博 士 （ 農 学 ） 賈 延 軍
学位論文題名
rvIicrobial metabolism ofaspecific
and immediate precursor of plant hormone ethylene （植物ホルモンエチレンの特異的前駆体の微生物による代謝）
学位論文内容の要旨
エチレンは果実の成熟を促進するホルモンとして植物によって合成されることが知 られている。その作用は果実の成熟のみでなく、植物の生長発達の諸過程に影響して いることも知られている。エチレンは植物体内では極めて特異的前再区体を経て合成さ れる。その前駆体懲1‑アミノシクロプロパン‑1‑カルボン酸の構造を持ち、ACCと呼ば れる。エチレンはACCの酸化分解によってシクロプロパン環から遊離し、酵素ACCオキ シダーゼが植物から分離されている。ACCを窒素源として利用する微生物が土壌から分 離され、ACCを分解する酵素ACCデアミナーゼが数種類の細菌から精製され、遺伝子の 分析によって6種の配列が決定されている。ACCデアミナーゼは細菌ばかりでなく、酵 母Hansenula saturnusおよび糸状菌Penicillium citrinumにも発見され、酵母の酵 素は精製されて、配歹IJも決定されている。
本論分は、主として糸状菌のACCデアミナーゼに関するものであり、呈・citrinumか ら酵素の分離とその性質の特定、コードするcDNAの分離と配列の決定、呈．citrinumに よるACCの合成と分解、およびACC合成酵素ACCシンターゼとACCデアミナーゼを導入し た大腸菌が植物の生長に与える影響について、実験結果を示し考察したものである。
1）P．citrinuraのACCデアミナーゼ
ACCデァミナーゼ球ACCや2‑アミノイソ酪酸によって誘導される。P．citrinumの培養 で酵素が誘導される条件を調べ、最適を条件で培養した菌体かち酵素を精製した。精 製の過程では、特に、pH10のアルカリ性の溶液で酵素が安定であること、硫酸銅が酵 素を安定に保つ作用を持つことを発見して、有効に利用した。精製された酵素は、電 気泳動とゲル濾過の結果から水溶液で球2量体であると考えられ、モノマーの分子量は 細菌や酵母の酵素に比べて幾分大きいことが推定された。精製酵素球pH6.0から11.Oま で安定であり、短期間の貯蔵では硫酸銅を加える必要はなかった。ACCに対するKmは 4.8mMで、細菌や酵母の酵素に比較して高く、dl‑コロナミン酸やD．セリンに対する活 性は他の二者の場合より低かった。しかし、補酵素、光吸収スペクトル、活性やスペ クトルのpH依存性は同様であった。
2）ACCデアアミナーゼのアミノ酸配列
硫酸銅を使用せずに迅速な操作によって酵素を精製し、不純物を含む酵素試料を水 素化ホウ素ナトリウムで還元して補酵素ピリドキサルリン酸を酵素タンパク質に共有
結合で固定し、更に、SH基をピリジルェチル化し、HPLCによって修飾酵素を精製した。
精製した修飾酵素はりジルエンドペプチダーゼで分解して、HPLCにより325 nmに吸収 を持っぺプチドを、補酵素結合部位を含むものとして分離した。このぺプチドは細菌 酵素の補酵素結合部位に類似した配列を示した。同時に分離されたぺプチドの分析に よって全配歹fJの約70％が決定された。修飾酵素のN末端分析は特定のアミノ酸を指定せ ず、酵素N末端が修飾されていることを示した。得られた配歹qを用いてPCRプライマ ーを設計し、合成されたDNAを用いてプローブを調製した。2‐アミノイソ酪酸の誘導に よってACCデアミナーゼを盛んに合成しているP．citrinumからRNAを抽出して、cDNAラ イブラリーを調製し、プローブを用いてACCデアミナーゼcDNAを分離した。このcDNAの 塩基配列から39.2 kDaの分子量を持つ360残基のアミノ酸配列が明らかになった。この 配列は細菌の酵素と52$、酵母の酵素と45$のアミノ酸を一致させて並べることができ た。起源の異なる3酵素の配列の比較から．、8から10残基連続して類似性の高い配列を 6箇所発見し、活性や立体構造との関係を考察した。
3）P．citrinumによるACCの合成と分解
蜜柑に生育して腐敗させるP．digitatumはエチレンをよく発生することが知られて いる。この場合は2‐オキソグルタル酸を前羇匡体とすることが証明されており、予備的 実験で細胞内にACCをほとんど蓄積しないことが認められた。呈・citrinumの場合はエ チレンの発生は極めて低いにもかかわらず、細胞内にACCを蓄積した。ACCの蓄積は培 地にL・メチオニンを加えると増加し、他方、ACCを加えてもエチレンの発生は影響され なかった。しかし培養の後期で細胞内ACCな低下するので、ACCデアミナーゼの作用が 予想された。この酵素醵ACCまたは2−アミノイソ酪酸で誘導されるが、ACCはより低濃 度で有効であり、l,ccM ACCを含む培養液でもACCヂアミナーゼmRNAが検出された。この 濃度は呈．虹trinumが生産するACC量に相当する濃度より低い。0.05$L｜メチオニンを 含む培地でP．citrinumを培養し、生育が最大に近づぃたときACCデアミナーゼmRNAが 検出された。低い酵素活性も検出され、細胞内ACC蓄積量が最大に達する頃、ACCデア ミナーゼが誘導されACCが分解されることを示した。
