博士（農学） 西岡大樹 学位論文題名
く
X 線結晶構造情報に基づぃた酵素の高機能化とその応用に 関する研究
学位論文内容の要旨
タ ン パ ク 質 の 構 造 情 報 は 、 近 年 飛 躍 的 に 増 加 し 、Protein Data Bank (PDB) に 現 在 登 録 さ れ て い る 構 造 も9万 近 く ま で 増 加 し て い る 。 酵 素 の 高 機 能 化 を 目 指 す 場 合 、 ラ ン ダ ム 変 異 導 入 法 等 の 手 法 が ― 般 的 で あ る が 、 近 年 、 タ ン パ ク 質 の 構 造 情 報 を 用 い た 基 質 特 異 性 や 活 性 の 向 上 を 目 指 し た 改 変 が 積 極 的 に 検 討 さ れ て き て お り 、 今 後 、 ま す ま す そ の 応 用 が 増 え て く る も の と 予 想 さ れ る 。 筆 者 は 産 業 用 酵 素 の 中 で も 血 糖 値 測 定 用 の 酵 素 と し て 実 際 に 応 用 が 期 待 さ れ て い る Bacillus megaterium IAM 1030由 来 NAD(P)゛ 依 存 性 グ ル コ ー ス 脱 水 素 酵 素 (BmGlcDH） 、 お よ び 骨 粗 し ょ う 症 治 療 薬 と し て 使 用 さ れ る 活 性 型 の ビ タ ミ ン D3（ VD3） を 不 活 性 型 か ら 水 酸 化 反 応 に よ り 活 性 型 に 変 換 す る 希 少 放 線 菌 尸 ｜seudDn〇ca′ ．d´aauめf旧p′7´ca由 来VD3水 酸 化 酵 素 （VitaminD3hydroxyIaSe； シ ト ク ロ ム P450Vdh） の 構 造 と 機 能 解 析 に 関 す る 研 究 を 行 っ て き た 。 日 ・acnんs属 細 菌 由 来NAD（P） ゛ 依 存 性 グ ル コ ― ス 脱 水 素 酵 素 は 現 在 、 血 糖 値 診 断 用 酵 素 と し て 利 用 さ れ て い る 。B．mega細 mm｜AM1030は4つ のNAD（P） ゛ 依 存 性 グ ル コ ― ス 脱 水 素 酵 素 （BmGlcDH‐1、 ‐ ｜1、 ‐ 川 、 ‐ ｜V） を 有 し て お り 、 こ れ ら の 酵 素 は 短 鎖 型 脱 水 素 酵 素 ／ 還 元 酵 素 フ ァ ミ リ ― に 属 し て い る 。BmGIcDHは 、 単 一 成 分 （ 分 子 量28KDa） か ら な る 四 量 体 構 造 を 示 す 事 が 報 告 さ れ て い る 。Bl m印a冶 ′ ′ umIAM1030の4種 の ア イ ソ ザ イ ム の う ち 、 BmGICDH‐lVは 、 比 較 的 熱 安 定 性 が 高 く 、 活 性 も 高 い が 、D‐ グ ル コ ― ス 以 外 の 糖 に も わ ず か に 反 応 す る 為 、 よ り 基 質 特 異 性 が 向 上 し た 酵 素 の 取 得 が 求 め ら れ て い た 。 そ こ で 、BmGlcDH―IV の 基 質 複 合 体 のX線 結 晶 構 造 解 析 を 行 い 、 基 質 特 異 性 改 変 に 向 け た 基 盤 情 報 の 取 得 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 基 質 フ リ ― 、NADH複 合 体 、D‐ グ ル コ ― ス 複 合 体 のX 線 結 晶 構 造 解 析 を 行 う 事 が 出 来 た 。 興 味 深 い 事 に 、 酵 素 ‐D‐ グ ル コ ー ス 複 合 体 の 構 造 で は 、 隣 の サ ブ ュ ニ ッ ト のC― 末 端 が 活 性 部 位 に 入 り 込 む よ う に 伸 び て き て お り 、D． グ ル コ ー ス のC4、C6の 水 酸 基 と 直 接 水 素 結 合 し て い る 事 が 明 ら か と な っ た 。 