CD204陽性細胞による免疫制御機構の解明

CD204

陽 性 細 胞 に よ る 免 疫 制 御 機 構 の 解 明

ア ポ ト ー シ ス 細 胞 や コ ラ ー ゲ ン な ど と も 結 合 す る こ と が 明 ら か に な っ た 8 , 9_{。 ま た 、} CD204 分 子 は 、グ ラ ム 陰 性 桿 菌 の 細 胞 壁 構 成 成 分 LPS や 、グ ラ ム 陽 性 菌 リ ポ タ イ コ 酸 と 結 合 し 、 病 原 毒 素 の 排 除 に 寄 与 し て い る 可 能 性 も 報 告 さ れ て い る 9_{。 し か し 、 敗 血} 症 に お け る CD204 陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 役 割 を 、生 体 レ ベ ル で 解 析 し た 研 究 は 行 わ れ て い な か っ た 。 腫 瘍 の 悪 性 化 進 展 に は 、が ん 細 胞 の み な ら ず マ ク ロ フ ァ ー ジ や 制 御 性 T 細 胞 等 の 免 疫 細 胞 や 血 管 内 皮 細 胞 、 周 皮 細 胞 な ど 腫 瘍 血 管 を 構 成 す る 細 胞 な ど 多 様 な 細 胞 が 関 与 す る 。 中 で も 、 腫 瘍 に 浸 潤 す る マ ク ロ フ ァ ー ジ は 、 腫 瘍 随 伴 マ ク ロ フ ァ ー ジ （tumor

associated macrophage : TAM）と 呼 ば れ 、血 管 内 皮 増 殖 因 子（ vascular endothelial growth factor : VEGF） な ど の 成 長 因 子 の 産 生 を 介 し て 血 管 新 生 を 誘 導 、 酸 素 や 栄 養 を 供 給 す る こ と で が ん 細 胞 の 増 殖 に 寄 与 す る こ と が 知 ら れ て い る 1 0_{。TAM は ま た 、チ ェ ッ ク ポ} イ ン ト 分 子 PD-L1/PD-11 1 _{や TGF-β}1 0 _{の 産 生 を 介 し て 、 抗 腫 瘍 免 疫 を 担 う CD8 陽 性 T} 細 胞 の 活 性 抑 制 に も 関 与 す る こ と が 明 ら か に な っ て き た 。 近 年 、CD204 分 子 は TAM の マ ー カ ー と し て 用 い ら れ て い る 。実 際 、乳 が ん 1 2_{や 口 腔 扁 平 上 皮 が ん} 1 3_{の 腫 瘍 組 織} の CD204 陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 は 5 年 生 存 率 と 逆 相 関 す る と の 報 告 が な さ れ て い る 。 が ん の 治 療 は 主 に 手 術 、 化 学 療 法 、 放 射 線 療 法 が 用 い ら れ て い る 。 こ の う ち 放 射 線 療 法 は 、 切 除 不 能 が ん の 治 療 や 手 術 後 に 残 存 す る が ん 組 織 を 治 療 す る た め の 術 後 補 助 療 法 と し て 用 い ら れ て い る 。 例 え ば メ ラ ノ ー マ で は 病 型 に も よ る が 、 悪 性 黒 子 型 黒 色 腫 で は 放 射 線 治 療 後 の 再 発 率 は 5%と 良 好 で あ る 一 方 1 4_{、鼻 腔 粘 膜 に 形 成 さ れ た 粘 膜 メ ラ} ノ ー マ で は 、手 術 後 の 補 助 療 法 と し て 放 射 線 療 法 を 行 っ た 場 合 で も 15-30%の 患 者 で 再 発 す る 1 5_{。 こ の よ う に 、 一 時 的 に 退 縮 し て も 再 発 す る 事 象 は 根 治 に 向 け た 治 療 を 進 め} る 上 で 問 題 と な っ て い る 。腫 瘍 組 織 へ 放 射 線 照 射 を 行 う と 、CD11b 陽 性 , F4/80 陽 性 の TAM が 集 積 す る と の 報 告 が あ る 1 6_{。 こ れ ら の TAM は 、 放 射 線 照 射 後 の 腫 瘍 再 増 殖 に} も 何 ら か の 役 割 を 担 う と 考 え ら れ る が 、 具 体 的 な 役 割 の 解 析 は 不 十 分 で あ っ た 。 腫 瘍 再 増 殖 に お け る TAM の 役 割 を 理 解 す る た め 、 放 射 線 に よ る 再 増 殖 モ デ ル を 構 築 し 、 腫 瘍 に 浸 潤 す る 免 疫 細 胞 の 役 割 を 解 析 し た 。 本 研 究 で は 、敗 血 症 お よ び が ん の 病 態 形 成 に お け る CD204 陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 役 割 の 解 明 を 目 的 と し 、CD204 陽 性 細 胞 を 選 択 的 に 消 去 可 能 な CD204-DTR マ ウ ス を 作 製 し た 。CD204 陽 性 細 胞 を 消 去 し た マ ウ ス に 敗 血 症 を 誘 導 す る と 、血 清 中 の IL-6 お よ

