博 士 （ 医 学 ） 船 越 忠 直 学 位 論 文 題 名
Application of Tissue EnglneerlngTeChniqueSfor ROtatorCu 任 RegenerationUSingaChitOSan ― baSed HyaluronanHybridFiberScaff ． 01d
（ キ ト サ ン ― ヒ ア ル ロ ン 酸 ハ イ ブ リ ッ ド 線 維 を 用 い た 組 織 工 学 的 手 法 の 肩 腱 板 再 生 へ の 応 用 ）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
修復不能な広範囲肩腱板断裂に対する 治療法として、広背筋などを用いた馳移行術、大 腿筋膜張筋を用いた自家移植術、テフ口 ンなどの非生休吸収性材料を用いた移植術が主に 行われている。しかし、腱移行術や自家 移植術では自家組織採取の犠牲があり非生体吸収 性材料を用いた移植術では異物反応があ るなどの問題点が指摘され、新しい治療法の確立 が必要であると考えられている。
近年、組織工学的手法を用いた組織再 生の試みが注目されている。組織工学的手法とは 単離 した 細胞と生体吸収性scaf foldを用いて新たに組織を再榊築させる 科学的アプロー チである。眺靭帯組織再生はコラーゲン ゲルやコラーゲン生成物、またはポリ乳酸、シル クな どをscaf foldとして用いた報告が散見される。Awadらは骨髄幹細胞 とコラーゲンゲ ルを 用い て膝鑑朏再生を試み、欠損部をコン ト口ールとすると約2倍の強 度を得たことを 報告している。また、Al tmanらはin vit roにおいて骨髄幹糸川胞とシルクのscaf foldを 用いて籾帯様組織が丙生されたことを報告・した。このように幾っかの報告があるが、臨床 応用には未だ解決すべき問題点があると 考えられる。
重要な問題点のーつは再生課程におい て移植されだネm胞が自ら細胞外マトリックスを産 生することで徐々に再生組織の強度が増 加する必要があることである。このためには細胞 外マトルックスが産生されるべき空間を 確保するために材料の生体吸収性をコントロール でき 、か つ生体力学的環境に耐えうる十分な 強度をもったscaf foldが必 要であるが、理 想的な材料は未だ知られていない。
腱 靭帯 組織を構成する主な細胞外マトリッ クスはタイプIコラーゲンで ある。一般的に 再生 され た瘢痕組織はタイプIIIコラーゲンが主体であり、これが瘢痕組 織が正常組織よ りカ 学的 に弱い要因である。それゆえ再生さ れた組織の強度を増加させるにはタイプIコ ラーゲン産生を増加させることが不可欠 であると考えられる。
我 々は 基礎実験として腱靭帯組織再生のscaf foldとして新規のキトサ ンーヒアルロン 酸ハ イブ リッド繊維を開発し良好な細胞接着 能をもち、優れたタイプIコ ラーゲン産生促 進能 を有 する こと を示 し た。 細胞 外マトリックスのーつであるGlycosaminoglycansは細 胞のphenotypeの 発現を制御し組織治癒を支持するという重要な働きが知 られている。こ のハ イブ リッ ド繊 維に は 腱板 組織 のGlycosaminoglycansの50％を占める ヒアル口ン酸を 選択 した 。ヒアルロン酸には様々な生物学的 活性が知られており細胞接着性やタイプIコ ラーゲン産生に深く関わっていると考え られている。そこで、この繊維を用いて腱板組織 再生用の3次 元scaf foldを作成した。
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本実験の仮説は生体外で 3 次元培養した後に体内に移植した細胞がタイプI コラーゲン を産生し、これが再生組織の強度増加にっながることとし、この仮説を証明するためにウ サギの肩腱板断裂モデルを作成し新規scaf fold を用いた組織工学的手法を試み、再生組 織のタ イプI コラー ゲン産生と生体力学試験を行いこの両者の相関関係を検討した。