4）植物の根の生長に対する微生物酵素の影響
カナダで植物の根の生長を促進する細菌がACCデアミナーゼを持つこと、分離した ACCヂアミナーゼ遺伝子を導入した大腸菌が同じ作用を獲得することが示されている。
この実験系を用いて、Pseudomonas属細菌のACCヂアミナーゼおよびP．citrinumのACC シンターゼをそれぞれ発現する大腸菌を調製レ、その懸濁液にカノーラまたはナタネ の種子を浸して1.5時間室温に静置してから取り出し、発芽装置を使用して、水または 水溶液を吸い上げている紙に治って生育させた。この時ベクターのみを導入した大腸 菌による場合を対照とした。大腸菌の懸濁および発芽装置に脱塩水または10 mM硫酸 マグネシウムを用いた実験で、ACCデアミナーゼを含む大腸菌では根の生長が促進され、
ACCシンターゼの場合は生長が阻害された。根に付着して生育する大腸菌の酵素が、根 のACC濃度を変化させ、結果としてエチレンの濃度を変化していると考えられる。エチ レンは根の生長を抑えることが知られている。そのことは発芽装置にO.lpM ACCを使 用すると根の生長が阻害されることからも示された．
以上のように本論文は、植物によるエチレン生合成の特異的中間体ACCが、土壌微生
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物では分解されて窒素源として利用されエチレンに球変換されないことを、酵素のア ミノ酸配列の決定とmRNAの分析によって示し、ACCの分解酵素および合成酵素を持つ微 生 物 と 植 物 の 根 の 生 長 と の 関 係 に つい て 示 唆 的 結 果 を 示 し た も の で あ る 。
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学位論文審査の要旨
学 位論 文題 名
IvIicrobial metabolism ofaspecific
and immediate precursor‑ of plant hormone ethylene （ 植物 ホル モン エチレ ンの 特異 的前 駆体の 微生 物に よる代 謝）
本 論文球 序論 と結諭を含めて7 章で構成され、図 46 、表7 、引用文献90 を含む 103 頁 の 英 文 論 文 で あ る 。 別 に 参 考 論 文 2 編 が 添 え ら れ て い る 。 エチレンは果実の成熟を促進するホルモンとして植物によって合成されること が知られている。その作用は果実の成熟のみでなく、植物の生長発達の諸過程に 影響していることも知られている。エチレンは植物体内では橿めて特異的前駆体 を経て合成される。その前駆体強 1 ‐アミノシクロプロパン‑1‑ カルボン酸の構造を 持ち、 ACC と呼ぱれる。エチレンは ACC の酸化分解によってシクロプロパン環から 遊離し、酵素 ACC オキシダーゼが植物から分離されている。ACC は土壌微生物によ って窒素源として利用され、ACC を分解する酵素ACC デアミナーゼが数種類の細菌 や酵母から精襲され、遺伝子の分析によって既に 7 種の配列が決定されている。
本論分では、主として糸状菌によるACC の分解と合成について、更に、大腸菌に 導 入 し た 酵 素 の 植 物 生 長 に 与 え る 影 響 に つ い て 記 述 し て い る 。 1 ）糸状菌Penicillium citrinum のACC ヂアミナーゼ
ACC デアミナーゼはACC や2 ‐アミノイソ酪酸によって誘導される。P ．citrinum の 培養で酵素が誘導される条件を調べ、最適な条件で培養した菌体から酵素を精製 した。精製の過程では、特に、 pHl0 のアルカリ性の溶液で酵素が安定であること、
硫酸銅が酵素を安定に保つ作用を持つことを発見して、有効に利用した。精製さ れた酵素は 2 量体で、モノマーの分子量は細菌や酵母の酵素に比べて幾分大きい ことが推定された。精製酵素は pH6 ．O から11 ．O まで安定であり、短期間の貯蔵では 硫酸銅を加える必要はなかった。ACC に対するKm は4 ． 8mM で、細菌や酵母の酵素 に比較して高く、dl ‐コロナミン酸やD ―セリンに対する活性は他の二者の場合より
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守 哉
和
誠 博
間 葉
井
本 千
松
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
低 か っ た 。
2）ACCデ ア ア ミ ナ ー ゼ の ア ミ ノ 酸 配 列