び tumor necrosis factor-α; TNFα 濃 度 が 上 昇 す る と 共 に 、 生 存 率 が 著 し く 低 下 す る こ と

が 明 ら か に な っ た 。 こ れ ら の 知 見 よ り 、CD204 陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ が 、 炎 症 性 サ イ ト

カ イ ン の 産 生 を 抑 制 す る こ と で 、 敗 血 症 に 伴 う 過 剰 な 炎 症 応 答 の 抑 制 に 寄 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

ま た 、 担 が ん マ ウ ス の 腫 瘍 に 放 射 線 を 局 所 照 射 し 、 が ん 細 胞 死 を 誘 導 す る と 、 腫 瘍

5. ELISA

眼 窩 静 脈 叢 あ る い は 顔 面 静 脈 か ら ヘ マ ト ク リ ッ ト 毛 細 管 で 採 取 し た 血 液 を 室 温 で 30 分 静 置 し た 後 、 5,000 rpm, 20℃ で 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 新 し い 1.5 mL tube へ 回 収 し た 。 回 収 し た 上 清 を 再 び 5,000 rpm, 20℃ , 5 分 遠 心 し 、 そ の 上 清 に 含 ま れ る IL-6 及 び TNFα 濃 度 を ELISA MAXT M _{Standard Kits（ BioLegend） を 用 い て 測 定 し た 。}

6. 組 織 の RNA 抽 出 及 び 定 量 PCR 解 析

マ ウ ス よ り 採 材 し た 肝 臓 、 肺 、 脾 臓 及 び 大 腸 を RNA later Stabilization Solution （Thermo Fisher Scientific） で 浸 漬 し 、 4℃ で 一 晩 保 存 し た 。 2.0 mL マ ス タ ー チ ュ ー ブ （ 株 式 会 社 バ イ オ メ デ ィ カ ル サ イ エ ン ス ） に buffer RLT（ Thermo Fisher Scientific） と 2-メ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル 混 合 液 （ 100:1 で 混 合 ） を 分 注 し 、 ス テ ン レ ス ビ ー ズ 5.0 mm

（ 株 式 会 社 バ イ オ メ デ ィ カ ル サ イ エ ン ス ）を 1 粒 入 れ た 。こ の チ ュ ー ブ に 5mm 角 に 切

断 し た 組 織 サ ン プ ル を 入 れ 、卓 上 型 ビ ー ズ 式 破 砕 機 シ ェ イ ク マ ン 6（ 株 式 会 社 バ イ オ

メ デ ィ カ ル サ イ エ ン ス ）で ホ モ ジ ナ イ ズ し た（4℃ 、3,800 rpm, 30 秒 間 x2 サ イ ク ル ）。

ホ モ ジ ナ イ ズ し た サ ン プ ル を 室 温 下 20,238xg で 3 分 間 遠 心 し 、 上 清 350 μL を 1.5 mL tube へ 回 収 し た 。 350 μL の 70% エ タ ノ ー ル と 上 清 を 混 合 し 、 FavorPrep Total RNA Extrraction Colum（ Favorgen） へ ア プ ラ イ し た 。 そ の 後 、 RNeasy Mini Kit（ Qiagen） を

用 い て RNA 抽 出 を 行 っ た 。抽 出 し た RNA 濃 度 を Nanodrop（ Thermo Fisher Scientific）

を 用 い て 測 定 し た 。

抽 出 し た RNA を 、 ReverTra Ace（ Toyobo） で 逆 転 写 し cDNA を 合 成 し た 。 逆 転 写 し

た cDNA を 鋳 型 に 、 THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（ TOYOBO） を 用 い て 定 量 PCR

解 析 を 行 っ た 。 標 的 遺 伝 子 の 発 現 レ ベ ル を 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル （18s rRNA） 遺 伝 子 発

現 レ ベ ル で 標 準 化 し た 。 使 用 し た プ ラ イ マ ー 配 列 は 表 1 に 示 す 。

7. 各 臓 器 に お け る 免 疫 細 胞 の 調 製

末 梢 血 、 骨 髄 1 7_{、 肺} 1 8_{、 大 腸} 1 9_{の 細 胞 は 先 行 文 献 に 示 さ れ て い る 手 順 に 従 っ て 調 製}

