著者
水野 健作
LIMキナーゼl三よるアクチン細胞骨格の
制御機構の解明
･(課題番号1 1480213)平成1 1年度∼平成1 2年度科学研究費補助金
基盤研究(B)(2)研究成果報告書
平成1 3年3月
研究代表者 水野健作
(東北大学大学院理学研究科教授)
00021005272はし_がき 平成1 1年度∼平成1 2年度の2年間､ ｢LIMキナーゼによるアクチン細胞
骨格の制御機構の解明｣という研究課題で､科学研究費補助金を受け､研究を
行った｡この2年間は､研究代表者の水野が､九州大学理学部から東北大学大
学院理学研究科へ移動した最初の2年間であり､本補助金は､移転に伴う研究
設備や試薬の不足を補い､本研究課題を遂行していくうえで､極めて有効であ
った｡成果報告にあたり､まず謝意を表したい｡
細胞外刺激に感応した細胞骨格系のダイナミックな再構築は､細胞の形態変
化､運動､分裂など細胞の基本活動において重要な役割を果たしているが､そ
の応答機構の多くは不明である.私達は､ uMキナーゼと命名した新しいクラ
スのプロテインキナーゼ群(LIMKlおよびLIMK2)を発見し､ LIMKlがRacの下流因子として､アクチン脱重合因子コフイリンのSer-3を特異的にリン酸
化することを明らかにし､アクチン細胞骨格の制御におけるRacーLIMKl-コ
フイリンというシグナル伝達経路の存在をはじめて明らかにした｡本研究では､
LIMキナ-ゼおよびその類縁キナーゼであるTESKlを介したアクチン細胞骨
格制御の分子機構を解明することを目的として､ LIMK, TESKの上流･下流因子の同定､活性化の分子機構の解明､さらに､神経回路の形成過程における
LIMKlの機能の解明を目指した｡LIMキナーゼを介した細胞骨格制御機構の解明は､細胞外シグナルをアクチ
ン骨格の再構築の制御に直接結び付けるシグナル伝達経路を解明する上できわ
めて重要であると考えられる｡また､ LIMKlの遺伝子欠矢はウイリアムス症候
群に見られる視覚性空間認知障害の原因であることが示唆されてかノ､神経細
胞におけるLIMKlの機能解明は､高次神経機能の発現と障害の分子機構の解明
につながる重要な課題である｡
研究組織
研究代表者:水野 健作 (東北大学大学院理学研究科･教授)
研究協力者:大橋丁正､十島二朗､大橋恭子､西田 満､
天野 徹､十島純子
研究軽費
平成1 1年度平成1 2年度
円 円 千千 0 0 0 0 4 7 1 ' 8 5 計研究発表
14, 100千円 (* :本報告書に掲載した論文)(1)学会誌等
*1. Yang, N.,and Mizuno, KI Nuclear export of LIM-kinase 1, mediated by two
leucine-rich nuclear export slgnals within the PDZ domain･ Biochem･ J･, 338,
793-798(1999)
*2. Toshima, J., Tanaka, T.,and Mizuno, K. DualSpecificity protein kinase activity of
testis-specific protein kinase land its regulation by autophosphorylation of serine-215 within血e activation loop. ∫. Biol. Chem., 274, 12171-12176 (1999)
*3. Maekawa, M., lshizaki, T., Boku, S., Watanabe, N., Fujita, A., Iwamatsu, A., Obinata, T., Ohashi, K., Mizuno. K., and Narumiya, S. Signaling from Rho tothe actin cytoskeleton through protein kinases ROCKand LIM-kinase. Science, 285,
895-898 (1999)
*4. Nagata, K., Ohashi, K., Yang, N.,and Mizuno- K･ The N-teminalLM domain
negatively regulates the kinase actlVlty Of LM-kinase l･ Biochem･ J･, 343, 99-105
(1999)
5. Yanagita, M., Ishii, K., Ozaki, H., Arai, H., Nakano, T., Ohashi, K., Mizuno･ K･, Kita, T., and Doi, T. Mechanism of inhibitory effect of warfarin on mesangialcell
proliferation. J. Am. Soc. Nephro1., 10, 250312509 (1999)
6･ Kumar, C･C" Ohashi, K･, Nagata, K., Walsh, A., Bar-Sagi, D., Mizuno. K. SCH
51344, an inhibitor of RASARAC-mediated cell morphology pathway･ Ann･ N･ Y･
Acad. S°i., 886, 122-131 (1999)
*7･ Ohashi, K･, Nagata, K･, Maekawa, M･, Ishizaki, T･, Narumiya, S･,and Mizuno, K･
Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at
threonine-508 within the activation loop. J. Biol. Chem., 275, 3577-3582 (2(X氾)
8･ Wakayama, T･･ Nagata, K･, Ohashi, K･, Mizuno, K" Tanii, I･, Yoshinaga, K･,
Oh-oka, T･, and Toshimori, K･ The expressionand cellularlocalization of the sperm
flagellarprotein MC31/CE9 in the rat testis: possible post-transcnptional
regulation during rat spemiogenesis. Arch. Histol. Cytol, 63, 33-41 (20W)
9･ Ishimoto, Y･, Ohashi, K･, Mizuno･ K"and Nakano, T･ Promotion of the uptake of
phosphatidylserine liposomesand apoptotic cells by a product of growth
arrest-specific gene, gas6. J. Biochem., 127, 41 11417 (2(X氾)
*10･ Bito H" Furuyashiki, T･, Ishihara, H･, Shibasaki, Y･, Ohashi, K., Mizuno, K.,
Maekawa, M･, Ishizaki, T･,and Narumlya, S･ A critical role for a Rho-associated
kinase, pl60ROCK, in determlnlng aXOn Outgrowth in mammalian CNS neurons.