硫 酸 銅 を 使 用 せ ず に 迅 速 な 操 作 に よ っ て 部 分 精 製 し た 酵 素 を 水 素 化 ホ ウ 素 ナ ． ト リ ウ ム で 還 元 し て 補 酵 素 ピ リ ド キ サ ル リ ン 酸 を 酵 素 タ ン パ ク 質 に 共 有 結 合 で 固 定 し 、 更 に 、SH基 を ピ リ ジ ル エ チ ル 化 し 、HPLCに よ っ て 補 酵 素 結 合 酵 素 を 精 製 し た 。 精 製 し た 酵 素 は り ジ ル エ ン ド ペ プ チ ダ ー ゼ で 分 解 し て 、HPLCに よ ル ペ プ チ ド を 分 離 し 、 そ れ ら ぺ プ チ ド の 分 析 に よ っ て 全 配 列 の 約70％ が 決 定 さ れ た 。 酵 素 のN末 端 分 析 は 特 定 の ア ミ ノ 酸 を 指 定 せ ず 修 飾 さ れ て い る こ と を 示 し た 。 得 ら れ た 配 列 を 用 い て プ ロ ー ブ を 調 製 し 、cDNAラ イ プ ラ リ ー か らACCデ ア ミ ナ ー ゼcDNAを 分 離 し た 。 こ のcDNAの 塩 基 配 列 か ら39．2kDaの 分 子 量 を 持 つ380残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 が 明 ら か に な っ た 。 こ の 配 列 は 細 菌 の 酵 素 と52$、 醇 母 の 酵 素 と45$の ア ミ ノ 酸 が 一 致 し た 。 3） 呈 ・citrinumに よ るACCの 合 成 と 分 解
蜜 柑 に 生 育 し て 腐 敗 さ せ るP． digitatumは エ チ レ ン を よ く 発 生 し 、2― オ キ ソ グ ル タ ル 酸 を 前 駆 体 と す る こ と が 証 明 さ れ て い る 。P． cltrlnumの 場 合 は エ チ レ ン の 発 生 は 極 め て 低 い に も か か わ ら ず 、 細 胞 内 にACCを 蓄 積 し た 。ACCの 蓄 積 は 培 地 に L‐ メ チ オ ニ ン を 加 え る と 増 加 し 、 生 育 に 幾 分 遅 れ て 最 大 と な り 、 培 養 の 後 期 で 細 胞 内ACCは 低 下 し た 。L‐ メ チ オ ニ ン を 含 む 培 地 で 生 育 した 豊． cltrlnumのmRNAを 分 析 し て 、 蓄 積 し たACCに よ っ てACCヂ ア ミ ナ ー ゼ が 誘 導 さ れ る こ と を 示 し た 。 4） 植 物 の 根 の 生 長 に 対 す る 微 生 物 酵 素 の 影 響
植 物 の 根 の 生 長 を 促 進 す る 細 菌 がACCデ ア ミ ナ ー ゼ を 持 つ こ と 、 分 離 し たACCデ ア ミ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 し た 大 腸 菌 が 同 じ 作 用 を 獲 得 す る こ と が 、 既 に 報 告 さ れ て い る 。 こ の 実 験 粟 を 用 い て 、Pseudomonas属 細 菌 のACCデ ア ミ ナ ー ゼ お よ びP． citrinumのACC合 成 酵 素 を そ れ ぞ れ 発 現 す る 大 腸 苗 を 調 襲 し 、 そ の 懸 濁 液 に カ ノ ー ラ ま た は ナ タ ネ の 種 子 を 浸 し て1．5時 間 室 温 に 静 置 し て か ら 取 り 出 し 、 発 芽 装 置 を 使 用 し て 生 育 さ せ た 。ACCデ ア ミ ナ ー ゼ を 含 む 大 腸 菌 で は 根 の 生 長 が 促 進 さ れ 、 ACC合 成 酵 素 の 場 合 は 生 長 が 阻 害 さ れ た 。 根 に 付 着 し て 生 育 す る 大 腸 菌 の 酵 素 が 、 根 のACC濃 度 を 変 化 さ せ 、 結 果 と し て エ チ レ ン の 濃 度 を 変 化 し て い る と 考 え ら れ る 。 エ チ レ ン は 根 の 生 長 を 抑 え る こ と が 知 ら れ て い る 。 そ の こ と 漣 発 芽 装 置 に0.1pM ACCを 使 用 す る と 根 の 生 長 が 阻 害 さ れ る こ と か ら も 示 さ れ た ．
以 上 の 成 果 な 、 植 物 に よ る エ チ レ ン 生 合 成 の 中 間 体ACCの 微 生 物 に よ る 代 謝 を 明 ら か に し 、 微 生 物 の 酵 素 と 植 物 の 根 の 生 長 と の 関 係 に つ い て 示 唆 的 結 果 を 示 し た も の で 学 術 上 高 く 評 価 さ れ る 。 よ っ て 審 査 員 一 同 は 買 延 軍 が 博 士 （ 農 学 ） の 学 位 を 受 け る に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 認 め た 。
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