博士（医学）三島真知子 学位論文題名
トレロ ジェン産生細胞のフェノタイプとトレランス 誘導リンノく組織
一白 血 病 モ デ ル マ ウ ス を 用い た骨 髄キ メラ によ る解 析―
学位論文内容の要旨
I ． 緒 言
T 細 胞 抗 原 レ セ プ タ ー （ TCR ） の p 鎖 variable （ V ） 領 域 が 6 番 ， 即 ち vp 6 を発現するVp6 +T 細胞は，minor lymphocyte stimulatory antigen(Mls)‑l 抗原 と MHC ク ラ ス u 分 子複 合 体 に 反 応 す る． 両者 を自 己抗 原と しても つマ ウス では ， Vp 6+T 細 胞 は 分 化 の 過 程で 消 去 さ れ る ． [Mls‑1b → Mls‑1 ° ］ 骨 髄 移 植 キ メ ラ で こ の 過 程 を 分 析す る と ， ド ナ ー 由 来 の MHC クラ ス n+ （ 特 に I ―E ゛ ）ス トロ ー マ細胞が重要な役割を果たすことが判明した．しかしこの組み合わせの骨髄キメラ では，ドナーストローマ細胞はMls‑l ＾を産生できなぃ．従って，ホスト細胞の産生 するMls‑l ゜抗原が，ドナーのMHC クラスII+ 細胞に移行して，クラスII ‑Mls‑1 ＾複 合体を形成するものと考えられる．しかし，ホストMls‑l ゜産生細胞については，詳 細は不明である．
本 研 究 で は プ レ B 細 胞 自 血 病 を 発症 する SL/Kh マ ウス を用 いて， 骨髄 移植 によ る 自血病発症抑制効果を検討すると共に，Mls‑l 産生細胞について解析した．先ずホ ス ト 抗 原 反 応 性 T 細 胞 の ク ロ ー ン消 去を Mls‑l ＾ 抗原 をホ スト抗 原， vp 6+T 細 胞 をホスト反応性細胞の一例として解析した．Mls‑l °抗原はマウス乳腺腫瘍ウイルス (MTV‑7 ） の 産 物 であ る が ， Mls‑l ＾ 抗 原 を 自 血病 細 胞 特 異 抗 原 と想 定す れば ， 今回のシステムはgraft versus leukemia(GVL) を誘導し，自血病再発予防に有効なモ デルになると考えられる．最後にトレロジェンであるMls‑l ＾抗原産生細胞のフェノ タ イ プ と ， ク ロ ー ン 消 去 が 誘 導 さ れ る ル ン パ 組 織 の 関 係 を 解 析 し た ．
H ． 実験 方法
マ ウ ス ： AKR/J(AKRXH‑ 2k ， Mls‑l ） は Jackson 研 究 所 よ り ，
C57BL/6(B6XH̲2b，Mls̲lb)，BlO.BR(BRXH̲ 2k，Mls̲l ），B10.D2(D2XH‑ 2d，Mls‑ lb)は静 岡 実 験 動 物 セ ン タ ー，SL/Kh(SLXK゜ ，Aq，Dq)は日 合博 士（ 京大 ・病 理 ）よ り供 与さ れ たものを免疫科学研究所で維持し，用いた．
骨 髄 キ メ ラ ： コ ン ト ロ ー ル 骨 髄 キ メ ラ は 従 来 の 方 法 に 従 っ て ，T細 胞 除 去 骨 髄 細 胞 を 致 死 量X線 照 射 マ ウ ス に 移 注 し ， 作 製 し た ． ま た ド ナ ー 紬 胞 を 抗Thyl抗 体 で 処 理 す る 際 ， 補 体(C)を 加 え な ぃ こ と に よ っ て ， マ イ ナ ー 移 植 細 胞 対 宿 主 反 応(GVHR) キ メ ラ を 作 製 し た ． 一 部 の 実 験 で は[BR→BR]同 系 骨 髄 キ メ ラ 作 製 後1週 目 に ， (AKRXBR)FiマウスのT細胞 サプセットを静注した．
