博 士 （ 歯 学 ） 杉 本 浮
学 位 論 文 題 名
Relationship between salivary histatin5levels and Candida CFU counts in healthy elderly
（ 健 康 的 な 高 齢 者 に お け る 唾 液 中 のhistatin5の 濃 度 と カ ン ジ ダ 数 と の 関 係 ）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
【背景】
カン ジダ菌(Candida albiccms)は人 体に広く 存在する 真菌である。口腔内のカンジダ菌は、高 齢者 の場合 、唾液と ともに 気道に吸 引されて おこる 誤嚥性肺 炎や免疫力低下時に日和見感染とし て認 められ る口腔カ ンジダ 症のりス クファク ターで ある。ま た，義歯を使用することで義歯がり ザーバーとなり、カンジダ菌数が増加することが報告されている。
一方 ，唾液特有のタンパク成分であるヒスタチンは，現在まで12種類報告されており，ヒスタチ ン1，3，5が総ヒスタチンの80％以上を占めている。ヒスタチンの代表的な機能として，カンジダ菌 に対 する強カな殺菌作用があり，生理濃度内で濃度依存的そしてpH依存的にも発芽阻止，殺菌作用 を示すことが報告されている。しかし，ヒスタチン5のカンジダ菌に対するこれらの作用はin vitroで 確認されているものの，疫学的に確認した研究は少なぃ。
本研 究では ，高齢者 から採 取した唾 液中の ヒスタチ ン5の 濃度と カンジダ 菌数と の関係を検討 した。
【対象 および 方法】
道内の 農村地 区におい て，町 が主催し た住民 健康診断 を受診した高齢者で，問診等から自立し た 生 活 が 送れ て い ると 判 断 され た 高 齢者124名（ 男 性60名 ， 女性64名， 平 均 年齢75.1歳 ，65
〜 91歳）を 対象とし た。
口腔内 診査（ 義歯の種 類，残 存歯数， 歯周疾 患重症度 ）に引き続いて唾液を採取した。歯周疾 患の重 症度はCommunity PeriodontalIndexを指 標として 代表歯10歯について診査した。義歯の診 査 で は ， 上 下 顎 そ れ ぞ れ 全 部 床 義 歯 ， 局 部 床 義 歯 の 有 無 を 記 録 し た 。 唾 液 の 採取 で は ，あら かじめ唾 液採取 前90分間は ブラッ シング， 飲食を禁 止する よう事前 に 依頼し ，安静 時唾液を 各自5分問か けて冷蔵した滅菌容器に採取した。採取した時間帯は午前8:30 か ら11:00の 間 であ った 。採取し た唾液 は，直ち に貯蔵庫 に保管 し，2時間以 内に実験 室に運搬 した。 唾液中 のカンジ ダ菌数 を測定す るために ，希釈 した唾液0.1 mLを寒天 平板（ 直径90 mm， CHROMagar Candida, Paris)上に塗 布し，37℃，48時間 で好気 的に培養 した。 カンジダ 菌数は，
寒天平 板上の カンジダ 菌のコ ロニー数を計測し，対数変換した値(log CFUs/ml)でとして求めた。
唾 液 中 ヒ ス タ チ ン5量 は 競 合ELISA法 に よ り 測 定し ，唾 液中 蛋白1mg当 りの 重量 （g)で表 し た。抗体でコーティン グされたプレート（固相化抗体）に対して，50山の試料と50山の酵素標識抗 原を加えて，室温で30分間反応させた。その後，300山洗浄溶液を加える過程を5回繰り返した。100 山のo‑phenylenediamine (OPD)を加え，室温で15分間放置することで発色反応を起こし，2N硫酸を 100mを加え て反応を終了させ，吸光度(OD)は492 nmで計測した。唾 液中蛋白は蛋白定量用キット (BIO‑RAD，Hercules，CA)で測定した。
統計 分析 にお いて は， 平均 値の差の 検定には対応のないt検定， 一元配置分散分析を用いた。
多重比較はScheffe のmultiple comparison testで行った。ヒスタチン濃度とカンジダ菌数との相関 関 係はSpearmanの順 位相 関係 数よ り求 めた 。 また ，カ ンジダ菌数 に対する要因をみるために，