Neuron, 26, 43 1-441 (2(X氾)
*11･ Ohashi, K･･ Hosoya･ T･･ Takal1aShi, K･, Hing, H･, and Mizuno, K･ A Drosophila
LIM-kinase phosphorylates cofilinand induces actin cytoskeletalreorganization･
Biochem･ Biophys. Res. Commun., 276, 1 178-1 185 (2∝X))
*12･ Aman0, T･, Tanabe, K･, Eto, T･, Narumiya, S･, and Mizuno, K. LIM-kinase 2
induces the formation of actin stress fibers, focaladhesionsand membrane blebs,
dependent on its activation by Rho-associated kinase-catalyzed phosphorylation
of threonine-505. Biochem. J., 354, 149-159 (2001)
13･ Yanagita, M･, Arai, H., Ishi, K., Ozaki, H., Nakan0, T., Ohashi, K., Mizuno. K., Varnum, B･, Fukatsu, A･, Doi, T･,Kita, T･ Gas6 regulates mesangial ceu
press, (2001)
*14･ Toshima･ J･･ Toshima, J･ Y･, Amano, T･, Yang, N･, Narumiya, S" and Mizuno, K･
Cofilin phosphorylation by-protein kinase TESKland its role inintegnn-mediated
actin remodeling. Mol. Biol. Cell, in press, (2001)
15･ Aizawa, H･, Wakatsuki, S･, Ishii, A･, Moriyama, K･, Sasaki, Y･, Ohashi, K.,
Sehara-Fujisawa, A･, Mizuno, K･, Goshima, Y･, and Yahara, I. Phosphorylation of cofilin by LIM kinase is necessary for semaphorin 3A-induced growth cone
collapse･ Nature Neurosci., in press, (2001 )
(2)出版物(和文総説､著書)
*1.水野健作:LJMキナーゼによるコフイリンのリン酸化とアクチン細胞骨
格の制御,生化学(ミニレビュー) , 71 (5),345-350(1999)*2.大橋一正､水野健作:LJMキナーゼとコフイリンリン酸化,実験医学増
刊｢シグナル伝達総集編｣ , 17 (14), 1774-1780(1999)3.大橋恭子､水野健作:Gas6:カルポキシグルタミン酸をもつ細胞増殖国
子,化学と生物, 37 (10), 637｣639 (1999)4.水野健作､松尾寿之:ペプチジルグリシンモノオキシゲナーゼ(C末端
アミド化酵素) , ｢広川タンパク質化学 第4巻 酵素｣,野崎､折井､ 指吸編,広川書店, pp.305-311 (2000)5.十島二朗､水野健作:動物細胞での発現, ｢基礎生化学実験法 第3巻 タ
ンパク質Il.機能･動態解析法｣ ,日本生化学会鼠東京化学同人
印刷中(2001)6･水野健作:血管平滑筋細胞増殖促進因子Gas6. ｢VascuJar Biologyナ ビゲーター｣ ,丸山征郎他編,メディカルレビュー社,印刷中(2001)
7.十島二朗､水野健作:細胞骨格制御におけるLIMK/TESKファミリーと
コフイリンの機能, ｢細胞の形づくり｣ ,高井義美他編,全芳堂,印刷
(3)口頭発表
1.水野健作:細胞骨格制御におけるLIMキナーゼの役割.さきがけ研究2 1
｢遺伝と変化｣領域合同東西分科会.沖縄. 1999年7月1日
2.水野健作:神経ペプチド研究から細胞生物学へ.若手ペプチド夏の勉強会.