まず、キトサンーヒアル口ン酸ハイブリッド繊維を湿式紡糸法にて作成し、これを特殊 な紡糸器を用いてウサギの腱板のサイズに合わせた3 次元 scaf fold （ 10x7mm) を作成し た。日本白色家兎の膝蓋腱より単離した第二継代の線維芽細胞をこの3 次元scaf fold 内 で 4 週 間培養した 。次に 24 匹 の日本白 色家兎の 両肩に腱 板欠損（ 10x7mm) を作成し 1 6 匹の右肩に細胞を播種したscaf fold を移植した群 (CSS 群）、左側に細胞を播種してい ないscaf fold を移植した群 (NCSS 群）を作成した。残りの 8 匹、 16 肩は断裂部をそのま ま欠損とし対照群とした。
術後 4 ， 12 週で各群 2 匹 ずっを組 織学・免 疫組織化 学的（夕イプ I ， II ，III コラー ゲン）に、同じ週数で各群6 匹ずっを生体力学的に検討した。
術後 4 週では肉眼的に CSS ， NCSS 群とも瘢痕様組織で欠損部が充填されていたが、対照 群は欠損のままであった。顕微鏡的には細胞数、コラーゲン産生ともCSS ，NCSS 群に明ら かな差は認めなかった。すべての切片で新規繊維は残存しており吸収像はなかった。また、
scaf fold の断裂、高度な異物反応はみられなかった。この時点ではコラーゲンの免疫組 織染色で明らかな陽性所見はなかった。
術後 12 週では、肉眼的にCSS ，NCSS 群とも 4 週より厚い結合組織に覆われ、対照群も 薄い膜状組織で被覆されていた。腱靭帯組織に特徴的なクリンプはCSS 群で NCSS 群より 認められ、ハイプリッド繊維は吸収像が目立っようになった。免疫組織化学染色ではタイ プ I コラ ーゲンがCSS 群 で有意に 見られ、 NCSS 群では認 められなかった。夕イプ II コ ラーゲンは骨溝付近で一部にみられ、夕イプIII コラーゲンはCSS 群ではタイプI よりは っきりしなかった。
生体力学試験ではCSS 群で術後 4 週から 12 週までに破断強度、破断ひずみがそれぞれ 191% ，163% と明らかに増加1 した（ P く0 ．01 ）。一方NCSS 群では破断強度、破断ひずみとも 叨らかな増加を示さなかった。術後 4 迎では3 群問には有意な差を認めず、術後 12 週で cssj 洋は他の2 群より有意に優れた強度を示した。
本実験では家兎の朏板欠損部にネ川胞を播種した新規 3 次元 scaf fold を用いることで術 後 4 週から 12 週までの剛にタイプI コラーゲンが増加し、さらにカ学的強度が増加した。
一方、糸nl 胞を播種していないscaf fold ではタイプ I コラーゲンが認められず、力学的強 度の増加も見られなかった。以上より、このscaf fold で培養された細胞はタイプI コラ ー ゲ ン 産 生 を 促 進 さ せ 、 こ の 結 果 力 学 的 強 度 が 向 上 し た と 考 え ら れ た 。 本実験の限界として、まず、この新規 scaf fold の生体適合性と生体吸収性が不明であ ることがある。キトサンは優れた生体適合性を持っと言われ本実験においても短期ではあ るが明らかな異物反応は認めていない。しかし、長期にわたる全身的、局所的な免疫反応 を悪人 する必要が あるとい える。他には、夕イプI コラーゲンが再生されたものの、
scaf fold の表面に存在していたことが挙げられる。これはin vitro での培養環境におい て、中央部に栄養が行き渡らずいわゆる中心性壊死を呈したものと考えられる。力学的強 度のさらなる向上にとってもタイプI コラーゲンを全層にわたり再生させる必要があり、
バイオリアクターなどによる培養環境の改善が重要であると考えられた。さらに今回得ら れたカ学的強度は正常組織の約 2096 でしかなかった。再生組織の強度を増加させるため、
scaf fold の強度を改善する必要がある。
