第 1 章 ラ ッ ト 腸 管 に お け る 薬 物 吸 収 に 対 す る 粘 液 層 の 影 響 Mucin は 粘 液 層 を 構 成 す る 主 要 な タ ン パ ク 質 成 分 の 一 つ で あ り 、 腸 管 か ら の 薬 物 吸 収 を 制 御 す る 重 要 な 因 子 で あ る こ と が 指 摘 さ れ て い る が 、mucin 分 子 に 着 目 し た 検 討 は な さ れ て お ら ず 、 薬 物 吸 収 に 対 す る mucin 分 子 の 寄 与 は 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い 。本 研 究 で は 、ラ ッ ト 腸 管 に お け る 脂 溶 性 薬 物 の 膜 透 過 性 に 対 す る 粘 液 層 の 影 響 と ラ ッ ト 腸 管 に お け る mucin mRNA 発 現 パ タ ー ン と の 関 係 を 評 価 し た 。 物 理 化 学 的 性 質 と 腸 管 膜 透 過 に 対 す る 粘 液 層 除 去 の 影 響 お よ び 腸 管 部 位 差 と の 関 係 性 を 明 ら か に す る た め 、 物 理 化 学 的 性 質 の 異 な る 各 種 薬 物 を 選 択 し 、粘 液 層 除 去 剤（dithiothreitol, DTT）を 用 い て in vitro
sac 法 を 行 っ た と こ ろ 、 griseofulvin と antipyrine の 腸 管 膜 透 過 性 は 、 十 二 指 腸 や 空
腸 な ど の 上 部 腸 管 で の DTT 処 理 に よ っ て 増 加 し た が 、 下 部 腸 管 で は 変 化 は 認 め ら れ な か っ た （Figure 1）。 ま た 、 薬 物 の 腸 管 膜 透 過 性 に 対 す る 粘 液 層 の 影 響 と mucin 分 子 の 消 化 管 内 分 布 と の 関 係 を 明 ら か に す る た め に 、ラ ッ ト 腸 管 に お け る Mucin mRNA の 発 現 解 析 を 行 っ た 結 果 、Muc5ac の 発 現 は 十 二 指 腸 で 著 し く 高 い 一 方 で 、 Muc1、 Muc2 お よ び Muc3A の 腸 内 発 現 は 腸 管 下 部 に 向 か っ て 徐 々 に 増 加 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。さ ら に 、DTT 処 理 後 の 腸 管 管 腔 液 中 の 遊 離 粘 液 に 含 ま れ る 糖 タ ン パ ク 質 に 対 し て Muc5ac お よ び Muc2 の 抗 体 を 用 い て western blotting を 行 っ た と こ ろ 、DTT 処 理 後 の 腸 管 管 腔 液 に お い て 、 腸 管 上 部 で の み Muc5ac タ ン パ ク 質 が 検 出 さ れ た（Figure 2）。 以 上 の 検 討 結 果 よ り 、 腸 管 上 部 の 粘 液 層 が バ リ ア 機 能 に 重 要 な 役 割 を 果 た し 、 脂 溶 性 薬 物 の 腸 管 膜 透 過 を 制 限 す る 機 構 に 、Muc5ac が 関 与 す る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 第 2 章 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 に 対 す る 糖 タ ン パ ク 質 の 影 響 粘 液 層 の 分 子 実 態 で あ る mucin は 、分 子 量 の 50%以 上 を 糖 鎖 が 占 め て お り 、こ の 高 い 糖 鎖 量 が 水 分 保 持 能 や 高 次 構 造 の 形 成 に 関 与 し て い る 。本 研 究 で は 、mucin の 分 子 量 の 50% 以 上 を 占 め る 糖 鎖 と 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 性 と の 関 連 を 明 ら か に す る た め 、 Figure 1
E ffect o f DT T on t he intest ina l per meat io n o f gr iseo fulvi n in rat gastro intest ina l sacs, w hic h were prepared fro m (a ) duo de num, (b) jej unu m, (c ) ile um, and ( d) co lo n. Ke y: ( ○ ) cont ro l ( untreated) ; ( ● ) D TT at 10 mM (p retreated fo r 10 min). Results are presented as t he mea n ± S. D. ( n = 4 –9) fro m three indepe nde nt exper i me nts. * P < 0. 05, ** P < 0. 01 co mpared w it h t he co ntro l co nd it io n.