そ こ で 、BmGlCDH・lVの C‐ 末 端 のG261、 G259、A258に 部 位 特 異 的 変 異 導 入 を 行 う 事 に よ り 、C‐ 末 端 構 造 を 不 安 定 化 さ せ 基 質 特 異 性 の 向 上 を 目 指 し た 。 合 計 で6種 の 変 異 体 （G261A、 G261V、 △G261、G259A、G259V、A258F） を 構 築 し 、 基 質 特 異 性 、 活 性 、 熱 安 定 性 を 調 べ た と こ ろ 、G259A変 異 体 が 熱 安 定 性 や 活 性 を 維 持 し つ つ 、 最 も 優 れ た 基 質 特 異 性 を 示 し た 。 こ の こ と か ら 、C‐ 末 端 部 位 へ 飽 和 変 異 導 入 等 を 行 う 事 に よ り 、 さ ら な る 高 機 能 化 変 異 体 を 取 得 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
シ 卜 ク 口 ムP450は オ キ シ ゲ ナ ー ゼ の ― 種 で あ り 、2つ の 電 子 を 使 っ て 還 元 的 に 酸 素 を 活 性 化 し 、 不 活 性 な 炭 化 水 素 鎖 に ― 原 子 酸 素 添 加 反 応 を 触 媒 す る へ ム
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タンパク質である。P450 は、高等動物においては、薬剤の解毒、ホルモンの生 合成、脂肪酸代謝などの反応に関与し、微生物においては複雑な抗生物質の生 合成に寄与するなど多岐にわたる生理機能を示す。P450 はその相同性から多く のフんミリーやサブフんミリーとして分類されており基本的な立体構造は類似 している。しかし、自然界では基質特異性が異なるP450 が多数存在しているた め、基 礎・応用の面から興味深い分子の―つであり、これまで多くのX 線結晶 構造解 析が報告されている。筆者らは、組換えRhodococcus 属放線菌を用いた 活性型 VD3 の効率的な 生産系を 構築する 為、 VD3 水酸化酵素 (P450 Vdh) の発現 系構築や、進化工学により高いVD3 水酸化活性を示し基質結合能も大きく上昇し たVdh 変異 体(Vdh‑Kl ）を取得 している 。しかしながら、同変異体は野生型に 比べ分子の熱安定性及び細胞内タンパク質発現量が低下していた。そこで本研 究では、Vdh の構造安定性に影響を及ぼさず、かつ電子伝達タンパク質からの電 子 供 給 能 が 向 上 し た 高 活 性 型 Vdh 変 異 体 の 取 得 を 目 指 し た 。 これま での研究か ら、Vdh へ最 も効率よくNAD(P)H から電子伝達を行なう 事が判明しているAcinetobacter sp. OC4 由来電子伝達タンパク質（フウレドキ シン(AciB) 及 びフェレドキシン還元酵素(AciC) ）を用いて実験を行った。 Vdh 分子表面に局在しAciB との結合が予想されるアミノ酸に変異を導入し、VD3 水酸 化活性が向上する変異体の取得を行ったところ、構築した8 種の変具体のうち、
Vdh‑K1 とほぼ 同等の高活 性を示す T107A 変異体を見出した。T107A 変異体の基 質結合スペク卜ルアッセイ及びAciB との相互作用解析を行ったところ、基質と の結合能は野生型と差が見られないものの、AciB との相互作用能が明らかに向 上して いる事が判明した。そこで、T107A 変異体の活性向上をもたらした構造 学的要 因を探るべく、X 線結晶構造解析を行なった。その結果、進化工学的手 法によって取得されたVdh‑K1 変異体とほぽ同様、構造変化による分子表面の電 荷分布が大きく変化していることが観察された。P450 とフウレドキシン両分子 の相互作用には、相互作用部位の電荷が重要であると示唆されていることから、
T107A の構造 変化はAciB との 相互作用 能向上に 寄与して いると推 定される。