細 胞 表 面 解 析 ： キ メ ラ 作 製 後5ー7週 日 に 各 リ ン バ 組 織 を 採 取 し ， 表 面 抗 原 を 解 析 し た ． 細 胞 精 製 は ナ イ ロ ン ウ ー ル カ ラ ム 通 過 後 ， 抗CD4又 は 抗CD8抗 体 で 処 理 し ， ダ イ ナ ピ ー ズ で 精 製 し た ．FACS解 析 は 抗CD3￡ 鎖 抗 体(2C11)， 抗Vp8TCR抗 体 (F23.1)， 抗Vp6TCR抗 体 (44‑22‑i） で 染 色 後 ， 従 来 の 方 法 に 従 っ た ． 混 合 リ ン パ 球 反 応(MLR)：MLRはAKRマ ウ ス ， ま た は(AKRXBR)F1マ ウ ス よ りCD 4+ま た はCD8゛T細 胞 分 画 を 得 ， 抗CD44単 ク ロ ー ン 抗 体 で 処 理 後 ，FACStarに よ ル ソ ー テ ィ ン グ し ， 刺 激 細 胞 と し た ．BR APC存 在 下 で ， 精 製 刺 激 細 胞 でBRT細 胞 を 刺 激 し ， 結 果 は 既 報 の ご と くBRT細 胞 中 の 芽 球 化 し たvp6゛T細 胞 の 割 合 で 判 定 し た ． 活 性 化AKR刺 激 細 胞 に よ るMLRは ， 抗Vp8.2゛ 抗 体 で 固 相 化 し た プ レ ー ト に ，Vp 8.2+T細 胞 を 除 い たBRの 反 応 細 胞 とAPC， さ ら に 分 画 し たAKRのT細 胞を共培養し行った．
PCR： 全RNAは り ン バ 球 分 画 又 はT細 胞 よ り 得 ， 逆 転 写 を 行 っ た ． 逆 転 写 に よ り 得 たcDNAをMls‑l＾特異的PCRプライマーによって増幅し た・
m． 結 果
ヱ ． ア ロ 骨 髄 移 植 に よ るSLマ ウ ス の 自 血 病 発 症 の 抑 制 ． 無 処 置SLマ ウ ス は 生 後36週 以 内 に す べ て 自 血 病 で 死 亡 し ，lOGy照 射 後SL骨 髄 を 移 植 し た 同 系 キ メ ラ も 同 程 度 の 生 存 曲 線 を 示 し た ． し か し ア ロ で あ るB6マ ウ ス の 骨 髄 を 移 植 し た[B6→SL]キ メ ラ の 場 合 は 約70％ が36週 以 後 も 生 存 し ， ア ロ 骨 髄 移 植 がSLマ ウ ス の プ レB細 胞 白 血 病 発 症 を 予 防 す る こ と が 確 認 さ れ た ．
2． SL;JD7宀 キ メ ラ に お け る レ 〆6+細 胞 の1消 去 ．SLマ ウ ス のMTV‑7をPCRで 調 べ た 結 果 ，SLマ ウ ス はMls.laで あ る こ と が 判 明 し た ． コ ン ト ロ ー ル ［D2→SL]キ メ ラ で は 移 植 後5週 で ， 胸 腺 ， リ ン パ 節 中 のvp6十T細 胞 の 割 合 が そ れ ぞ れ ，1％ ，0％ と 消 去 さ れ た ．GVHR [D2→SL]群 で のvp6゛T細 胞 の 割 合 は ， 胸 腺 で10％ ， リ ン パ 節 で6％ と ， 有 意 の 消 去 ｜ ま 見 ら れ な か っ た ． こ れ ら は 従 来 報 告 さ れ た ，T細 胞 白 血 病 自 然 発 症 系 マ ウ スAKRを ホ ス ト と し た[D2→AKR]の 結 果 と 一 致 し た ． す な わ ち マ イ ナ ーGVHRに よ り ，Mls‑l゜ を 産 生 す る ホ ス ト 側T細 胞 の 完 全 除 去 が 生 じ ， そ の 結 果vp6゛ 細 胞 の ク ロ ー ン 消 去 が 誘 導 さ れ な か っ た と 考 え ら れ た ． 3． Mls‑l'を 産 生 す る 丁 細 胞 サ ブ セ ッ/．MLR後 のvp6゛T細 胞 の 割 合 を 見 る と ，
AKR マウス の CD8 十 T 細胞刺 激群では 26.0% ，CD4 十T 細胞刺激群では 1411 ％と CD8
゛T 細胞が強い刺激活性を示した．また同じCD 8+ 亜群の中では，メモリータイプ と考えられるCD44 十サプセット(61.8 ％）が，CD44 ーサプセット(20.8 ％）より強い 刺激活性，即ち強い Mls‑l ＾産生能を示した．
4 ． Mls‑l T 細胞サブセッ宀によるレヶ6+ 丁細胞のクローン消去．骨髄移植後1 週 目に ， [BR → BR] 同系 キメラに ， (AKR XBR)F1 マウス の CD8 十 CD44 十 T 細胞を 静 注すると， vp6 ゛T 細胞が胸腺CD4 ゛CD8 ー， CD4 ℃ D8 ゛細胞中，それぞれ 3.0 ％，