Figure 2
mucin お よ び 糖 鎖 を 多 く 含 有 す る 細 胞 を 探 索 し 、糖 鎖 合 成 阻 害 剤 作 用 時 の 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 性 を 検 討 し た 。
Mucin 遺 伝 子 の mRNA 発 現 量 を RT-PCR 法 に よ り 評 価 し た と こ ろ 、 HT29 細 胞 に
お け る MUC 遺 伝 子 発 現 は 、 C2BBe1 細 胞 に 比 較 し て 分 泌 型 mucin（ MUC2 お よ び
5AC） で 著 し く 高 か っ た 。 ま た 、 ア ル シ ア ン ブ ル ー 染 色 の 結 果 、 C2BBe1 細 胞 、 Kato III 細 胞 お よ び GSU 細 胞 に 比 較 し て HT29 細 胞 に お い て 顕 著 に 高 い 染 色 が 確 認
さ れ 、HT29 細 胞 の 表 面 に は 糖 鎖 量 が 多 い こ と が 示 さ れ た 。 HT29 細 胞 を 用 い て 糖 鎖 合 成 阻 害 剤 作 用 時 に お け る paclitaxel 作 用 後 の 細 胞 生 存 率 を MTT assay に よ り 評 価 し た と こ ろ 、control 群 に 比 較 し て 有 意 な 細 胞 生 存 率 の 減 少 が 認 め ら れ た 。 ま た 、 糖 鎖 合 成 阻 害 剤 作 用 時 に お け る rosebengal の 細 胞 内 取 り 込 み 試 験 を 行 っ た と こ ろ 、 rosebengal の 細 胞 内 取 り 込 み 量 は control 群 に 比 較 し て 有 意 に 増 加 し た 。 同 様 に 、 griseofulvin の 経 細 胞 輸 送 量 は 糖 鎖 合 成 阻 害 剤 作 用 時 に 増 加 し た 。 以 上 よ り 、 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 機 構 に お い て 、 糖 鎖 合 成 酵 素 お よ び 糖 鎖 修 飾 さ れ た タ ン パ ク 質 が 重 要 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 第 3 章 薬 物 の 経 細 胞 輸 送 に お け る 膜 結 合 型 mucin の 影 響 本 研 究 で は 、 膜 結 合 型 mucin と 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 機 構 と の 関 連 を 検 討 す る た め に 、 代 表 的 な 膜 結 合 型 mucin で あ り 、 消 化 管 で の 発 現 が 高 い MUC1 に 着 目 し 、 ゲ ノ ム 編 集 技 術 に よ り MUC1-Knock-out (KO)/MDCK II 細 胞 を 作 製 し 、 脂 溶 性 薬 物 の 経 細 胞 輸 送 に 対 す る MUC1 の 効 果 を 評 価 し た 。 Paclitaxcel、rhodemine 123 お よ び griseofulvin の 細 胞 膜 透 過 性 は 、吸 収 方 向 お よ び 排 出 方 向 の 両 方 向 に お い て control 細 胞 と 比 較 し て cMUC1-KO 細 胞 で 増 加 し た 。 さ ら に 、 内 因 性 P 糖 タ ン パ ク 質 （ P-gp） 単 独 KO（ cABCB1-KO） MDCK II 細 胞 と 内
因 性 P-gp お よ び MUC1 同 時 KO（ cABCB1・ cMUC1-KO） MDCK II 細 胞 を 作 製 し 、
研 究 で は 、 典 型 的 な 膜 結 合 型 mucin で あ る MUC1 が 抗 が ん 剤 に 対 す る 薬 剤 耐 性 を 引 き 起 こ す 分 子 メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る た め に 、MUC1 安 定 発 現 細 胞 株 お よ び 細 胞 内 シ グ
ナ ル 伝 達 に 関 連 す る CT を 除 去 し た MUC1ΔCT 発 現 細 胞 株 を 作 製 し 、様 々 な 抗 が ん 剤
に 対 す る 影 響 に つ い て 検 討 し た 。