鳴子. 1999年7月23日3.十島二朗､水野健作:精巣に高発現するプロテインキナーゼTESKlのア
クチン骨格系における役割.日本細胞生物学会第52回大会.東京大学. 1999 年8月28日 4.大橋一正､大橋一永田恭子､水野健作: uM-kinase lのアクチン骨格の再構築における機能ドメインの解析.日本細胞生物学会第52回大会.東衷大
学. 1999年8月28日 5.大橋一永田恭子､大橋-正､水野健作: LIM-kinase lのuMドメインによるキナ-ゼ活性の調節.日本生化学会第72回大会.横浜. 1999年10月8
日 6.大橋一正､大橋一永田恭子､水野健作: LIM-kinase lのリン酸化による活性化機構.日本生化学会第72回大会.横浜. 1999年10月8日
7.十島二朗､田中智子､水野健作:精巣に高発現するプロテインキナ-ゼ
TESKlのdual specificな活性とSerl215の自己リン酸化による活性制御.日本生化学会第72回大会.横浜. 1999年10月8日
8.石本義和､中野亨､大橋一正､水野健作:Gas6によるマクロファージの箕
食増強作用.日本生化学会第72回大会.横浜. 1999年10月8日
9.水野健作:空間認知に関わる情報伝達分子.さきがけ研究2 1 ｢遺伝と変
化｣領域第6回領域会議.大阪. 1999年10月27日
10.水野健作:アクチン細胞骨格の再構築におけるLIMキナーゼの役割.日本
分子生物学会第22回年会.福岡. 1999年12月7日
ll.前川みどり､石崎敏理､渡連直樹､大橋一正､水野健作､成宮周:低分子
量G蛋白質Rhoによるアクチン細胞骨格系の制御.日本分子生物学会第22
回年会.福岡. 1999年12月9日12.大橋一正､永田恭子､前川みどり､石崎敏理､成宮周､水野健作: ROCK
によるLIMキナーゼ1のThr-508のリン酸化と活性化.日本分子生物学会
第22回年会.福岡. 1999年12月9日13.天野徹､田辺和代､大橋恭子､水野健作:アクチン骨格再構築におけるuMK2
の機能とTPAによる活性化.日本分子生物学会第22回年会.福岡. 1999
年12月9日14.十島二朗､十島純子､水野健作:精巣に高発現するプロテインキナーゼ
TESKlのアクチン骨格系における役割.日本分子生物学会第22回年会.
福岡. 1999年12月9日15.十島純子､十島二朗､水野健作:トランスジェニックマウスを用いたプロ
テインキナーゼTESKlの発現解析.日本分子生物学会第22回年会.福岡.
1999年12月9日1 6. Mizuno, K., Ohashi, K., Nagata, K., Maekawa, M., Ishizaki, T.,and Narumiya, S.:
Activation of LIM-kinase by Rho-associated kinase (ROCK)-catalyzed
phosphorylation. me 39thAnnualMeeting of the American Society for Cell
Biology, Washington, D.C., USA, December 1 1-15, 1999.
17.大橋一正､細谷俊彦､高橋和也､水野健作: DrosophiJa LJMキナーゼによ
るコフイリンのリン酸化と歴におけるin situ localization.日本生化学会第
73回大会.横浜. 20m年10月12日
18.十島二朗､十島純子､竹内和秀､水野健作:精巣に高発現するTESKlの
新規なファミリー蛋白質TESK2の同定とアクチン骨格における役割.日
本生化学会第73回大会.横浜. 20∞年10月12日
19.十島二朗､十島純子､水野健作:プロテインキナーゼTESKlによるアク
チン脱重合国子コフイリンのリン酸化とインテグリン経路における役割.