し た 。 肝 臓 は 、 小 剪 刃 で 細 か く 破 砕 し た 後 digestion mixture (100 μg/mL Liberase TM (Roche)/ 5 μg/ml DNase I (Sigma-Aldrich)/1xHBSS)を 加 え 、25 分 間 37℃ で 穏 や か に 振 盪 さ せ た 。 次 に 、 細 胞 浮 遊 液 を 70 μm Cell Strainer (BD Bioscience) で 濾 過 し た 。 300xg 4

分 間 遠 心 し 、 上 清 を 新 し い チ ュ ー ブ へ 移 し た 。 こ れ を 100xg 2 分 間 遠 心 し 非 免 疫 細 胞

を 除 去 し た 。 こ れ を 5 回 繰 り 返 し た 。 最 後 の 上 清 は 300xg 4 分 間 遠 心 し た 。 赤 血 球 を

除 去 す る た め に 、2 mL の 1xPharm Lyse (BD Bioscience) を 加 え 、 溶 血 処 理 を 行 っ た 。 脾 臓 は 小 剪 刃 で 4 分 割 し た 後 、 70 μm Cell Strainer で 濾 過 し 、 6 cm dish へ 入 れ た 。

赤 血 球 を 除 去 す る た め に 、2 mL の 1xPharm Lyse（ BD Bioscience） を 加 え 、 溶 血 処 理 を 行 っ た 。 8. 担 が ん マ ウ ス の 作 製 マ ウ ス に 麻 酔 を か け て 右 側 背 部 を 剃 毛 し た 。 メ ラ ノ ー マ 細 胞 株 B16F10 1×106 _cells を 200 µL の PBS に 懸 濁 し て マ ウ ス へ 皮 下 投 与 （ s.c.） し た 。 投 与 は 1 mL シ リ ン ジ (TERUMO)と 25 G 針 (TERUMO)で 行 っ た 。 9. 放 射 線 照 射 と 腫 瘍 径 測 定 麻 酔 を か け た 担 が ん マ ウ ス の 腫 瘍 に 10 Gy 放 射 線 を 局 所 照 射 し た （ faxitron x-ray corporation GP160、ア ク ロ バ イ オ 株 式 会 社 ）。特 殊 な 鉛 板 で マ ウ ス を 被 覆 し 、腫 瘍 の み に 放 射 線 が 照 射 さ れ る よ う に し た （図 5A）。 ノ ギ ス に よ っ て 腫 瘍 の 長 径 •短 径 •厚 み を 測 定 し 、 以 下 の 式 に 値 を 代 入 す る こ と で 腫 瘍 体 積 を 算 出 し た 。 V = (a × b × c) / 2 （ V : 体 積 、 a : 長 径 、 b : 短 径 、 c : 厚 み ） 10. TAM の 調 製 担 が ん マ ウ ス か ら 腫 瘍 を 摘 出 し 、 フ ェ ザ ー カ ミ ソ リ で ペ ー ス ト 状 に な る ま で ミ ン チ し た 。 ミ ン チ し た 細 胞 を Digestion medium（ 0.5 mg Liberase TM (Roche) / 40 μg DNase I (Sigma) / 4 mL RPMI serum free (Wako)） 4 mL に 懸 濁 し 、 37℃ , 50 rpm で 25 分 間 震 盪 し な が ら 酵 素 処 理 し た 。70 μm Cell Strainer（ BD Bioscience） で 、 残 存 し た 不 溶 組 織 片

を 除 去 し 、300xg で 4 分 間 、4℃ で 遠 心 し た 後 、上 清 を 除 去 し た 。MACS Running Buffer

（5% BSA / 2 mM EDTA / PBS）を 10 mL 加 え て ペ レ ッ ト を 洗 浄 し た 。1xPharm Lyse（ BD

Bioscience） で 、 赤 血 球 を 溶 血 し た 。

11. フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー

各 臓 器 よ り 調 製 し た 細 胞 を 300xg で 5 分 間 遠 心 分 離 し 、上 清 を 除 去 し た 。抗 体 が Fc

受 容 体 へ 非 特 異 的 に 結 合 す る の を 防 ぐ た め 、抗 CD16/32 抗 体 を 添 加 し 、氷 上 で 5 分 間

イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。次 に 蛍 光 標 識 抗 体 を 添 加 し 、氷 上 で 25 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。

FACS バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 後 、 1 µg/mL DAPI（ Dojindo） を 添 加 し た FACS バ ッ フ ァ ー に

懸 濁 し て 、 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 解 析 し た 。 使 用 し た 抗 体 の ク ロ ー ン お よ び メ ー カ ー 名 は 表 2 に 示 す 。