年齢，性別，histatin5濃度，義歯使用の有無を独 立変数，カンジダ菌数を従属変数とした重回帰 分析を行った。
【結果および考察l
l） 無歯 顎者は27名であり，平均残存歯数は13.0士9.5本であった。32名は上下 顎ともに義歯を使 用し てなく（義歯未使 用者群），51名は上下顎の少なくともどちらかに局部床 義歯を使用してお り（局部床義歯使用者群），41名は上下顎の少 なくともどちらかに全部床義歯を使用していた（全 部床 義歯 使用 者群 ）。CPIコ ード の分布では，現在歯数が少ないが故に「成立 しない」と判定さ れた者が最も多く35名(28.2％），次いでコード2(23.4％），コード3（19．40／o）の順であった。
2） 104人の唾液試料(84％）が，カンジダコロニー形成陽性であった。スコットランドの調査（137名の 高齢者中88％）やブラジルでの調査(77名の高齢者中84.4％）と比較しても 大きな差はぬく，本調 査集団が特殊な集団を対象であるとはいえない 。カンジダ菌数の平均値を年齢別，性別，義歯の使 用者別に検討したところ，70 ‑79歳(1.79士1111，pく0.01)，80〜 91歳(1.88士1.08，pく0.05)の高齢 者は ，65〜69歳の高齢 者(0.99土0.92)と比較して，有意に高い唾液中カンジダ 菌数を示した。男 女問に差は認められなかった。局部床義歯使用者群の唾液中(1.96士0.97，pく0.001)，全部床義歯使 用者群の唾液中（1.95土1.08，pく0.001)には，義歯未使用者群(0.78士0.92)よりも有意に高いカン ジダ菌数を示した。
3）ヒスタチン濃度 とカンジダ菌数との相関関係をみたところ，80〜89歳の 高齢者群（pく0.05)， およぴ全部床義歯使用者群（pく0.01）の唾液中では有意な負の相関が認め られた。しかし，その 他 の 年 齢 層 や ， 男 性 の み ， あ る い は 女 性 の み の 群 で は 有 意 な 相 関 は 認 め ら れ な か っ た 。 4） 重回 帰分析の結果，唾液中カンジダ菌数は，ヒ スタチン5の濃度と有意な負 の関連を，また義 歯の使用と有意な正の関連を示した。
しかし，今回は，口腔衛生状態や義歯の清掃に関する情報，薬剤の使用状況が調査されていなぃ。
また，カンジダ性口内炎と診断できる高齢者がみられなく，実際のカンジダ性口内炎とヒスタチン5 濃度 との関連が調査で きなかった。これらの点については，今後の改善点であ ると考えられる。
【結 諭】
ヒ スタ チ ン5濃度 が低 く， 義歯の床面積が大きくなると，唾液中のカンジ ダ菌数が増加した。
また ，高 齢 者に 対し てヒ スタチン5は、口腔内におけるカンジダ菌の感染を コントロールする因 子の1っで ある 可能 性が 示唆 され た。
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学 位 論 文 審 査 の要 旨 主 査
副 査 副 査 副 査
教授 教，授 教授 講師
森 田 学 井上農夫男 柴田健一郎 兼 平 学
学 位 論 文 題 名
Relationship between salivary histatin5levels and Candida CFU counts in healthy elderly
（ 健 康 的 な 高 齢 者 に お け る 唾 液 中 のhistatin5の 濃 度 と カ ン ジ ダ 数 と の 関 係 ）
m景1
口 腔 内 の カ ン ジ ダ 菌 は 唾 液 と と も に 誤 嚥 さ れ 肺 炎 の 病 原 体 と な る 他 、 高 齢 者 の 口 腔 カ ン ジ ダ 症 の り ス ク フ ァ ク タ ー で も あ る 。 ま た 、 義 歯 を 使 用 す る こ と で 義 歯 が り ザ ー バ ー と な ル カ ン ジ ダ 数 が 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。
