Title
Studies on Phagocytic Mechanism and Virulence Factors of
Brucella abortus within Host Cell( 内容の要旨 )
Author(s)
金, せき
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(獣医学) 甲第171号
Issue Date
2005-03-14
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/2225
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名(国籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 金 (10) 爽(大韓民国) 博士(獣医) 獣医博甲第171号 平成17年3月14日 学位規則第4粂第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 帯広畜産大学 StudiesonPhagocyticMechanismandV血1ence Factorsof及uceLhaboTtuSWithinHostCe11 (ブルセラ菌の細胞内侵入機構と細胞内増殖に関する 研究) 主査 帯広畜産大学 副査 帯広畜産大学 副査 岩手大学 副査 東京農工大学 副査 岐阜大学 一尋 治一之 壮千修英重 野 本 田 多 牧杉津本源 授授授授授 教教教教教 論 文 の 内 容 の､要 旨 ブルセラ症の原因であるブルセラ菌は､日本では稀であるが､動物では 世界中で認められ､ヒトへの■感染源となっている｡本菌はマクロージフア ージ 川￠)内増殖能を有し､VirB蛋白質群によるⅠⅤ型分泌機構が重要で あるが､その詳細は不明である｡本研究では､本箇のM￠ 内増殖に関わる 宿主･菌側因子を同定し､感染における役割を検討した｡第1章では､ βr〟ぐe〃∂∂如∫亡ロ∫の細胞内侵入経路を検討した｡野生株はM￠表面で円を 描くように侵入し､マクロピノソーム(MP)形成を誘導する｡MP上にはリ ビドラフト(LR)構成.分子が集積し､膜貫通型蛋白が排除されるが､この 細胞膜上分子の選別機構が菌の細胞侵入に重要である｡野生株ではPMA処 理M◎ でMPが誘発され､多くの菌が内部に存在する｡しかし変異株ではこ の膜選別が罷められなかった｡PMA誘導MP形成はPI3キナーゼの阻害剤､ wortmチnninにより阻害されるが､変異株やは影響を受けなかった｡以上よ り､本菌によるMP形成は未知のメカニズムで誘導され､これが膜分子の選 別に重要であることが示唆された｡第2章では､β.∂如r拍∫の宿主細胞内 侵入と増殖に関わる菌側因子の検索を行った｡トランスポゾンTn几m2ラン ダム挿入により 4400個の挿入株を分離し､23株の細胞内増殖欠損変異株 を得た｡これらは､①細胞内侵入および増殖能欠損変異株､②細胞内増殖
ー202-能のみの欠損変異株､_ ③野生株と比べ2倍以上細胞侵入の効率が高いが細 胞内増殖能を欠く変異株､の 3群に分類された｡これらの挿入部位は､ⅠⅤ 型分泌機構関連遺伝子群､アミノ酸合成･糖代謝等に関わる遺伝子および 外膜蛋白質遺伝子であった｡本研究で同定された細胞侵入に関与する遺伝 子は新規な遺伝子であり､この変異株はマウス体内での増殖性も欠いてお り､本菌の細胞侵入性とマウスヘの病原性に関連があることが示された｡ 第3章では､NAD前駆物質ニコチンアミドをニコチン酸に変化させる酵素
であるニコチンアミダーゼ､Pn叫の機能解析を行った｡これはβ･8如rf〃∫
における NADの生合成における唯一の経路である｡即CJ変異株は最小培地 では増殖しないが､ニコチン酸添加最小培地では野生株と同程度増殖した｡ 更に､変異株は細胞内増殖能を欠きJ､ニコチン酸により増殖能が回復した｡ また､ファゴソームとリ ソソーム融合阻害能は野生株･と同じであった｡マ ウスに変異株を接種すると､野生株より牌臓内菌数は減少したが､感染10 週後でも菌が検出された｡ワクチン株S19と同程度の防御効果を示した｡ 以上より､PncAはβ.8ムor亡〟∫の細胞内増殖に必須で､変異株はワクチン 開発に繋がることが示唆された｡以上且 8如r亡〟∫はM中内に能動的に侵入する ことが明らかになり､数種の病原因子を新たに見出し､遺伝学的背景が不明瞭なS19 株に比べ､より安全なワクチン株開発の可能性を示した｡ 審 査 結声