12. 血 液 生 化 学 検 査

し 、上 清 を 新 し い 1.5 mL tube へ 回 収 し た 。回 収 し た 上 清 を 再 び 5000 rpm, 20℃ , 5 分 遠

心 し 、尿 素 窒 素（BUN）、ク レ ア チ ニ ン（ Cre）、ア ル ブ ミ ン（ ALB）、総 た ん ぱ く（ TP）、

表 2, フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 使 用 し た 抗 体

Ly6G

1A8

Biolegend

CD45.2

104

Biolegend

NK1.1

PK136

Biolegend

CD19

6D5

Biolegend

Thy1.2

53-2.1

Biolegend

CD11b

M1/70

Biolegend

F4/80

BM8

Biolegend

CD64

X54-5/7.1

Biolegend

CD16/32

93

Biolegend

SiglecF

E50-2440

BD Bioscience

CD115

ASF98

Thermo Fisher Scientific

MHC classII

M5/114.15.2

Thermo Fisher Scientific

CD204

REA148

Miltenyi Biotech

REA control

REA-293

Miltenyi Biotech

Ly6C

CD11c

第

3

章 結 果

3-1. 生 体 内 に お け る CD204陽 性 細 胞 の 同 定

生 体 内 の ど の よ う な 免 疫 細 胞 が CD204 陽 性 で あ る か 明 ら か に す る た め 、生 体 内 の 主

要 な 臓 器 と 末 梢 血 の 免 疫 細 胞 に お け る CD204 発 現 を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で 解 析 し

た 。 定 常 状 態 の 末 梢 血 で は 、Ly6G 陰 性 , CD115 陽 性 , Ly6C 陽 性 の Ly6C 高 発 現 単 球 と Ly6G 陰 性 , CD115 陽 性 , Ly6C 陰 性 の Ly6C 低 発 現 単 球 に CD204 分 子 が 弱 く 発 現 し て い

た（図 1A）。同 様 に 骨 髄 で も Ly6C 高 発 現 単 球 お よ び Ly6C 低 発 現 単 球 に CD204 分 子 が 弱 く 発 現 し て い た（図 1B）。一 方 、末 梢 血 と 骨 髄 に お い て 、Ly６ G 陽 性 の 好 中 球 、CD19 陽 性 の B 細 胞 、NK1.1 陰 性 Thy1.2 陽 性 の T 細 胞 、NK1.1 陽 性 Thy1.2 陽 性 の NKT 細 胞 、 NK1.1 陽 性 Thy1.2 陰 性 の NK 細 胞 は CD204 陰 性 だ っ た （図 1A, B）。 こ の よ う に 、 組 織 へ 浸 潤 し マ ク ロ フ ァ ー ジ へ 分 化 す る 前 の 状 態 と さ れ る 単 球 で 、CD204 発 現 が 確 認 さ れ た 。次 に 、組 織 常 在 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る CD204 発 現 を 検 討 し た 。肝 臓 の Ly6G 陰 性, F4/80 陽 性 , CD11b 陽 性 の ク ッ パ ー 細 胞 、 大 腸 の Siglec-F 陰 性 , CD64 陰 性 , Ly6C

陽 性 の Ly6C 高 発 現 単 球 及 び CD64 陽 性 Ly6C 低 発 現 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 脾 臓 の Ly6C 高

能 か ど う か 、 フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に よ り 解 析 し た 。PBS を 投 与 し た CD204-DTR マ

ウ ス に 比 べ 、DT を 投 与 し た CD204-DTR マ ウ ス で は 、 骨 髄 及 び 末 梢 血 の Ly6C 高 発 現

単 球 と Ly6C 低 発 現 単 球 が 著 し く 減 少 し た（図 3A,C）。さ ら に 肝 臓 の ク ッ パ ー 細 胞 、大

腸 の Ly6C 高 発 現 単 球 及 び Ly6C 低 発 現 CD64 陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 脾 臓 の Ly6C 高 発

第

5

章 参 考 文 献

1. M. Singer, C. S. Deutschman, C. W. Seymour, M. Shankar-Hari, D. Annane, M. Bauer, R. Bellomo, G. R. Bernard, J. D. Chiche, C. M. Coopersmith, R. S. Hotchkiss, M. M. Levy, J. C. Marshall, G. S. Martin, S. M. Opal, G. D. Rubenfeld, T. van der Poll, J. L. Vincent, and D. C. Angus, The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3), JAMA 315 (2016) 801-810.

2. M. Cecconi, L. Evans, M. Levy, and A. Rhodes, Sepsis and septic shock, The Lancet 392 (2018) 75-87.

3. A. Sica, and A. Mantovani, Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas, J

Clin Invest 122 (2012) 787-795.

4. F. Ginhoux, and M. Guilliams, Tissue-Resident Macrophage Ontogeny and Homeostasis,

Immunity 44 (2016) 439-449.

