IRUCAA@TDC : Interleukin-１β and ６-induced calcium channel current modulation in MC３T３-E１ osteoblast cell line

Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

Interleukin-１β and ６-induced calcium channel

current modulation in MC３T３-E１ osteoblast cell

line

Author(s)

小林, 弘史

Journal

歯科学報, 116(5): 408-409

URL

http://hdl.handle.net/10130/4157

Right

Description

博士（歯学）・第２０２７ 号（甲第１２６１号）・平成

２６年３月３１日

４０８ 歯科学報 Vol．１１６，No．５（２０１６） こ ばやし ひろ し 氏 名（本 籍）

小

林

弘

史

学 位 論 文 題 目 Interleukin-１β and ６ -induced calcium channel current modulation in MC３T３-E１ osteoblast cell line

掲 載 雑 誌 名 InternationalJournalofBiology 第７巻 ２号 ６８－７７頁 ２０１５年

論 文 審 査 委 員 （主査） 井上 孝教授 （副査） 柴原 孝彦教授 末石 研二教授 田﨑 雅和教授 東 俊文教授 論 文 内 容 の 要 旨 １．研 究 目 的 インターロイキン（lL）は骨組織に対して骨形成を促進または抑制することが報告されており，特に炎症性サ イトカインと呼ばれる IL-１ β や６は過剰分泌によって骨芽細胞などを介した骨吸収を起こすことが知られて いる。 骨芽細胞は骨形成機能だけでなく破骨細胞分化に必須な因子の産生機能も有しており，骨代謝の中心的な役 割を果たしている。骨芽細胞には IL-１ β や６の受容体が存在し，IL が骨のリモデリングに関与していること が報告されているが，その分子メカニズムは明らかになっていない。 電位感受性カルシウムチャネル（VSCCs）は細胞内カルシウムイオンの濃度調整だけでなく細胞分化や増殖， 酵素活性の調整，遺伝子発現の調整など様々な作用が知られており，近年では骨芽細胞に VSCCs が存在する ことが報告され，その働きが注目されている。しかし IL-１ β と６による骨芽細胞の VSCCs への働きについて は明らかにされていない。 そこでこの研究では，骨芽細胞における IL-１ β と６の VSCCs に対する作用について検討した。 ２．研 究 方 法 マウス培養骨芽細胞（MC３T３-E１）に全細胞膜記録型パッチクランプ法を適用し，電位固定法で膜電位を －８０mV に固定し，＋１０mV への脱分極刺激を与えることにより，全細胞膜を流れるカルシウムイオン電流 （ICa）を記録し VSCCs 電流とした。本実験は細胞外液の Ca２＋を Ba２＋に置換し，I Caに代わりバリウム電流（IBa）

を記録した。電位刺激はアクソン社コンビュータ・ソフトウェア「pCLAMP ver １０」を用い，ヘカ・エレク トロン社増幅器「L/M-EPC７」を介して細胞に与えた。イオン電流の解析は「pCLAMP ver １０」で行った。 IL-１β と６について５０pM，５００pM，５nM，５０nM の４種類の濃度を，それぞれ灌流液を介して投与し，その 前後の VSCCs 電流の変化について調査した。 ３．研究成績および考察 IL-１β および６は，灌流後 VSCCs 電流の促進を認めた。IL-１ β は５０pM で２２．８±４．０％（n＝５），５００pM で ２１．７±２．０％（n＝６），５nM で３４．１±３．９％（n＝６），５０nM で５６．７±５．１％（n＝３）の促進が認められ，濃度依 存性に促進することが明らかとなった。IL-６でも５０pM で１５．８±２．７％（n＝１０），５００pM で２２．９±４．５％（n＝ ― ６４ ―

４０９ 歯科学報 Vol．１１６，No．５（２０１６） ７），５nM で３５．６±４．０％（n＝８）の促進が認められ濃度依存性の促進を示すものの，５０nM では２１．９±３．４％ （n＝３）の抑制を認めた。IL-１ β および６の５nM では１２０秒間の灌流直後から VSCCs 電流の促進が起こり， 灌流停止後は徐々に電流値の回復を示した。IL-６の５０nM では１２０秒間の灌流の問，徐々に VSCCs 電流の抑制 が起こり，灌流停止後は速やかに電流値の回復を示した。電流電圧曲線にて IL 投与前後を比較すると，IL-１ β および６の５nM，IL-６の５０nM 共通して＋２０mV で最大活性を示し，IL-１ β，６共に VSCCs の電位感受性機 能に変化をもたらさないことが判明した。 ４．結 論 IL-１β は骨芽細胞に対して５０pM から５０nM において濃度依存的に VSCCs を促進することが明らかになっ た。また IL-６は，５０pM から５nM において VSCCs を促進し，５０nM で抑制することが明らかになった。 論 文 審 査 の 要 旨

本研究は，インターロイキン（IL）のマウス前骨芽細胞 cell line（MC３T３-E１）に対する直接的な影響を骨芽 細胞の電位感受性カルシウムイオンチャネル（VSCCs）に注目し，パッチクランプ法を用いて検討したもので ある。その結果，IL-１β においては濃度依存性に VSCCs の促進を認めた。また IL-６においては５０pM から５ nM において濃度依存性に VSCCs を促進し，５０nM では抑制を示した。 本審査委員会は，平成２５年１１月６日に行われ，まず小林弘史大学院生より論文内容の説明がなされた。その 後，各審査委員から本論文に対し次のような質問があった。１）IL 濃度の妥当性について，２）灌流方法に ついて，３）細胞分化度の程度について，４）高濃度 IL による細胞毒性の有無について。これらに対して １）参考論文によると In vitro 研究における IL 濃度は，本研究の５００pM～５nM に相当し，５０pM～５０nM の 濃度設定は妥当なものと考えられる。２）２ml の IL 溶液を１２０秒かけて灌流投与しており，VSCCs の peak 値が投与前の値に回復するまで記録を続けた。３）cell line を定められた方法に従い培養したため，本研究に おける継代による細胞性質に変化はないと判断した。４）５０nM の濃度は本研究において妥当であると考える が，仮に高濃度の設定だったとしても，灌流投与停止後に peak 値が投与前の値まで回復しており，細胞毒性 はないものと考えられる。と概ね適切な回答が得られた。IL 濃度の妥当性や，より明快な考察となるよう追 加記載を行うこと，実験対象を正確に表現した題名への変更や実験状況の説明，論文形式の整理などの修正点 が指摘され，後日修正を行った。また本研究に対しての今後の展望として，VSCCs の特定や細胞内シグナル の特定についての検討等の提案がなされた。 以上より，本研究で得られた結果は今後の歯学の進歩，発展に寄与するところ大であり，学位授与に値する ものと判定した。 ― ６５ ―