唾 液 タ ン パ ク で あ る ヒ ス タ チ ン は 、 カ ン ジ ダ 菌 に 対 す る 強 カ な 殺 菌 作 用 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る が 、 カ ン ジ ダ 菌 に 対 す る こ れ ら の 作 用 を 疫 学 的 に 確 認 し た 研 究 は 少 な い 。 本 研 究 で は 、 高 齢 者 か ら 採 取 し た 唾 液 中 の ヒ ス タ チ ン5の 濃 度 と カ ン ジ ダ 菌 数 と の 関 係 を 検 討 し た 。
【 対 象 お よ び 方 法 】
道 内 の 農 村 地 区 に お い て 、 町 が 主 催 し た 住 民 健 康 診 断 を 受 診 し た 高 齢 者 で 、 問 診 等 か ら 自 立 し た 生 活 が 送 れ て い る と 判 断 さ れ た 高 齢 者124名 （ 男 性60名 、 女 性64名 、 平 均 年 齢75.1 歳 、65〜91歳 ） を 対 象 と し た 。
口 腔 内 診 査 に 引 き 続 い て 唾 液 を 採 取 し た 。 歯 周 疾 患 の 重 症 度 はCPIを 用 い た 。 義 歯 の 診 査 で は 、 上 下 顎 そ れ ぞ れ 全 部 床 義 歯 、 局 部 床 義 歯 の 有 無 を 記 録 し た 。 唾 液 の 採 取 で は 、 あ ら か じ め 唾 液 採 取 前90分 間 は ブ ラ ッ シ ン グ 、 飲 食 を 禁 止 す る よ う 事 前 に 依 頼 し 、 安 静 時 唾 液 を 各 自5分 間 か け て 冷 蔵 し た 滅 菌 容 器 に 採 取 し た 。 採 取 し た 時 間 帯 は 午 前8:30か ら11:00の 問 で あ っ た 。 採 取 し た 唾 液 は 、 直 ち に 貯 蔵 庫 に 保 管 し 、2時 間 以 内 に 実 験 室 に 運 搬 し た 。 唾 液 中 の カ ン ジ ダ 菌 数 を 測 定 す る た め に 、 希 釈 し た 唾 液O.lmLを 寒 天 平 板 （ 直 径90mm、CHROMagar Candida，Paris)上 に 塗 布 し 、37℃ 、48時 間 で 好 気 的 に 培 養 し た 。 カ ン ジ ダ 菌 数 は 、 寒 天 平 板 上 の カ ン ジ ダ 菌 の コ ロ ニ ー 数 を 計 測 し 、 対 数 変 換 し た 値(log CFUs/ml)と し て 求 め た 。
唾 液 中 ヒ ス タ チ ン5量 は 競 合ELISA法 に よ り 測 定 し 、 唾 液 中 蛋 白Img当 り の 重 量 （pg)で 表 し た 。 抗 体 で コ ー テ ィ ン グ さ れ た プ レ ー ト （ 固 相 化 抗 体 ） に 対 し て 、50vlの 試 料 と50plの 酵 素 標 識 抗 原 を 加 え て 、 室 温 で30分 間 反 応 さ せ た 。 そ の 後 、300yl洗 浄 溶 液 を 加 え る 過 程 を5
回 繰 り 返 した 。lOOLr,lのo‑phenylenediamine (OPD)を 加 え 、室 温 で15分 間 放置 す る こと で 発 色 反 応 を 起 こ し 、2N硫 酸lOOLr,lを 加 え て 反 応 を 終 了 さ せ 、 吸 光 度(OD)は492nmで 計 測 し た 。唾 液中蛋白は蛋白定量用キット(BIO‑RAD，Hercules，CA)で測定した。
統 計 分 析 に お い て は 、 平 均 値 の 差 の 検 定 はt検 定 、 一 元 配 置 分 散 分 析 を 用 い た 。 多 重 比 較 はSche艶 のmmtiplecompmsonteStで 行 っ た 。 ヒ 久 タ チ ン 濃 度 と カ ン ジ ダ 菌 数 と の 相 関 関 係 はSpeannanの 順 位 相 関 係 数 よ り 求 め た 。 ま た 、 カ ン ジ ダ 菌 数 に 対 す る 要 因 を み る た め に 、 重 回帰分析を行った。
I結果および考察】
1）32名 は 上 下 顎 と も に 義 歯 を 使 用 し て な く （ 義 歯 未 使 用 者 群） 、51名 は 上 下顎 の 少 な くと も ど ち ら か に 局 部 床 義 歯 を 使 用 し て お り（ 局 部 床義 歯 使 用者 群 ） 、41名 は上 下 顎 の少 な く と もど ち ら か に 全 部 床 義 歯 を 使 用 し て い た （ 全 部 床 義 歯 使 用 者 群 ） 。CPIコ ード の 分 布で は 、 現 在歯 数 が 少 な い が 故 に 「 成 立 し な い 」 と 判 定 さ れ た 者 が 最 も 多 く35名 （28．2％ ）、 次 い で コー ド 2（23．4％）、コード3（19．4％）の順であった。