5. T. A. Wynn, and K. M. Vannella, Macrophages in Tissue Repair, Regeneration, and Fibrosis, Immunity 44 (2016) 450-462.

6. C. D. Mills, K. Kincaid, J. M. Alt, M. J. Heilman, and A. M. Hill, M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm, J Immunol 164 (2000) 6166-6173.

7. S. Gordon, and F. O. Martinez, Alternative activation of macrophages: mechanism and functions, Immunity 32 (2010) 593-604.

8. J. L. Goldstein, Y. K. Ho, S. K. Basu, and M. S. Brown, Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition, Proc Natl Acad Sci U S A 76 (1979) 333-337.

9. J. L. Kelley, T. R. Ozment, C. Li, J. B. Schweitzer and D. L. Williams, Scavenger Receptor-A (CD204): A Two-Edged Sword in Health and Disease, Crit Rev Immunol 34 (2014) 241-261.

10. J. G. Quatromoni and E. Eruslanov, Tumor-associated macrophages: function, phenotype, and link to prognosis in human lung cancer, Am J Transl Res 4 (2012) 376-389.

11. L. Cassetta and T. Kitamura, Targeting Tumor-Associated Macrophages as a Potential Strategy to Enhance the Response to Immune Checkpoint Inhibitors, Front. Cell Dev

Biol. 6 (2018)

12. Y. Miyasato, T. Shiota, K. Ohnishi, C. Pan, H. Yano, H. Horlad, Y. Yamamoto, M. Yamamoto-Ibusuki, H. Iwase, M. Takeya, and Y. Komohara, High density of CD204-positive macrophages predicts worse clinical prognosis in patients with breast cancer, Cancer Sci 108 (2017) 1693-1700.

Ohta, N. Ishiguro, M. Yamauchi, M. Sakamoto, T. Maehara, J. N. Hayashida, S. Kawano, T. Kiyoshima, and S. Nakamura, CD163(+)CD204(+) tumor-associated macrophages contribute to T cell regulation via interleukin-10 and PD-L1 production in oral squamous cell carcinoma, Sci Rep 7 (2017) 1755.

14. G.B. Fogarty, A. Hong, R. A. Scolyer, E. Lin, L. Haydu, P. Guitera, and J. Thompson, Radiotherapy for lentigo maligna: a literature review and recommendations for treatment, Br J Dermatol 170 (2014) 52-58.

15. W. H. Ward and J. M. Farma, Cutaneous Melanoma: Etiology and Therapy, Chapter 8 Radiation Therapy for Melanoma

16. J. Xu, J. Escamilla, S. Mok, J. David, S. Priceman, B. West, G. Bollag, W. McBride and L. Wu, CSF1R Signaling Blockade Stanches Tumor-Infiltrating Myeloid Cells and Improves the Efficacy of Radiotherapy in Prostate Cancer, Cancer Res 73 (2013) 2782-2794.

17. N. Ikeda, K. Asano, K. Kikuchi, Y. Uchida, H. Ikegami, R. Takagi, S. Yotsumoto, T. Shibuya, C. Makino-Okamura, H. Fukuyama, T. Watanabe, M. Ohmuraya, K. Araki, G. Nishitai, and M. Tanaka, Emergence of immunoregulatory Ym1(+) Ly6C(hi) monocytes during recovery phase of tissue injury, Sci Immunol 3 (2018).

18. R. N. Hanna, C. Cekic, D. Sag, R. Tacke, G. D. Thomas, H. Nowyhed, E. Herrley, N. Rasquinha, S. McArdle, R. Wu, E. Peluso, D. Metzger, H. Ichinose, I. Shaked, G. Chodaczek, S. K. Biswas, and C. C. Hedrick, Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung, Science 350 (2015) 985-990.

19. K. Asano, N. Takahashi, M. Ushiki, M. Monya, F. Aihara, E. Kuboki, S. Moriyama, M. Iida, H. Kitamura, C. H. Qiu, T. Watanabe, and M. Tanaka, Intestinal CD169(+) macrophages initiate mucosal inflammation by secreting CCL8 that recruits inflammatory monocytes, Nat Commun 6 (2015) 7802.

20. M. P. Fink, Animal models of sepsis, Virulence 5 (2014) 143-153.

21. A. J. Lewis, C. W. Seymour, and M. R. Rosengart, Current Murine Models of Sepsis,

Surg Infect (Larchmt) 17 (2016) 385-393.

22. K. E. Rudd, S. C. Johnson, K. M. Agesa, K. A. Shackelford, D. Tsoi, D. R. Kievlan, D. V. Colombara, K. S. Ikuta, N. Kissoon, S. Finfer, C. F. Struzek, F. R. Machado, K. K. Reinhart, K. Rowan, C. W. Seymour, R. S. Watson, T. E. West, F. Marinho, S. I. Hay, R. Lozano, A. D. Lopez, D. C. Angus, C. J. L. Murray and M. Naghavi, Global, regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study, The Lancet 395 (2020) 200-211.