また筆 者らは、組換えRhodococcus 属放線菌に抗菌ペプチド、ナイシンを 添加することにより、VD3 水酸化効率を向上させることを既に報告している。ナ イシン は、グラム陽性菌に作用し細胞膜に孔を形成する。この孔を介してVD3 が細胞内に移行することで同基質の細胞膜透過性の障害を取り除くことが出来 る。今回取得したT107A 変異体、電子伝達タンパク質、更にB ．megaterium IAM 1030 由来BmGlcDH‑IV を 共発現した 細胞をナ イシンで 処理しVD3 水 酸化効率を 検証すると、NAD(P)H の再生供給も円滑化し、単位時間辺りのVD3 変換効率を既 存の報告より劇的に向上させることに成功した。今後、活性型VD3 の市場はさら に拡大する事が見込まれているので、本論文で構築した系を基にした発展系が 実用化される事を期待したい。
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学位論文審査の要旨
主査 客員教授 田村具博 副 査 教 授 横 田 篤 副査 客員教授 鎌形洋一 副査 客員准教授 湯本 勳 副査 客員准教授 森田直樹
学 位 論 文 題 名
X 線結晶構造情報に基づぃた酵素の高機能化とその応用に 関する研究
本論文は和文112 項、図35 、表13 、6 章からなり、参考論文（原著論文6 編）が付されて いる。
タンパク質は、構成するアミノ酸の種類やその配列により高次構造や機能が決定される が、現在の科学においてもなお、1 次構造の情報のみではそれら高次構造や機能を予想する ことは容易ではなぃ。タンパク質工学的手法による標的酵素の機能改変は、ランダム変異 導入による手法などが一般的であり現在も多くの研究が行われている。一方、標的酵素の 立体構造が決定されれば、構造情報を基盤とした部位特異的な変異導入が可能となり、目 的とする機能改変体の作成効率を高くできる可能性がある。
本論文では、産業的に有用性の高い2 酵素（グルコース脱水素酵素とビタミンD 水酸化 酵素）について、構造情報をもとにした機能改変を試み、その結果をまとめたものである。
1 ）古細菌由来グルコース脱水素酵素の機能解析
好熱好酸性の腐食古細菌であるThermoplasma acidophilum より、既知相同分子とは基質 特異性が全く異なる新しいアルドヘキソース脱水素酵素(AldT) が所属研究室より同定さ れている (28 kDa 成分の単一4 量体）。各サブュニットのC ー末端アミノ酸数残基が、隣り 合うサブュニットの基質結合ポケット入り口を完全に覆っている事から、AldT のC ―末端の アミノ酸数残基を欠失させた変異体を 4 種類構築し(A254 、A253 、A252 、A249) 、D ―マンノ ースを基質として野生型酵素との活性を比較した。その結果、 2 残基の欠失(A253) で約 300 分の 1 に、 3 残基 の欠失 (A252) で530 分 の 1 にそれぞれ活性が低下した。更に 6 残基 の欠失(A249) では活性が検出されなかった。次に、C ―末端のP254 と相対して配位する Y86 の疎水性相互作用を検討するため、P254G 及びY86G 変異体を構築し活性を比較すると、A253 及びA252 変異体と同様酵素活性が著しく低下することを見出した。これらのことから、 AldT 同様の構造をもつ酵素ファミリーは、 C ―末端領域が酵素の活性に対して大きく影響するこ とを示す重要な知見が得られた。
2 ） NAD(P)+ 依存性グルコース脱水素酵素(GlcDH) の改変
血 糖値測定 用の酵素としてBacillus 属由来 NAD (P) ゛依存性グルコース脱水素酵素 (BmGlcDH) が実用化されているが、一般的にグルコース脱水素酵素は基質特異性が広く、
血糖値測定においてその数値の取扱いに注意を要する場合がある。そこで、本論文では、
