生細胞イメージングによる小腸内分泌L細胞からのグルカゴン様ペプチド-1分泌制御機構の解明

(1)

1 ．はじめに　消化管上皮には様々な内分泌細胞が存在しており、生体環境の変化に応じて消化管ホルモンを分泌し、生体の恒常性維持に関与している。筆者らはこれまで、主に小腸下部の小腸内分泌

_L

細胞（以下、

_L

細胞）から分泌されるグルカゴン様ペプチド

_-1

（

_{glucagon-like peptide-1:}

GLP-1

）に着目してきた。

_GLP-1

は、膵_{α 細胞から分泌} されるグルカゴンと同じく、プログルカゴンという前駆体タンパク質から翻訳後切断されることによって産生されるが、切断部位がグルカゴンと異なる（図

_1A

）1）。分泌された

_GLP-1

は血中を循環し、膵β 細胞に作用してグルコース依存的なインスリン分泌を促進する2）。また

生細胞イメージングによる小腸内分泌

L 細胞からの

グルカゴン様ペプチド

-1 分泌制御機構の解明

原田　一貴1、伊藤　幹2、中村　匠1、神谷　泰智1、坪井　貴司1, 2 （1東京大学大学院総合文化研究科広域科学専攻生命環境科学系、2東京大学大学院理学系研究科生物科学専攻） E-mail: [email protected]

新しい内分泌現象

図 1．小腸内分泌 L 細胞と GLP-1 (A) グルカゴン遺伝子から転写・翻訳されたプログルカゴンタンパク質が、プロセシングを受ける過程の模式図。膵α 細胞と小腸内分泌_L細胞では異なるプロホルモンコンバターゼ（_{prohormone convertase: PC}）が発現しており、膵α 細胞ではPC2によりグルカゴンが、小腸内分泌_L細胞では_PC1/3により_GLP-1が産生される。_{GRPP: glicentin-related pancreatic polypeptide, IP:} intervening peptide, GLP-2: glucagon-like peptide-2。_(B)小腸内分泌_L細胞からの_GLP-1分泌制御の模式図。_L細胞は頂端側が管腔に、基底膜側が毛細血管や迷走神経に面している。食事に伴い管腔へ流入する栄養素や腸内細菌代謝物の他に、食事、ストレス、

運動など様々な環境変化に応じて分泌されるホルモンや神経伝達物質も_GLP-1分泌の制御に関与する。

A

(2)

比較内分泌学迷走神経を介して、中枢神経系に作用し、摂食行動の抑制を引き起こす3）。そのため、

_GLP-1

の分泌を促進させることで肥満症や

₂

型糖尿病の治療に結びつくと期待されている。実際、臨床的に

_GLP-1

受容体アゴニストや、

_GLP-1

を分解するジペプチジルペプチダーゼ

₄

の阻害剤が用いられている4,5）。一方、生理的な刺激によって

_GLP-1

の分泌を促進させることも治療法の一つとなりうる。そのため、

_L

細胞から

_GLP-1

が分泌される機構についての研究が現在進展している。　

_L

細胞は、細胞の頂端側が腸管の管腔に面し、基底膜側が毛細血管や迷走神経に面した「開放型」の細胞で、管腔内の栄養素や腸内細菌代謝産物、血中のホルモンや神経伝達物質など、様々な生理活性物質に曝露される環境にある（図

_1B

）6）_。

_L

_{細胞には多種多様な受容体やト} ランスポーターが発現し、管腔内に存在する化学物質を感知し、

_GLP-1

を基底膜側から開口分泌（エキソサイトーシス）する。　これまで、糖、アミノ酸、脂肪酸などが

_GLP-1

分泌に与える影響について、電気生理学、生化学、動物実験などの技術を用いた解析が行われてきた。しかし、

GLP-1

分泌を制御する分子や遺伝子レベルの詳細な機構については不明な点が多い。そこで筆者らは、生細胞イメージング技術を用い、

_GLP-1

分泌の素過程にかかわるシグナル分子やタンパク質の動態をリアルタイムで可視化解析することを試みた。 2 ．生細胞イメージングによるホルモン分泌機構の可視化解析

　全反射蛍光顕微鏡（

_{total internal reﬂection ﬂuorescence}

microscopy: TIRFM

）は、カバーガラスと水溶液の間でレーザー光を全反射させ、その際にしみ出すエヴァネッセント光（近接場光とも呼ばれる）を励起光として用いる顕微鏡可視化解析技術である。エヴァネッセント光の強度は、ガラス面からの距離に応じて急激に減衰するため、ガラス面から数百