Diagnostic and prognostic value of interleukin-6, pentraxin 3, and procalcitonin levels among sepsis and septic shock patients: a prospective controlled study according to the Sepsis-3 definitions, BMC Infect Dis 19 (2019) 968.

24. T. Shimazui, Y. Matsumura, T. A. Nakada, and S. Oda, Serum levels of interleukin-6 may predict organ dysfunction earlier than SOFA score, Acute Med Surg 4 (2017) 255-261.

25. M. W. Marino, A. Dunn, D. Grail, M. Inglese, Y. Noguchi, E. Richards, A. Jungbluth, H. Wada, M. Moore, B. Williamson, S. Basu, and L. J. Old, Characterization of tumor necrosis factor-deficient mice, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997) 8093-8098. 26. S. Honda, K. Sato, N. Totsuka, S. Fujiyama, M. Fujimoto, K. Miyake, C.

Nakahashi-Oda, S. Tahara-Hanaoka, K. Shibuya, and A. Shibuya, Marginal zone B cells

exacerbate endotoxic shock via interleukin-6 secretion induced by

Fcalpha/muR-coupled TLR4 signalling, Nat Commun 7 (2016) 11498.

27. W. Schulte, J. Bernhagen, and R. Bucala, Cytokines in sepsis: potent immunoregulators and potential therapeutic targets--an updated view, Mediators Inflamm 2013 (2013) 165974.

28. M. Hashizume, and M. Mihara, Blockade of IL-6 and TNF-alpha inhibited oxLDL-induced production of MCP-1 via scavenger receptor induction, Eur J

Pharmacol 689 (2012) 249-254.

29. G. V. Limmon, M. Arredouani, K. L. McCann, R. A. Corn Minor, L. Kobzik, and F. Imani, Scavenger receptor class-A is a novel cell surface receptor for double-stranded RNA, FASEB J 22 (2008) 159-167.

30. S. J. DeWitte-Orr, S. E. Collins, C. M. Bauer, D. M. Bowdish, and K. L. Mossman, An accessory to the 'Trinity': SR-As are essential pathogen sensors of extracellular dsRNA, mediating entry and leading to subsequent type I IFN responses, PLoS Pathog 6 (2010) e1000829.

31. T. Singhal, A Review of Coronavirus Disease-2019 (COVID-19), I n d i a n J P e d i a t r 87 (2020) 281-286.

32. T. Hirano and M. Murakami, COVID-19: A New Virus, but a Familiar Receptor and Cytokine Release Syndrome, Immunity 52 (2020) 731-733.

33. The RECOVERY Collaborative Group, Dexamethasone in Hospitalized Patients with Covid-19 — Preliminary Report, N Engl J Med (2020) oa2021436.

Early use of low dose tocilizumab in patients with COVID-19: A retrospective cohort study with a complete follow-up, EClinicalMedicine 25 (2020) 100459.

35. 令 和 元 年 （ 2019） 人 口 動 態 統 計 月 報 年 計 （ 概 数 ） の 概 況 、 厚 生 労 働 省

36. C. H. Ries, M. A. Cannarile, S. Hoves, J. Benz, K. Wartha, V. Runza, F. Rey-Giraud, L. P. Pradel, F. Feuerhake, I. Klaman, T. Jones, U. Jucknischke, S. Scheiblich, K. Kaluza, I. H. Gorr, A. Walz, K. Abiraj, P. A. Cassier, A. Sica, C. Gomez-Roca, K. E. de Visser, A. Italiano, C. L. Tourneau, J. P. Delord, H. Levitsky, J. Y. Blay and D. Rüttinger, Targeting Tumor-Associated Macrophages with Anti-CSF-1R Antibody Reveals a Strategy for Cancer Therapy, Cancer Cell 25 (2014) 846-859.

37. Y. Lin, J. Xu and H. Lan, Tumor-associated macrophages in tumor metastasis: biological roles and clinical therapeutic applications, J Hematol Oncol 12 (2019) 38. L. Deng, H. Liang, B. Burnette, M. Beckett, T. Darga, R. R. Weichselbaum and Y. X. Fu,

図 表

図 1

Peripheral blood (DAPI

_CD45.2

₎

Peripheral blood (DAPI

_CD45.2

₎

Spleen (DAPI

_CD11b

₎

CD11b

CD64

CD1

1c

CD1

1c

CD64

MH

C

II

CD204

%

o

f Ma

x

R1

93.2

R2

3.09

R1 (AM)

R2 (IM)

Lung (DAPI

₎

Ly6G

Ly6

C

CD115

Ly6

C

CD204

R1 (Neu)

R2 (Ly6C

_{Mo) R3 (Ly6C}

_Mo)