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Bacillus megaterium IAM 1030由 来BmGlcDHを 用 い て 基 質 特 異 性 の 改 変 を 目 指 し た 研 究 を 展 開 し た 。BmGlcDHはAldTと 同 じ タ ン パ ク 質 フ ァ ミ リ ー に 属 し 、 単‑4量 体 酵 素 で 立 体 構 造 も 両 者 問 で 類 似 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 本 研 究 で は4種 のBmGlcDHア イ ソ ザ イ ム （I〜IV） の 内 、BmGlcDHーIVに 対 し て 基 質 フ リ ー 、NADH複 合 体 、Dー グ ル コ ー ス 複合 体のX 線 結 晶 構 造 解 析 を 行 っ た 。D− グ ル コ ー ス 複 合 体 の 構 造 よ り 、 隣 の サ ブ ユ ニ ッ ト のC一 末 端が 活 性 部 位 に 入 り 込 む よ う に 伸 ぴ て き て お り 、D― グ ル コ ー ス のC4、C6の 水 酸 基 と 水 素 結 合 し て い る こ と を 新 た に 見 出 し 、AldTと は 異 な る 構 造 を 持 つ こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ の 知 見 を も と にC― 末 端 構 造 を 不 安 定 化 さ せ る こ と に よ り 基 質 特 異 性 が ど の よ う に 変 化 す る か6種 の 変 具 体(G261A、G261V、 △G261、G259A、G259V、A258F)を 作 製 し 、 基 質 特 異 性 、 活 性 、 熱 安 定 性 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、D− グ ル コ ー ス を 基 質 と し 野 生型 酵 素と 比較 す ると 、各 変 異体 と も に 活 性 の 低 下 が 確 認 さ れ た が 、G259A変 異 体 の み 熱 安 定 性 や 活 性 を 維 持 し つ つ 基 質 特 異 性 の 著 し い 向 上 が 確 認 さ れ た 。 こ の こ と は 、AldTやBmGlcDHな ど を 含 む 短 鎖 型 脱 水 素 酵 素
／ 還 元 酵 素 フ ァ ミ リ ー は 、C― 末 端 領 域 に 活 性 の み な ら ず 基 質 特 異 性 に 影 響 を 及 ば す 特 有 の 構 造 を 持 つ こ と が 示 唆 さ れ 、 機 能 改 変 に 向 け た 有 用 な 知 見 が 得 ら れ た と 高 く 評 価 さ れ る 。 3） ビ タ ミ ン D水 酸 化 酵 素 の 機 能 改 変 と ピ タ ミ ン D水 酸 化 体 生 産 へ の 応 用 骨 粗 し ょ う 症 や 乾 癬 な ど の 治 療 薬 と し て 使 用 さ れ る 活 性 型 ビ タ ミ ンD3を ビ タ ミ ンD3 (VD3) か ら 一 段 階 で 活 性 化 す る 反 応 を 触 媒 す る シ ト ク ロ ムP450酵 素(Vdh)が 、 希 少 放 線 菌 Pseudonocardia autotrophicaよ り 同 定 さ れ 、 化 学 合 成 に 置 き 換 わ る 生 産 手 法 と し て 研 究 が 進 め ら れ て き た 。 既 にVdhの 進 化 工 学 に よ る 高 活 性 型 変 異 体(Vdh−Kl） の 取 得 は 行 わ れ て い る が 、 細 胞 内 安 定 性 が 低 く 実 細 胞 を 用 い た 変 換 反 応 に は 不 具 合 が 生 じ て い た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 視 点 を 変 え 、Vdhの レ ド ッ ク ス パ ー ト ナ ー(RP)か ら の 電 子 供 給 効 率 を 高 め る Vdh変 異 体 の 取 得 を 目 指 し た 。