_nm

以内の範囲のみの蛍光物質を励起できる。そのため、ガラスに接着または近接した細胞膜直下の蛍光観察が可能となる。そのため、細胞膜タンパク質、アクチン骨格、開口分泌などの動態観察に適した解析法である（図

₂

）。

　緑色蛍光タンパク質（

_{green ﬂuorescent protein: GFP}

）などの蛍光タンパク質を遺伝子工学的に改変し、特定分子の濃度変化を可視化する蛍光タンパク質型センサーの開発が、近年盛んに行われている。蛍光タンパク質型センサーには、大きく分けてフォルスター共鳴エネルギー移動（

_{Förster resonance energy transfer: FRET}

）を利用し

た

_FRET

型センサーと、単色輝度変化型センサーがある。

FRET

型センサーは、異なる

₂

色の蛍光タンパク質の間に、標的分子に対する結合ドメインを融合して作製される。標的分子が結合すると蛍光タンパク質間の距離が変化し、

_FRET

効率の変化、すなわち蛍光強度比の変化として濃度変化が可視化される。単色輝度変化型センサーは、

₁

つの蛍光タンパク質に円順列変異や分割などの変異を加え、結合ドメインを融合して作製される。標的分子が結合すると、蛍光タンパク質の発色団付近のイオン環境が変化し、蛍光強度の変化として濃度変化が可視化される。　

_FRET

型センサーは標的分子の結合に伴う蛍光強度比の変化率が小さく、また観察に

₂

つの蛍光波長の測定が必要で、複数分子の同時観察が難しい。一方、単色輝度変化型センサーは蛍光強度変化率を向上させやすく、観察波長が

₁

つでよいため、複数分子の同時観察も行いやすい。筆者らはこれまで、

_cAMP

、

_cGMP

、

_ATP

、グルコースに対する様々な単色輝度変化型センサーの開発に成功している7-10）。　そこで本稿では、

_TIRFM

や単色輝度変化型センサーを用いて明らかになった、

_GLP-1

の分泌制御機構について紹介する。 3 ．リゾホスファチジルイノシトールによる GLP-1 分泌制御機構　リゾホスファチジルイノシトール（

_{lysophosphatidylinositol:}

LPI

）は、リン脂質の中でもグリセロール骨格に炭化水素鎖が

₁

本のみ結合したリゾリン脂質の一種である。

LPI

には細胞移動や膜電位調節などの生理作用が知られており、さらに膵β 細胞からのインスリン分泌を促進する11-15）。しかし、どのような機構でホルモン分泌を促進するのか、その詳細なメカニズムは不明である。　

_LPI

に対する受容体として、

_G

タンパク質共役型受容体の一種

_GPR55

が知られている16）。

_GPR55

は膵β 細胞に発現し、

_GPR55

のアゴニスト投与によりインスリン分泌が促進される17）。また、

_GPR55

遺伝子欠損マウスは肥満症状を示すこと、肥満患者で血中

_LPI

濃度が上昇していることから、

_LPI

および

_GPR55

が血糖値制御に関与していると考えられる18,19）。しかし、

_L

細胞からの

_GLP-1

分泌と

_LPI

との関連性については不明である。　マウス

_L

細胞由来細胞株

_GLUTag

細胞を用い、

_Ca

2+ 図 2．全反射蛍光顕微鏡の模式図細胞の播種されたガラス表面で全反射する角度でレーザー光を照射する。ガラス面から染み出すエヴァネッセント光を励起光として用いることで、細胞膜直下の蛍光分子のみを励起し観察することができる。