2.8% （コントロール：7.7 ％，13.0 ％），リンバ節 CD4 ゛，CD8 ゛細胞中，それぞれ 1.8 ％，3.1 ％（コントロール：7.3 ％，12.0 ％）と，有意のクローン消去が誘導さ れた．しかしCD8 ゛ CD44 ー T 細胞は，リンパ節中のVp6 ゛T 細胞の消去はわずかな がら誘導したが，胸腺では消去を生じなかった．
IV ． 考 察
自 血病 に 対 する 骨 髄移 植 で， GVHR が 有利 に 働く 報告 が増加して きた．即ち GVHR の主役 のドナー T 細胞に よって，拒 絶に働くホ スト側の T 細胞や NK 細胞が 除去されると同時に，自血病細胞を根絶やしにするGVL へとっながると考えられる・
今回 の実験では GVHR と コントロー ル[B6 →SL] キメラ 間に生存率の差は認めら れなかったが，GVHR キメラではホスト側T 細胞の早期の消失が見られた．そして Mls‑l ＾十 MHC クラス 1I 反応性のト．ナー Vp6+T 細胞が，このようなキメラでは長 期間認められた． SL 及び AKR の自血病は，いずれも腫瘍ウイルスによって生じる ことが知られている．これらのウイルス産物が腫瘍特異抗原として同定でき，この 抗原 に反応性を 示すT 細 胞レバートリーが同定されれば，今回著者が解析した Mls‑l ゜十クラスII 抗原に対するVp6+T 細胞の系が，そのままGVL のシュミレーショ ンとして応用できるのではないかと期待される．
今回 明 らか に なっ た こと は ，Mls‑l ＾ を産 生 する 細胞は， T 細胞の中 でも CD8 ゛ CD44 ゛ 分画 にあ ることであ る．また Vp6+T 細胞のク ローン消去 が，CD8 +CD44+T 細 胞 を静 注し た [BR → BR] キメラの 胸腺，リン バ節で誘導 されるのに 対し，CD8 ゛ CD44 ー静注群ではりンバ節でのみ認められる点から，CD44 分子の発 現が，Mls‑l ＾の高い産生量と相関するのみならず，T 細胞の組織分布にも影響を与 えることが考えられた．すなわち胸腺内にトレロジェンのT 細胞が入るためには，
CD44 分子が必要ではないかと考えられた．．
V ．結語
アロ骨髄移植によって，SL マウスでのプレB 細胞白血病の発症を抑制した．本移 植系においても，移植時のマイナーGVHR によって，Mls‑l 反応性T 細胞クローン の消去が生じなかった．Mls‑l ＾産生細胞の解析の結果，CD8+CD44+ 細胞がMls‑l ＾ 抗原を効率よく産生し，胸腺，リンパ節においてVp 6+T 細胞のクローン消去を
− 109−
誘導することが判明した．従って，コントロール［D2 →SL] キメラにおける Mls‑l ＾ 産 生 細 胞 は ， ホ ス ト CD8+CD44+T 細 胞 と 考 え ら れ た ．
― 110 ‑
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査
教授 教授 助教授
小野江 柿沼 上出
学 位 論 文 題 名
和則 光明 利光
トレ口ジェン産生細胞のフェノタイプとトレランス 誘導リ ンパ組織
― 自 血病 モ デ ルマ ウ スを 用 い た骨 髄 キ メラ に よる 解 析 ―
本研究では、主としてプレB細胞白血病を発症するSL/Khマウスと、胸腺型自血病を発症 するAKRマウスを用いて、骨髄移植による白血病発症の抑制効果を検討した。またホスト抗 原反応性T細胞のクローン消去をMls―1．抗原をホスト抗原、VB6゛T細胞をホスト抗原反 応性細胞の一例として解析した。Mls−1．抗原は内因性マウス乳腺腫瘍ウィルス(MTV‑7）の産 物であるが、Mls−1．抗原を自血病細胞特異抗原と想定すれば、今回のシステムはgraft versus leukemia (GVL）を誘導し、自血病再発予防法を開発していく上での有効なモデルに なると考えられる。゛最後に、トレ口ジェンであるMls−1．抗原産生細胞のフェノタイプと、