の 要 旨､申請者の研究は人獣共通感染症であるブルセラ症の感染機構考明らかにしようとす
るもので､原因菌であるβ川Ce肋ゐor血∫の特徴であるマクロファージ内増殖能に着目 して､その細胞内侵入および増殖過程に関わる宿主と菌側の因子を同定したものであ る｡主論文は3･部から成り､第一章では且血or血∫がマクロファージ内に侵入する際に､ 本菌独自の膜選別が起こることが重要であることを証明し､第二章ではトランスボソンによる且血r加の挿入変異株をランダムに作出し､細胞内侵入の喪失した変異株
を解析し､新たな遺伝子を染色体上に見出した｡.第三章ではその変異株の内､NADの 前駆物質であるニコチンアミドをニコチン酸に変化させる酵素であるニコチンアミダ ーゼをコードし､且め0仙∫においてはNADの生合成における唯一の経路であることが知られているク乃d遺伝子変異株に着目し､病原性の喪失してし＼ることを確認し､新
たなワクチン候補株であることを証明した｡以上の内容は､本菌はマクロファージ内 に受動的に取り込まれるのではなく､能動的に侵入することを明確に示し､菌が細胞 内に侵入する際に増殖型ファゴソームを形成することにより菌の細胞侵入様式がその 後の細胞内増殖を左右する要因の一つであることを明らかとした｡これらの内容は､ 将来の細胞内寄生菌の感染経路を明らかにする辛がかりとなると共に､予防法の新た な開発の可能性を示すものであり､学術的に重要な知見を提示したといえる｡更に､ その成果を評価の高い海外の雑誌に発表している｡以上にういて､審査委員全員一致で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位
論文として十分価値があると認めた｡基礎となる学術論文
1)題 目:Membrane sorting during swimminginternalization ofBruceLEais required fbr Phagosometra岱ckingdecisions 著者名:Kim,S.,Watarai,M.,Makino,S-l.andShir?hata,T 学術雑誌名:MicrobialPathogenesis 巻･号･貢･発行年月:33(5):225-237､2002 2)題
目:Isolationandchara鱒rizationofmini-Th5h2insertionmutよntsofBrucelhzabortus
deficientininternalizationandintracellulargrow血inHeLacells 著者名:Kim,S.,Watami,M.,Kondo,Ⅹ,Erdenebaatar,J.,Makino,S-l･andShirahata,Tl 学術雑誌名:h飴ctionandImmⅦ血y 巻･号･貢･発行年月:71(6)3020-3027､2003 3)題 目:BTVCe肋abort揖nicotinamidase(PncA)contributestoitsintracellularreplicationand inftctivityinmice 著者名:鮎m,S.,Kurokawa,D.,Watanabe,K.,Makino,S-l.,Shirahata,TlandWhtami,M･ 学術雑誌名:FEMSMicrobiologyLetters 巻･号･貢･発行年月:234(2):289-295､2004 既発表学術論文1)題 目:bng-term eXCTetion of Shiga toxin-PrOducing Ebcherichib coLi(STEC)and experimentalinftctionofasheepwith0157 著者名:Kin,S.,Asakura,H.,Kmi,A.,Whtarai,M.,Shirahata,Tl,Thkeshi,K･,TbkamOtO,T andMabno,S-Ⅰ. 学術雑誌名:Joローnalof ⅥtednaryMedicalSci￠nα 巻･号･貢･発行年月:64(10):927-931､2002 2)題目:Ce11ularprionproteinpromotesBruce肋infectionintomacrophages 著者名:Whtarai,M.,Eim,S.,Erdenebaatar,J.,Makino,S-Ⅰ.,Horiuchi,M.,Shirahata,Tl, Sakaguchi,S.andKatamine,S･ 学術雑誌名:JoumalofExperimentalMedicine 巻･号･貢･発行年月:198(1):5-17､2003