(3)

感受性蛍光色素

_Fluo4

を用いて細胞内

_Ca

2+動態を解析したところ、

_LPI

投与により細胞内

_Ca

2+濃度（

_[Ca

2+

_]

_i）が上昇することを見出した（図

_3A

）。また

_GLUTag

細胞およびマウス急性単離初代培養小腸において、

_LPI

投与による

_GLP-1

分泌量の増加を見出した（図

_3B

）。さらに、

_GLP-1

分泌顆粒と共局在する性質を持つ

_GFP

を融合させた組織型プラスミノーゲン活性化因子（

_green

fluorescent protein-tagged tissue plasminogen activator:

tPA-GFP

）を

_GLUTag

細胞に遺伝子導入し、

_TIRFM

で

解析したところ、

_LPI

投与により

_tPA-GFP

の開口分泌頻度が増加した（図

_3C

）。　

_GLUTag

細胞において、

_GPR55

が

_mRNA

レベルで発現していることを見出した（図

_3D

）。そこで、

_GPR55

の選択的アンタゴニスト投与や、

_RNA

干渉法を用いた

GPR55

の発現抑制を行ったところ、

_LPI

による

_[Ca

2+

_]

_i上昇が抑制された。また、アクチン動態を可視化できる蛍光タンパク質

_Lifeact-EGFP

を

_GLUTag

_TIRFM

で解析したところ、重合したアクチン骨格の先端に見られる接着斑の密度が増加した（図

_3E

）。さらに、イオンチャネルの一種である

_{transient receptor}

potential cation channel subfamily V member 2

（

_TRPV2

）

を阻害、または発現抑制すると、

_LPI

による

_[Ca

2+

_]

_i上昇および

_GLP-1

分泌が抑制された。

_GFP

を融合させた

TRPV2

（

_TRPV2-GFP

）を

_GLUTag

TIRFM

を用いて解析を行ったところ、

_LPI

の投与に伴う細胞膜の蛍光強度上昇が観察され、

_TRPV2

の細胞膜への移行が示唆された。またこの反応は、

_GPR55

の阻害によって抑制された。　以上のことから、

_L

細胞において、

_LPI

により

_GPR55

が活性化され、

_[Ca

2+

_]

i上昇とアクチン骨格の再構成が誘発されることに加え、

_TRPV2

が細胞膜へ移行することで持続的な

_[Ca

2+

_]

_i上昇を引き起こし、

_GLP-1

分泌が促進されることが示唆された20）。

A

B

C

D

E

図 3．LPI による GLP-1 分泌制御

(A)LPI（_{2 µM}）投与時の_GLUTag細胞における_Fluo4の蛍光強度経時変化。細胞数₇₂。_(B)LPI（_{2 µM}）投与による_GLUTag細胞からの_GLP-1分泌量。試行回数₆回。_(C)上：_tPA-GFPを強制発現させた_GLUTag細胞の全反射蛍光顕微鏡画像。校正棒は_{10 µm}。下：

上の正方形で囲まれた部分での_tPA-GFP顆粒の経時変化。蛍光強度が一過的に上昇したのち拡散しながら減衰する様子が確認され

た。校正棒は_{1 µm}。_(D)RT-PCRによる_GPR55の発現解析。試行回数₃回。_{(E)Lifeact-EGFP}を強制発現させた_GLUTag細胞の_LPI（₂

µM）投与前（左）および投与₁₀分後（右）の全反射蛍光顕微鏡画像。校正棒は_{10 µm}。挿入図は正方形で囲まれた部分の拡大画像。

(4)

比較内分泌学

4 ．赤色 cAMP センサーの開発とin vivoイメージング

への応用

　環状アデノシン一リン酸（

_{cyclic adenosine monophosphate:}

cAMP

）は、細胞分化や移動、開口分泌の制御に関与する細胞内セカンドメッセンジャーである。当研究室では、過去に緑色の単色輝度変化型

_cAMP

センサー

_Flamindo

や

_Flamindo2

を開発してきた7,21）。しかし、光照射によって活性化することができる光遺伝学技術に用いられるタンパク質の多くは、青色光により活性化されるものであるため、励起に青色光を必要とする緑色センサーとの同時利用が困難である。そこで、

