dependingongeographicallocation.Thisisdue to factthatthecompositionsofpropolisare dependingonthecompositionsinplants.