Vdhへ の 変 異 導 入 部 位 は 、P450camとRP分 子 の フ ェ レ ド キ シ ンCamBが 相 互 作 用 す る ア ミ ノ 酸 残 基 の 情 報 、Vdhへ 電 子 伝 達 可 能 なAcinetobacter sp. OC4 由 来 フ ェ レ ド キ シ ンAciBと 本 来 のRP分 子 で あ るP450 AciAの 配 列 情 報 を も と に 決 定 し た 。 8種 のVdh変 異 体 を 作 製 し 、AciBを 介 し た 酵 素 活 性 を 比 較 す る と 、T107A変 異 体 は 、 野 生 型 に 比 ベ フ ェ レ ド キ シ ン と の 親 和 性 （ 焔 ） が 約3倍 向 上 し 、Vmヨェ は 約28倍向 上 する こと を 見出 し た 。 ま た 同 変 異 体 は 細 胞 内 安 定 性 も 高 く 細 胞 内 発 現 量 も 安 定 し て い た 。 更 にX線 結 晶 構 造 解 析 か ら 、T107A変 異 体 は 高 活 性 型Vdh一Kl変 異 体 と 同 様 の 構 造 変 化 が 観 察 さ れ 、Vdh分 子 表 面 の 電 荷 分 布 が 大 き く 変 化 し て い る こ と が 観 察 さ れ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 わ ず か1残 基 の 点 変 異 の み でP450を 高 機 能 化 す る こ と が 可 能 で あ る こ と を 示 し 、 多 種 多 様 なP450分 I子 へ の 機 能 改 変 に 対 す る 基 盤 情 報 が 取 得 で き た と 考 え ら れ 高 く 評 価 さ れ る 。 こ のT107A変 具 体 を 発 現 し た 細 胞 を 用 い 、 抗 菌 ペ プ チ ド 、 ナ イ シ ン を 利 用 し たVD3水 酸化 反 応 を 行 っ た 。 ナ イ シ ン はVD3の 細 胞 膜 透 過 性 を 著 し く 改 善 す る の で 、VD3の 水 酸 化活 性 の向 上 が 期 待 で き る 。 変換 に用 い た細 胞は 、BmGlcDH―IVを 共 発現 し、NAD (P)H再 生 環境 を整 え た。
そ の 結 果 、 得 ら れ た 単 位 時 間 あ た り のVD3水 酸 化 体 生 産 速 度(286.5ug/mL/hr)は 、 野 生 型 酵 素 を 発 現 し て い る ナ イ シ ン 未 処 理 細 胞(2. 21 pg/mL/hr)と 比 較 し て 約130倍 、 野 生 型 酵 素 を 発 現 し て い る 細 胞 に ナ イ シ ン 処 理 を 施 し た 場 合(8. 96ug/mL/hr)と 比 較 し て 約32倍 高 く な る こ と が 判 明 し た 。 こ の 変 換 効 率 は 、 過 去 報 告 の あ る 活 性 型VD3生 産 系 の 中 で 最 も 高 い 値 を 示 し 、 本 研 究 に よ る 新 規 変 換 系 の 構 築 は 高 く 評 価 さ れ る 。
上 記 、 産 業 利 用 可 能 な 酵 素 （ グ ル コ ー ス 脱 水 素 酵 素 やP450)の 研 究 は 、 構 造 情 報 を 基 盤 と し た 酵 素 の 改 変 が 機 能 改 変 体 を 取 得 す る 上 で 有 用 な 手 法 で あ る こ と を 示 す 優 れ た 研 究 成 果 で あ る 。 特 に ビ タ ミ ンD3の 水 酸 化 反 応 系 に っ い て は 、 実 用 化 に 耐 え う る レ ベ ル の 変 換 速 度 が 達 成 さ れ て お り 、 化 学 合 成 に 置 き 換 わ る 技 術 と し て 期 待 さ れ る 。 よ っ て 、 審 査 員 一 同 は 、 西 岡 大 樹 氏 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 認 め た 。
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