₁

波長のみの光による励起および蛍光取得で

_cAMP

動態を可視化でき、多重色イメージングや、青色光で活性化する光受容体タンパク質を用いた光遺伝学との併用にも適用可能な、赤色蛍光タンパク質を基盤とした単色輝度変化型

_cAMP

センサーの開発を行った。　発色団付近で分割した赤色蛍光タンパク質

_mApple

に、マウス

_{exchange protein directly activated by cAMP}

1

（

_Epac1

）の

_cAMP

結合ドメインを挿入し、配列の最適

化により、赤色

_cAMP

可視化センサー

_{Pink Flamindo}

（

_{Pink ﬂuorescent cAMP indicator}

）を開発した（図

_4A

）。

Pink Flamindo

は、試験管内で

_cAMP

との結合により蛍

光輝度が約

_4.2

倍に上昇した（図

_4B

）。　開発した

_{Pink Flamindo}

を生細胞に遺伝子導入した結果、ヒト子宮頸がん細胞株

_HeLa

細胞や、マウス膵_β 細胞株

_{MIN6 m9}

細胞において薬理刺激や生理的刺激への応答が確認された（図

_4C

）。また、緑色

_Ca

2+センサー

_G-GECO

との同時観察や、青色光照射で活性化し

cAMP

を合成する光活性化アデニル酸シクラーゼとの併用にも成功した22）_{。さらに、生きたマウス脳内のグ} リア細胞の一種アストロサイトで

_{Pink Flamindo}

による

cAMP

動態の

_{in vivo}

二光子顕微鏡イメージングにも成功した22）。

　以上のことから、

_{Pink Flamindo}

は、従来の

_cAMP

セ

A

B

C

図 4．赤色 cAMP センサー Pink Flamindo の開発

(A)Pink Flamindoの配列模式図。_*は変異導入個所を表す。_(B)cAMP（_{100 µM}）存在下（実線）および非存在下（破線）での_Pink Flamindoの励起蛍光スペクトル。_{(C)Pink Flamindo}を強制発現させた_HeLa細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化剤フォルスコリン（_Fsk、_{100 µM}）、ホスホジエステラーゼ阻害剤_{3-isobutyl 1-methylxanthine}（_IBMX、_{200 µM}）、アデニル酸シクラーゼ阻害剤₂′, 5′-dideoxyadenosine（_DDA、_{100 µM}）を順に投与した際の顕微鏡画像および蛍光強度の経時変化。校正棒は_{20 µm}。細胞数₃₀。

(5)

ンサーでは不可能であった二色イメージング、光遺伝学との併用に適用できるだけでなく、

_{in vivo}

イメージング実験にも使用可能であり、生きた生体中を含む様々な細胞において有効なツールであることが示された22）。 5 ．キニーネによる GLP-1 分泌制御機構　キニーネは苦味物質の一種である。先行研究において、キニーネを経口投与したラットで体重増加に対する抑制効果が報告され、その効果は苦味による食欲減退とは独立に起こるものだと示唆されている23,24）。そこで、消化管に取り込まれたキニーネが

_GLP-1

分泌の促進を介して体重増加を抑制する可能性を考え、キニーネが

GLP-1

分泌に与える影響の解明を試みた。　

_GLUTag

細胞において

_Fluo4

を用いた

_Ca

2+イメージングを行ったところ、キニーネ投与により

_[Ca

2+

_]