日本細胞生物学会第53回大会.福岡. 2000年10月31日
20.十島純子､十島二朗､水野健作: 14-3-3bのプロテインキナーゼTESKl
への結合と活性制御.日本細胞生物学会第53回大会.福岡. 2000年10
月31日21.藍漂広行､若月修二､石井愛､森山賢治､佐々木幸生､大橋一正､藤沢淳
子､水野健作､五嶋島部､矢原一郎:リムキナーゼによるコフイリンのリ
ン酸化は､セマフォリン3Aによる神経成長円錐の葉状突起崩壊に必要で
ある.日本細胞生物学会第53回大会.福岡. 2000年11月2日
_32･十島純子､十島二朗､水野健作: TESKlの14-3-'3bへの結合およびそのインテグリン経路における役割.日本分子生物学会第23回年会.神戸. 20∞
年12月15日23.大橋一正､細谷俊彦､高橋和也､水野健作:ショウジョウバエuMキナー
ゼのcDNAクローニングと機能解析､発現分布.日本分子生物学会第23
回年会.神戸. 2000年12月15日24. Toshima, J., Toshima, J. Y., and Mizuno. K: Cofilin phosphorylation by protein
kinase TESKland its role in integnn-mediated actin remodeling. The 40thAnnual
Meeting of the American S∝iety f♭r Cell Biology, Sam Francisco, USA, December
研究成果
私達は､分子内にLIMドメインをもつ新しいクラスのプロテインキナーゼ群(LIM
キナ-ゼ:LJMKlおよびLIMK2)を発見し､ uMKlがRacの下流因子として､アクチン脱重合因子コフイリンのSer-3を特異的にリン酸化することを明らかにし､
アクチン細胞骨格の制御におけるRac-LIMKl-コフイリンというシグナル伝達経路の存在をはじめて明らかにした｡本研究では､ LIMキナーゼ群およびその類縁キ
ナーゼであるTESKを介したアクチン細胞骨格制御の分子機構を解明することを
目的として､これらのキナ-ゼの上流･下流因子の同定､活性化の分子機構の解
明を進める｡さらに､神経回路の形成過程におけるLIMKlの機能を解明すること
を目的とする｡ LIMKlを介した細胞骨格制御機構の解明は､細胞外シグナルをア
クチン骨格の再構築の制御に直接結び付けるシグナル伝達経路を解明する上でき
わめて重要である｡また､ LIMKlの神経細胞における機能解明は､空間認知障害
という特徴的な症状のヒト遺伝病の病因解明につながる重要な課題である｡この
2年間の研究期間に得た主な成果は以下の通りである｡
1 ) LIMKlの限定分解や､変異体のキナ-ゼ活性の測定､ in vitro結合実験などから､uMドメインは､キナ-ゼドメインと分子内で直接相互作用することによって､
LIMKlの活性を負に制御していることを明らかにした｡細胞内では､ LIMドメイン結合蛋白質が活性化因子として機能している可能性が考えられる｡
2) LIMKlの神経突起伸展･退緬における機能を明らかにするため､ NI〔-115神経芽細胞腫に野生型､キナーゼ不活性型LIMKlを導入した｡その結果､キナーゼ
不活性型は､血清や活性型Rhoによる神経突起退鮪を阻害することを見出した｡
また､小脳頼粒細胞において､ ROCKによる軸索形成の減少がLIMKlのキナ-ゼ 不活性型により抑制されることを明らかにした｡これらの結果は､ LIMKlが､ Racだけでなく､ Rhoの下流因子としても機能し､神経突起の形成や退縮過程に関与
することを示唆している(京大､成宮らとの共同研究) 0
3) LIMKlは､ Rhoの下流で働くセリン･スレオ二ンキナーゼROCK(Rho-kinase)により､キナーゼドメイン活性化ループ内のThr-508が特異的にリン酸化される
ことによって､活性化されることを見出した｡この結果､ LIMKlは､ Rac-PAK経
路とRho-ROCK経路によって活性化され､アクチン細胞骨格の再構築を制御して
いることが示唆された｡
4) LIMKl と同様に､ LIMK2も､ pAKとROCKによってキナーゼドメイン活性
化ループ内のThr-505のリン酸化によって､活性化されることを明らかにした｡
また､ LlMK2がコフイリン/ADFのリン酸化を介してストレスファイバーや膜泡
の形成や接着斑の形成に関与することを明らかにした｡
5) TESKlはLIMKと同様にコフイリンのSer-3をリン酸化し､細胞に高発現さ
せると､ストレスファイバーの形成､接着斑の形成などアクチン骨格の再構築が
誘導されることを兄い出した｡ TESKlはLIMKとは異なり､ ROCK､ PAKによっ
て活性化されないが､インテグリンシグナルによって活性化されることを兄い出
した｡ 6)ハエのLIMKを同定し､アクチン再構築を促進することを見出し､ LIMK経路が無脊椎動物においても保存されていることを明らかにした｡
7)脊髄後根神経節細胞のセマフォリン3Aによる突起退縮において､ LIMKに
よるコフイリンのリン酸化経路が重要な役割を果たしていることを解明した
(臨床研､藍沢らとの共同研究) 0これらの成果は､ LIMK/TESK経路が細胞骨格の制御を介して多くの細胞機
能に重要な役割を果たしていることを明確に示している｡今後はこれらの成果
に基いて､ LIMK/TESK経路の時間的空間的制御機構ならびに細胞の形態と運動性の制御における役割を解明し､神経回路形成､歴発生､器官形成､白血球
遊走や癌細胞の浸潤･転移などの過程におけるLIMK/TESK経路の生理機能を
解明することが重要である｡
以下に､主な発表論文を掲載する｡
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