2）104人 の 唾液 試 料 （84％ ） が、 カ ン ジダ コ ロ ニー 形 成 陽性 で あ った 。カ ンジダ菌 数の平均 値を 年 齢別、性 別、義 歯の使用 者別に 検討した ところ 、70〜79歳（1．79士1111，pくO．01）、80〜91歳
（1．88土1．08，pく0．05）の高齢者は、65〜69歳の高齢者（0．9虹0．92）と比較して、有意に高い唾液中 カ ン ジ ダ 菌 数 を 示 し た 。 男 女 間 に 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 局 部 床 義 歯 使 用 者 群 の 唾 液 中
（1．96士0．97，pくo．001）、全部床義歯使用者群の唾液中（1．95土1．08，pく0．001）には、義歯未使用者 群（O．78土O．89）よりも有意に高いカンジダ菌数を示した。
3） ヒ スタ チ ン 濃度 と カ ンジ ダ 菌 数 との 相 関関 係をみた ところ 、80〜89歳の 高齢者 群Qくo．05）、
お よ ぴ 全部 床 義 歯使 用 者 群QくO．01） の 唾液 中 で は有 意 な 負の 相 関 が認め られた 。しかし 、その 他 の 年 齢 層 や 、 男 性 の み 、 あ る い は 女 性 の み の 群 で は 有 意 な 相 関 は 認 め ら れ な か っ た 。 4） 重 回 帰 分 析 の 結 果 、 唾 液 中 カ ン ジ ダ 菌 数 は 、 ヒ ス タ チ ン5濃 度 と 有 意 な 負 の 関 連 を 、 また 義歯の使用と有意な正の関連を示した。
（結諭1
ヒ ス タ チ ン5濃 度 が 低 く 、 義 歯 の 床 面 積 が 大 き く な る と 、 唾液 中 カ ンジ ダ 菌 数が 増 加 し た。
ま た 、 高 齢 者 に 対 し て ヒ ス タ チ ン5は カ ン ジ ダ 菌 の 感 染 を コ ン ト ロ ー ル で き る 可 能 性 が 示 唆 された。
本 論 文 申 請 者 に 対 し て 、 主 査 韜 よ び 副 査 か ら ま ず 本 論 文 の 概 要 に っ い て の 説 明 が 求 め られ た 。 続 い て 行 わ れ た 口 頭 試 問 に お い て 、 カ ン ジ ダ 菌 数 は 、 加 齢 と と も に 変 化 す る も の で あ る の か 、 ま た は 、 義 歯 を 入 れ る こ と で 変 化 す る も の で あ る の か 、CPIの 具 体 的 な 測 定 方 法 、 ヒ ス タ チ ン の 抗 菌 作 用 機 序 、 そ し て 、 今 回 の 疫 学 調 査 の 結 果 か ら 今 後 の 研 究 方 針 を ど の よ う に考えているか等、詳細にわたって行われた。
申 請 者 は こ れ ら の 設 問 に 対 し そ れ ぞ れ 適 切 な 回 答 を 行 っ た 。 従 っ て 申 請 者 は 研 究 の 立 案と 実 行 、 結 果 の 収 集 と そ の 評 価 に っ い て 、 十 分 な 能 カ が あ る こ と が 理 解 さ れ 、 本 研 究 に 直 接 関 係 す る 事 項 の み な ら ず 、 予 防 歯 科 学 お よ び 疫 学 全 般 に わ た り 広 い 学 識 を 有 し て い る と 認 め ら れ た 。 ま た 本 研 究 は 、 唾 液 中 の ヒ ス タ チ ン5濃 度 と カ ン ジ ダ 菌 数 と の 関 係 を 疫 学 的 に 調 査 し た も の で あ り 、 ′ 今 後 の ヒ ス タ チ ン5の 臨 床 応 用 の 可 能 に す る 重要 な も ので あ り 、予 防 歯 科 学 の 領 域 に お い て 大 い に 貢 献 し た と 評 価 さ れ た 。 従 っ て 、 本 論 文 申 請 者 は 博 士 （ 歯 学 ） に ふ さ わしいものと認められた。