_i上昇が見られた。しかし、キニーネにより

_GLP-1

分泌量は

増加しなかった（図

_{5A, B}

）。

_TIRFM

を用いて

_tPA-GFP

顆粒の動態を解析したところ、キニーネ投与によって顆粒が細胞膜に接近するものの、膜融合に至らないことが明らかになった（図

_5C

）。

A

B

C

D

図 5．キニーネによる GLP-1 分泌制御

(A)キニーネ（₃₀₀μ_M）投与時の_GLUTag細胞における_Fluo4の蛍光強度経時変化。細胞数₅₀。_(B)グルコース（_{25 mM}）またはキニーネ（_{300 µM}）投与による_GLUTag細胞からの_GLP-1分泌量。試行回数₄回以上。_(C)上：_tPA-GFPを強制発現させた GLUTag細胞にキニーネ（_{300 µM}）を投与した際の全反射蛍光顕微鏡画像。校正棒は_{10 µm}。下：上の正方形で囲まれた部分の tPA-GFP顆粒の経時変化。校正棒は_{1 µm}。図_2Cのように、蛍光強度が一過的に上昇したのち拡散しながら減衰する様子が確認できなかった。_{(D)Pink Flamindo}を強制発現させた_GLUTag細胞にキニーネ（_{300 µM}）、続けて_Fsk（_{1 µM}）を投与した際の蛍光強度の経時変化。細胞数₃₄。データは平均±標準偏差。_N.S.は有意差なし、_****は_{P < 0.0001}を示す。

(6)

比較内分泌学　蛍光標識ファロイジンを用いて

_GLUTag

細胞のアクチンを染色し、

_TIRFM

で解析した結果、キニーネによりアクチン重合が促進していることが示唆された。アクチン重合により

_GLP-1

分泌小胞の膜融合が抑制され、

[Ca

2+

_]

i上昇だけでは

GLP-1

開口分泌に至らなくなっていると推測し、

_GLP-1

の開口分泌には細胞内

_cAMP

濃度（

_[cAMP]

_i）の上昇も必要なのではないかと考えた。そこで

_{Pink Flamindo}

を

_GLUTag

細胞に導入し、アデニル酸シクラーゼの活性化剤フォルスコリンをキニーネに続けて投与すると、キニーネ単体では観察されなかった

_[cAMP]

_i上昇が誘発され、

_tPA-GFP

の開口放出頻度も増加した（図

_5D

）。　以上のことから、キニーネは

_[Ca

2+

_]

_i上昇を引き起こすが、同時にアクチン重合が促進されることにより

GLP-1

分泌の促進には至らず、キニーネによる体重増加抑制効果は

_GLP-1

分泌以外の作用を介すること、また

_GLP-1

の分泌には

_Ca

2+と

_cAMP

の両者が協同的に作用することが必要であることが示唆された25）。 6 ．L- グルタミンによる GLP-1 分泌制御機構　

_L-

グルタミンはアミノ酸の一種で、先行研究においてアミノ酸の中でも最も強い

_GLP-1

分泌促進作用を持つことが知られている26）。しかし、その詳細なメカニズムは不明であった。

_L-

グルタミンをはじめとするアミノ酸を感受する受容体として、カルシウム感受性受容体（

_{calcium-sensing receptor: CaSR}

）、

_G

protein-coupled receptor class C group 6 member A

（

_GPRC6A

）、うま味受容体を構成する

_{taste receptor type 1 member 1}

A

B

C

D

図 6．L- グルタミンによる GLP-1 分泌制御

(A)様々なアミノ酸（_{500 µM}）投与時の_GLUTag細胞における_Fluo3の蛍光強度ピーク値の比較。_(B)様々なアミノ酸（_{500 µM}）投与時の_GLUTag細胞における_Flamindo2の蛍光強度曲線下面積値の比較。_Flamindo2は_cAMPと結合することで蛍光強度が低下するセンサーであるため、_[cAMP]_i上昇により曲線下面積値は減少する。_(C)L-グルタミン（_{500 µM}）投与による、代表的なコントロール（変異なし）・_TAS1R1機能喪失変異（_TAS1R1-Δ_C）・_TAS1R3機能喪失変異（_TAS1R3-Δ_C）_GLUTag細胞株からの_GLP-1分泌量。グルタミンの有無による相対的な分泌変化率を比較した。試行回数₇回。_(D)L-グルタミン（_{500 µM}）投与による、コントロール（変異なし）・_TAS1R1機能喪失変異（_TAS1R1-Δ_C）・_TAS1R3機能喪失変異（_TAS1R3-Δ_C）_GLUTag細胞株それぞれ₃株ずつでの_Flamindo2の蛍光強度曲線下面積値の比較。データは平均±標準誤差。_N.S.は有意差なし、_*は_{P < 0.05}、 **は_{P < 0.01}、_***は_{P < 0.001}、_****は_{P < 0.0001}を示す。