（図 1 続 き ）

Bone marrow (DAPI

_CD45.2

₎

Bone marrow (DAPI

_CD45.2

₎

Spleen (DAPI

_CD11b

₎

CD11b

CD64

CD1

1c

CD1

1c

CD64

MH

C

II

CD204

%

o

f Ma

x

R1

93.2

R2

3.09

R1 (AM)

R2 (IM)

Lung (DAPI

₎

Ly6G

Ly6

C

CD115

Ly6

C

CD204

R1 (Neu)

R2 (Ly6C

_{Mo) R3 (Ly6C}

_Mo)

（図 1 続 き ）

SSC-A

F4/80

CD1

1b

Ly6

G

CD204

%

o

f Ma

x

R1

3.99

R2

4.68

R1 (Neu)

R2 (KC)

Liver (DAPI

_CD45.2

₎

Siglec-F

CD64

Ly6

C

SSC

-A

CD204

%

o

f Ma

x

R2

3.35

R3

60.0

R1

22.5

R1 (Eos)

R2 (Mo)

R3 (Mφ)

Colon (DAPI

_CD11b

₎

Ly6G

CD115

Ly6

C

Ly6

C

CD204

%

o

f Ma

x

R1

25.0

R2

14.9

R3

10.2

R1 (Neu)

R2 (Ly6C

_{Mo) R3 (Ly6C}

_Mo)

図 1, 生 体 内 に お け る CD204 陽 性 細 胞 の 分 布

末 梢 血 （A）、 骨 髄 （ B）、 主 要 組 織 （ C） の フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 。 ヒ ス ト グ ラ ム

の 赤 い 波 形 は 抗 CD204 抗 体 、青 い 波 形 は ア イ ソ タ イ プ コ ン ト ロ ー ル 抗 体 で 各 々 染 色 し

図 2, CD204-DTR マ ウ ス の 作 製

（A）CD204-DTR マ ウ ス の targeting construct。CD204 遺 伝 子 は 黒 い 四 角 で 示 し た 。hDTR、

FRP 配 列 に 挟 ま れ た ネ オ マ イ シ ン 耐 性 遺 伝 子（ Neo）、チ ミ ジ ン キ ナ ー ゼ（ TK）は 白 い 四 角 で 示 し た 。 サ ザ ン ブ ロ ッ ト に 用 い た プ ロ ー ブ は ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン す る 部 分

に 実 線 で 示 し た 。（B） サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 。 マ ウ ス ES ゲ ノ ム を BamHI で 制 限 酵 素 処

理 し 、targeting construct に 図 示 し た プ ロ ー ブ で 検 出 し た 。（+/+）は 野 生 型 、（+/CD204D T R_）

図 3

SiglecF

SSC

-A

CD64

Ly6

C

SiglecF

SSC

-A

CD64

Ly6

C

Peripheral blood (DAPI

_CD45.2

₎

Eos

10.5

_Mo

2.39

Mφ

68.9

Eos

14.1

_Mo

1.49

Mφ

8.43

Bone marrow (DAPI

_CDCD45.2

₎

Peripheral blood (DAPI

_CD45.2

₎

DT

-DT

DT

-DT

Ly6

C

Ly6

C

Ly6

C

Ly6

C

Ly6G

CD115

Ly6G

CD115

Neu

16.6

Ly6C

_Mo

5.87

Ly6C

_Mo

1.21

Neu

21.3

Ly6C

_Mo

0.16

Ly6C

_Mo

0.070

CD19

SSC

-A

NK1.1

T

hy1

.2

CD19

SSC

-A

NK1.1

T

hy1

.2

B

47.5

T

58.4

NKT

2.02

NK

3.34

B

34.9

T

47.9

NKT

0.62

NK

2.32

CD19

SSC

-A

NK1.1

T

hy1

.2

CD19

SSC

-A

NK1.1

T

hy1

.2

B

60.2

T

13.9

NKT

2.79

NK

1.34

B

56.9

T

12.8

NKT

2.34

NK

2.13

A

D

B

Ly6G

Ly6

C

CD115

Ly6

C

Ly6G

Ly6

C

CD115

Ly6

C

Neu

37.4

Ly6C

_Mo

14.6

Ly6C

_Mo

1.9

Neu

40.5

Ly6C

_Mo

0.72

Ly6C

_Mo

0.00816

Bone marrow (DAPI

_CD45.2

₎

C

PB Myeloid

BM Myeloid

図 4 pre 2h 4h 16h 24h 0 500 1000 1500

IL-6 time corse

WT CD204-DTR ng/ m l 2h * 4h **** 16h **** 2way ANOVA

pre

2h

4h

_16h

_24h

1500

1000

500

0

ng

/ml

*

****

****

TNFa time corse

WT CD204-DTR ng/ m l 2h **** 2way ANOVA

pre

2h

4h

_16h

_24h

3000

2000

1000

0

4000

pg

/ml

****

IL-6

TNFa

Days after LPS injection

Log-rank (Mantel-Cox) test p value 0.0179* * Percentage of Survival

Days

0

1

2

3

4

5

6

7

0

100

25

75

50

Su

rv

iv

al

(%

)