クローン消去が誘導されるりンパ組織の関係を解析した。
無処置SLマウス；ま、生後36週以内に全て自血病で死亡し、lOGy照射後SL骨髄細胞を移植 した同系キメラも同程度の生存曲線を示した。しかしアロであるB6マウスの骨髄を移植し た[B6‑ SL］キメラの場合は約70,;が36週以後も生存し、アロ骨髄移植がAKRマウスの場合と 同様、SLマウスのプレB細胞白血病発症を予防するこ、とが確認された。しかし、今回の実 験ではGVHRとコントロール［B6‑ SL］キメラ間に生存率の差は認められなかっ、た。SLマウス のMTV‑7をPCRで調べた結果、SLマウスはMls−1．であることが判明した。コントロール［D2→ SL］キメラでは移植後5週で、胸腺、リンパ節中のV声6゛T細胞の割合がそれぞれ1X、0Xと 消去された。移植時少数のドナ−T細胞を混入させ、マイナ−GVHRを誘導したGVHR［D2→S L］群でのV声6゛T細胞の割合は、胸腺で10X、リンパ節で6Xと、有意の消去は見られなかっ た。従って、マイナ−GVHRによ゛り、Mls−1．を産生するホスト側T細胞の完全除去が生じ、
そ の 結 果V声 6゛T細 胞 の ‐ ク ロ ー ン 消 去 が 誘 導 さ れ な か っ た と 考 え ら れ た 。 次にMls−1．産生細胞を同定するために、混合リンパ球反応でAKRマウス由来T細胞サブセ ットの刺激能を解析した。その結果、AKRマウスのCD8゛T細胞が強い刺激活性を示すことが 判明した。また同じCD8゛亜群の中では、メモリータイプと考えられるCD44゛サプセットが、
−111― ・
CD44‐サ プセットより強い刺激活性、即ち強いMls‐1．産生能を示した。同様にhlls−lb同系キ メ ラを 用い 、in vivoのクローン消去アッセイ で1dls−1．産生細胞を解析 した結果でも、(BR x AKR) FiマウスのCD8゛CD44+T細胞が強いNIl$‐1．産生能を示し、また胸腺、リンパ節両者に お い てV声6゛T細 胞 の ク ロ ー ン 消 去 を 誘導 した 。し かし 、CD8+CD44‑T細胞 は、 リ ンパ 節で のみVロ6+T細胞の部分的消去を示したにすぎなかった。
今回 の研 究で 、GVHRキメ ラで はホ スト 側T細 胞の 早期 の消 失が 見ら れた。そしてMls―1． 十MHCク ラ スII抗 原 反 応 生 の ド ナ −V声6+T細胞 の産 生が 、こ のよ うな キメ ラで は 長期 間認 め られ た。 SLお よびAKRマ ウス の自 血病 は、 いずれも腫瘍ウィルスによって生じることが知 ら れて いる 。こ れ らの ウィ ルス 産物 が腫 瘍特 異抗原として同定でき、このMls−1．十クラス lI抗 原 に 対 す るVロ6+T細 胞 の 系 が 、 その ままGVLの シュ ミレ ーシ ョン とし て応 用 でき るの で はな いか と期 待 され る。 また 今回 初め て明 らか にな った こと は、CD44分子の発現がMls− 1． の高 い産 生量 と相関するのみならず、トレ ロジェン(Mls−1．）産生T細胞の組織分布にも 影響を与 えることである。
口頭 発表 にあ た り、 柿沼 教授 よりGVHRによ る延 命効 果、AKRとSLマ ウスを用いた理由など に っ い て 質問 があ った が 、申 請者 は大 旨適 切な 解答 を成 し得 た。 また 副査 の柿 沼 、上 出両 教 授 に は 個別 に御 審査 い ただ き、 合格 と判 定さ れた 。以 上、 本研 究は 骨髄 移植 に よる 自血 病 発 症 に 対 す る 予 防 効 果 を 確 認 し 、 またGVHRによ っ てホ スト 抗原 反応 性T細胞 が 長期 間産 生 され るメ カニ ズ ムを 明ら かに した 。こ れら は将 来graft versus leukemiaの導入にっなが る も の ． で 、 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
ー 112−