結諭と して本実験 によルキトサンーヒアルロン酸ハイブリッド繊維からなる3 次元 scaf fold はタイプI コラーゲン産生を促進しカ学的強度を向上させたことが示された。
幾つかの制限はあるが、本結果は新規scaf fold を用いた組織学的手法が肩腱板再生に有 用であることを強く示唆している。
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学位 論文審査の要旨
学位論文題名
Application of Tissue Engineering Techniques for
、 Rotator Cuff Regeneration UsingaChitosan‑based Hyaluronan Hybrid Fiber Scaffold
（キトサン―ヒアルロン酸ハイブリッド線維を用いた 組 織 工 学 的 手 法 の 肩 腱 板 再 生 へ の 応 用 ）
修 復不能 な広範囲 肩腱板 断裂に対 する治療法として、広背筋などを用いた腱移行術、大 腿 筋膜張 筋を用い た自家移 植術、 テフロンなどの非生体吸収性材料を用いた移植術が主に 行 われて いる。し かし、腱 移行術 や自家移植術では自家組織採取の犠牲があり非生体吸収 性 材料を 用いた移 植術では 異物反 応があるなどの問題点が指摘され、新しい治療法の確立 が必要であると考えられている。
近 年、組 織工学的 手法を 用いた組 織再生の試みが注目されている。組織工学的手法とは 単 離した 細胞と生 体吸収性scaffoldを用いて新たに組織を再構築させる科学的アプローチ で ある。 腱靭帯組 織再生用 のscaffoldとして幾っかの報告があるが臨床応用には未だ解決 す べき問 題点があ ると考え られる 。重要な問題点のーっは再生課程において移植された細 胞 が自ら 細胞外マ トリック スを産 生することで徐々に再生組織の強度が増加する必要があ る ことで ある。こ のために は細胞 外マトリックスが産生されるべき空間を確保するために 材 料の生 体吸収性 をコント 口ール でき、かつ生体力学的環境に耐えうる十分な強度をもっ たscaffoldが必要であるが、理想的な材料は未だ知られていない。
我々は基礎実験として腱靭帯組織再生のscaf．foldとして新規のキトサンーヒアルロン酸 ハ イブリ ッド繊維 を開発し 良好な 細胞接着 能をも ち、優れ たタイ プIコラーゲン産生促進 能 を有す ることを示した。細胞外マトリックスのーつであるGlycosarnino餌ycansは細胞の phenotypeの発 現を制御 し組織 治癒を支 持する という重 要な働 きが知られている。このハ イ ブリッ ド繊維には腱板組織のGlycosarnin0餌ycansの50％を占めるヒアル口ン酸を選択し た 。ヒア ル口ン酸 には様々 な生物 学的活性 が知ら れており 細胞接 着性やタイプIコラーゲ ン 産生に 深く関わ っている と考え られている。そこで、この繊維を用いて腱板組織再生用 の3次元scaffoldを作成した。
本 実験の 仮説は生 体外で3次元 培養した 後に体 内に移植 した細胞 がタイ プIコ ラーゲ ン を 産生し 、これが 再生組織 の強度 増加にっながることとし、この仮説を証明するためにウ サ ギの肩 腱板断裂 モデルを 作成し 新規scaffoldを用いた組織工学的手法を試み、再生組織 の タ イ プIコ ラ ー ゲ ン 産 生 と 生 体 力 学 試 験 を 行 い こ の 両 者 の 相 関関 係 を 検討 し た 。 まず、キトサン―ヒアルロン酸ハイブリッド繊維を作成し、ウサギの腱板のサイズに合わせた3次
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則 宏
男
和
明
田 水
浪
安 清
三
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