*

WT

CD204-DTR

Days after LPS injection

Log-rank (Mantel-Cox) test p value 0.0307*

*

WT

CD204-DTR

TNFa time corse

WT CD204-DTR

ng/

m

l

2h ****

WT

CD204-DTR

A

B

C

Day 1 Day 2 Day 5 CD204-DTR

(+PBS, +LPS) 4/4 4/4 4/4 CD204-DTR

(+DT, +LPS) 0/3 0/3 0/3

（図 4 続 き ） pre 2h 4h 16h 24h 0 1000 2000 3000 4000

TNFa time corse

WT CD204-DTR

ng/

m

l

2h ****

WT

CD204-DTR

D

Liver Lung_Spleen_Colon Liver Lung_Spleen_Colon *

*

* IL-6 TNFα

Liver Lung _{Spleen Colon} 0 20 40 60 80 Re la tiv e E xp re ss io n WT CD204-DTR IL-1b 各臓器におけるWT及びCD204-DTRで

Mann-Whitneyとstudent t-testの両方で検定したが、 有意差はなかった。 ただし、Naiveマウスを1としているので、炎症状態ではIL-1b も上昇するようだ。 R el ati ve Ex p re ss io n 60 40 20 0

（図 5 続 き ） 0 6 8 _{11 14 17 20} 0 1000 2000 3000 WT CD204-DTR

WT vs CD204-DTR mice Rad+(d6) DT+ tumor growth

tu

m

o

r g

ro

w

th

(

m

m

^3

)

days after tumor innoculation

Two-way ANOVA multiple comparisons

d17=*

d20=****

symbol size =5

WT:N=6

CD204-DTR N=6

S.D.

3000

2000

0

1000

0

6

8

11

14 17 20

tu

m

o

r

vo

lu

m

e

(m

m

^3

)

days after tumor inoculation

0 6 8 _{11 14 17 20} 0 1000 2000 3000 WT CD204-DTR

WT vs CD204-DTR mice Rad+(d6) DT+ tumor growth

tu

m

or

g

ro

w

th

(

m

m

^3

)

days after tumor innoculation

Two-way ANOVA multiple comparisons

d17=*

d20=****

symbol size =5

WT:N=6

CD204-DTR N=6

S.D.

WT vs CD204-DTR mice Rad+(d6) DT+ tumor growth

tu

m

or

g

ro

w

th

(

m

m

^3

)

days after tumor innoculation

図 5, が ん の 進 展 に お け る CD204 陽 性 細 胞 の 役 割

（A） 左 は タ イ ム コ ー ス を 示 す 。 B16F10 を 皮 下 移 植 し た 日 を day0（ d0） と し た 。 7 日

後 に 放 射 線 照 射 （Radiation : Rad） を 行 っ た 。 DT 投 与 は ▲ で 示 し た タ イ ミ ン グ で 投 与 し た 。 右 は 担 が ん マ ウ ス の 腫 瘍 へ 放 射 線 を 局 所 照 射 す る 模 式 図 を 示 す 。 腫 瘍 以 外 を 鉛

版 （Lead plate） で 遮 蔽 す る こ と で 被 爆 を 防 止 し た 。（ B） 腫 瘍 内 の TAM サ ブ セ ッ ト の

図 6 0 5 10 15 20 0 25 50 75 100

Survival of B16 irradiation

WT

CD204-DTR

Days

su

rvi

va

l (

%

)

log rank test p=0.0312 *

0

5

10

15

20

0

100

25

75

50

*

Days after LPS injection

Log-rank (Mantel-Cox) test p value 0.0307* * Pe rc e n ta g e o f Su rv iv a l WT CD204-DTR

days after tumor inoculation

（図 6 続 き ）

C

Cre (mg/dL) ALB (g/dL) TP (g/dL) ALT (U/L) TCHO (mg/dL)

Naïve #1 19.8 0.6 2.4 6.9 27 78 Naïve #2 14.1 0.6 2.1 6.3 24 63 WT #3 23.1 0.6 1.8 6 75 75 WT #4 142.2 0.6 0.9 4.5 312 66 WT #7 21 0.6 1.8 6 108 78 CD204-DTR #1 46.8 0.6 1.2 4.8 66 66 CD204-DTR #2 96.9 0.9 0.9 4.2 111 60

HDLC (mg/dL) TG (mg/dL) AMYL (U/L) ALP (U/L) CPK (U/L)