(7)

（

_TAS1R1

）および

_{member 3}

（

_TAS1R3

）などがあるが、

そのどれが

_L-

グルタミン感受に関与し、どのようなシ

グナルを伝達しているかも不明であった。

_GLUTag

細胞に様々なアミノ酸を投与し、カルシウム感受性蛍光色素

_Fluo3

および緑色

_cAMP

センサー

Flamindo2

を用いて

_[Ca

2+

_]

_iおよび

_[cAMP]

_iの変化を可

視化解析した。すると、

_L-

グルタミンを投与したときのみ、

_[Ca

2+

_]

iと

[cAMP]

iの両者が上昇した（図

6A,

B

）。このうち、

_[Ca

2+

_]

_i上昇は

_L-

グルタミンがナトリウム

_-

アミノ酸共輸送体によって取り込まれる際、細胞内に

_Na

+が流入して細胞膜の電位が上昇し、電位依存性カルシウムチャネルを介して

_Ca

2+が流入することで起こると考えられた。一方、アミノ酸受容体の一種

TAS1R3

の阻害によって

_cAMP

濃度の上昇が抑制されたことから、

_L-

グルタミンによる

_cAMP

濃度上昇には

TAS1R3

が関与していると考えられた。通常

_TAS1R3

は、

TAS1R1

と共役したヘテロ二量体（うまみ受容体）として機能し、

_[Ca

2+

_]

i上昇を引き起すが、

[cAMP]

i上昇への関与は不明である。　そこで、

_TAS1R1

と

_TAS1R3

それぞれの機能を詳細に調べるため、ゲノム編集技術

_CRISPR/Cas9

を用い、

TAS1R1

または

_TAS1R3

の機能喪失変異細胞を樹立した。その結果、

_TAS1R3

機能喪失変異細胞では

_L-

グルタミンを投与しても

_[cAMP]

_i上昇が起こらない傾向にあり、

_GLP-1

分泌量が変異なしの細胞に比べて減少した（図

_{6C, D}

）。しかし、

_TAS1R1

機能喪失変異細胞では変異なしの細胞との違いは見られなかった。　以上のことから、

_L-

グルタミンによる

_GLP-1

分泌促進は

_[Ca

2+

_]

iおよび

[cAMP]

i上昇によって起こること、また

_[cAMP]

_i上昇には

_TAS1R3

が関与しており、

TAS1R3

は

_TAS1R1

とのヘテロ二量体としてだけではなく、

_TAS1R3

のみからなるホモ二量体、または

_TAS1R3

以外の

_G

タンパク質共役型受容体とのヘテロ二量体として機能している可能性があることが示唆された27）_。 7 ．おわりに　筆者らの研究により、小腸内分泌

_L

細胞からの

GLP-1

分泌は、

_Ca

2+や

_cAMP

などの細胞内シグナル分子、細胞骨格、イオンチャネル、

_GPR55

や

_TAS1R3

などの受容体によって厳密に制御されていることが示唆された。一方、これらの成果の多くは株化細胞を用いて見出されたものであり、生体中の消化管で実際にどのような制御機構が存在するか、さらなる検証が必要である。近年、

_L

細胞は小腸下部のみならず大腸にも分布しており、小腸と大腸とで異なる働きをすることがわかってきた28,29）。今後、深部消化管での

_{in vivo}

イメージングの観察系を構築するなどし、これまで解明できなかった分泌現象の解明を目指したい。文献

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