5-Fluorouracil、doxorubicin お よ び paclitaxcel 作 用 時 の 細 胞 生 存 率 は 、mock 細 胞 と 比 較 し て 、MUC1 発 現 細 胞 に お い て 有 意 に 維 持 さ れ 、MUC1ΔCT 発 現 細 胞 に お い て も 同 様 の 傾 向 が 認 め ら れ た 。 細 胞 生 存 率 の 差 が 顕 著 に 認 め ら れ た paclitaxcel の 細 胞 内 取 り 込 み は 、mock 細 胞 と 比 較 し て 、MUC1 お よ び MUC1ΔCT 安 定 発 現 細 胞 に お い て 有 意 に 抑 制 さ れ た 。 さ ら に paclitaxcel を 輸 送 す る 排 出 型 ト ラ ン ス ポ ー タ ー で あ る P-gp の タ ン パ ク 質 お よ び mRNA 発 現 レ ベ ル は 、 細 胞 間 で 差 は 認 め ら れ ず 、 paclitaxcel の 細 胞 内 取 り 込 み の 抑 制 効 果 に お い て P-gp の 影 響 は 存 在 し な い こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、
脂 溶 性 薬 物 で あ る rose bengal お よ び hoechst
33342 の 細 胞 内 取 り 込 み に お い て も 、 mock 細 胞 と 比 較 し て 、MUC1 お よ び MUC1ΔCT 安 定 発 現 細 胞 に お い て 有 意 に 抑 制 さ れ 、paclitaxcel の 結 果 と 一 致 し た 。ま た 、細 胞 表 面 の 水 分 量 を 測 定 し た と こ ろ 、mock 細 胞 と 比 較 し て 、MUC1 お よ び MUC1ΔCT 安 定 発 現 細 胞 に お い て 有 意 な 増 加 が 認 め ら れ た 。 以 上 、本 章 で 得 ら れ た 結 果 よ り 、MUC1 は 細 胞 表 面 に 水 層 を 形 成 し 、脂 溶 性 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 に 対 し て 抑 制 的 に 作 用 す る こ と で 、 抗 が ん 剤 の 細 胞 膜 透 過 を 物 理 的 に 抑 制 し 、 抗 が ん 剤 に 対 す る 耐 性 機 構 を 生 じ る こ と が 示 さ れ た 。 総 括 本 研 究 で は 、 腸 管 上 部 の 粘 液 層 が 脂 溶 性 薬 物 の 腸 管 膜 透 過 を 制 御 し 、 こ の 制 御 機 能 に お い て 分 泌 型 mucin で あ る muc5ac が 重 要 な 分 子 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、分 泌 型 mucin に よ る 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 の 抑 制 機 構 に お い て 、糖 鎖 領 域 が 重 要 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 ま た 、 膜 結 合 型 mucin で あ る 内 因 性 MUC1 が 脂 溶 性 薬 物 の 経 細 胞 輸 送 に 対 し て 影 響 を 及 ぼ す こ と が 明 ら か と な っ た 。MUC1 は 細 胞 表 面 に 水 層 を 形 成 し 、 脂 溶 性 薬 物 の 細 胞 膜 透 過 に 対 し て 抑 制 的 に 作 用 す る こ と で 、 抗 が ん 剤 の 膜 透 過 を 物 理 的 に 抑 制 し 、 抗 が ん 剤 の 耐 性 機 構 を 引 き 返 す こ と が 示 さ れ 、 が ん 領 域 に お い て も 抗 が ん 剤 耐 性 機 構 に 対 す る mucin 分 子 の バ リ ア 機 能 の 重 要 な 知 見 を 示 し た 。 以 上 、 本 検 討 で 得 ら れ た 成 果 は 、 薬 物 の 腸 管 吸 収 性 を 規 定 す る 因 子 で あ る 生 理 学 的 な 要 因 と し て 、 粘 液 層 に 関 す る 新 た な 基 盤 情 報 を 提 供 す る 。 こ れ は 、 薬 物 動 態 研 究 に お け る in vitro 評 価 系 か ら 得 ら れ る 予 測 値 と in vivo 評 価 系 か ら 得 ら れ る 実 測 値 の 相 違 の 軽 減 に 寄 与 し 、 医 薬 品 開 発 の 効 率 化 に 貢 献 す る 有 用 な 知 見 を 与 え る も の で あ る 。 Figure 3