元scaffold(10x7mm)を作成した。日本白色家兎の膝蓋腱より単離した第二継代の線維芽細胞 を この3次元scaffold内 で4週間培養 した。 次に24匹の日本白色家兎の両肩に腱板欠損(10x7 mm)を作成し16匹の右肩に細胞を播種したscaffoldを移植した群(CSS群）、左側に細胞を播種し ていないsca駒ldを移植した群（NCSS群）を作成した。残りの8匹、16肩は断裂部をそのまま欠損 とし対照群とした。
術後4，12週で各群2匹ずっを組織学・免疫組織化学的（タイプI，IIImコラーゲン）に、同じ週 数で各群6匹ずっを生体力学的に検討した。
術 後4週では肉 眼的にCSS，NCSS群とも瘢痕様組織で欠損部が充填されていたが、対照群は 欠損のままであった。顕微鏡的には細胞数、コラーゲン産生ともCSS，NCSS群に明らかな差は認 めなかった。すべての切片で新規繊維は残存しており吸収像はなかった。また、sca脇ldの断裂、
高度な異物反応はみられなかった。この時点ではコラーゲンの免疫組織染色で明らかな陽性所 見はなかった。
術 後12週で は、肉眼 的にCSS，NCSS群とも4週より厚い結合組織に覆われ、対照群も薄い膜 状組織で被覆されていた。腱靱帯組織に特徴的なクリンプはCSS群でNCSS群より認められ、ハ イブリッド繊維は吸収像が目立っようになった。免疫組織化学染色ではタイプIコラーゲンがCSS 群で有意に見られ、NCSS群では認められなかった。タイプIIコラーゲンは骨溝付近で一部にみら れ、タイプmコラーゲンはCSS群ではタイプIよりはっきりしなかった。
生体力学試験ではCSS群で術後4週から12週までに破断強度、破断ひずみがそれぞれ191％，
163％と明らかに増加した（P〈0．01）。一方NCSS群では破断強度、破断ひずみとも明らかな増加を 示 さなか った。術 後4週 では3群間には有意な差を認めず、術後12週でCSS群は他の2群より有 意に優れた強度を示した。
本実験では家兎の腱板欠損部に細胞を播種した新規3次元sca脇ldを用いることで術後4週か ら12週までの間にタイプIコラーゲンが増加し、さらにカ学的強度が増加した。一方、細胞を播種 していないsca筋ldではタイプIコラーゲンが認められず、力学的強度の増加も見られなかった。
以上より、このsca舶ldで培養された細胞はそれ自身または周囲との相互作用によルタイプIコラー ゲン産生を促進させ、この結果力学的強度が向上したと考えられた。
結論として本実験によルキトサンーヒアルロン酸ハイブリッド繊維からなる3次元sca脇ldはタイプ Iコラーゲン産生を促進しカ学的強度を向上させたことが示された。幾っかの制限はあるが、本結 果は新規sca駒ldを用いた組織学的手法が肩腱板再生に有用であることを強く示唆している。
審査にあたり，副査清水宏教授より腱板由来の線維芽細胞、幹細胞、適切な3次元sca脇1d、 他の組織への応用についての質問があった。次いで主査安田和則教授より，実験に使用したモ デル、引つ張り試験、正常腱板との比較、播種した細胞の働きについて質問があった。最後に副 査三浪明男教授から臨床的見地より，腱骨付着部の強度の改善についての質問と臨床応用に向 けてのコメントがあった。申請者はこれらの質問に対して今回行った実験の結果と過去の文献を 引用し適切に回答した。
この論文は，整形外科分野における再生医療のために最も重要な要素のーつであるsca脇ld を糖鎖工学的手法により作成し、invitro，invivoにおいてその有用性を示した独創的な研究であ る。今後発展すると思われる再生医学の指標となり、さらなる臨床応用へ向け大きな期待がもたれ る。
審査員一同は，これらの成果を高く評価し，大学院博士課程における研鑚や取得単位なども併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る もの と 半 定し た 。
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