博 士 （ 理 学 ） 松 木 吏 弓
学 位 論 文 題 名
lVIolecular studies of transcriptional regulation of the rolC gene in higher plants
（高等植物におけるrolC 遺伝子の転写制御に関する分子的研究）
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
Agrobacterium thizogeぬesが植物に感染すると、その感染部位から毛状根と呼ばれる不定根 が形成 される。 これはA thizogenesのもつ ：T‑DNAが、植物のゲノムに組み込まれT‑DNA中の 遺 伝子 が 発 現す る こ とに よ っ て起 き る 現象 で あ る 。rolC遺 伝 子 はこ の 毛状根 形成に 関与 す る 遺 伝 子 の ー つ で あ る が 、 単 独 で 植 物 に導 入 す ると 草 丈 の低 下 や 頂 芽優 勢 の 減少 等 の 形態 的 変 化を 示 す こと が 知 られ て い る。 最 近 の 研究 か ら 、rolC遺 伝 子産物 はサイ トカ イ ニ ン 及 び ジ ベ レ リ ン 合 成 の 代 謝 に 阻 害 的に 作 用 し、 そ の 結果 形 態 的 な変 化 が 起き る と いう こ と が示 唆 されてい る。本 研究ではro′C遺伝子の 転写制 御に注目 し、r甜匸遺 伝子 の 発 現 お よ び そ の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に お け る DN結 合 因 子 の 解 析 を 行 っ た 。 第一章 形質転換イネにおけるfD´C遺伝子の発現解析 ．′
アグロバクテリアは一般に単子葉植物には感染しない。′。 ′C遺伝子はA曲丘昭印酪の遺 伝 子 で あ り 、 単 子 葉 植 物 で の 発 現 に 関 し て何 の 知 見も 得 ら れて い な か った 。 そ こで 単 子葉植 物でのrD JC遺伝子 発現を 解析する ために、 ．再分化系の確立しているイネにエレク ト ロポ ー レ ーシ ョ ン 法を 用 い て遺 伝 子 導入 を 試みた 。′0JC遺伝子 の発現を 解析す るため にr。灯プロモーター領域にロ glucuronid慾甌GUS）遺伝子を連結したキメラ遺伝子を作出した。
こ のキ メ ラ 遺伝 子 を ハイ グ ロ マイ シ ン 耐性 遺 伝子（hph）を もっプ ラスミド と同時 にエレ ク ト ロ ポ ー レ ー シ ョ ン 法 に よ っ て イ ネ に 導入 し た 。26個 体の ハ イ グ 口マ イ シ ン耐 性 の 形質転 換植物体 が得ら れ、この うち2個体の もので′D ル冫GUSキメラ 遺伝子の 発現が認め ら れ た 。GUS活 性 を 器 官 別 に 測 定 し た 結 果 、 葉 お よ び 根 で 強 い 活 性 がみ ら れ たが 、 カ ルスで はほとん ど活性 を検出で きなか った。組 織化学 的解析により′D´C遺伝子の発現は、
双子葉植物と同様に維管束組織に局在していることが示された。
イネに おける ′。´C遺伝子 産物の 発現を解 析する ためにf0´C構造遺伝子をもっプラスミ ド を エ レ ク ト 口 ポ ー レ ー シ ョ ン 法 に よ っ て導 入 し た。PCR法 を 用 い た解 析 か ら4個 体 の
の 再 分 化 イ ネ にrolC遺 伝 子 が 導 入 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ た。 しか しこ のう ちrolC遺 伝 子 の 発 現 が 認 め ら れ た の は3個 体 だ け で あ っ た 。rolC遺 伝 子 産 物 の イ ネ の 形 態 に 与 え る 影 響 をTi世 代 の 幼 苗 を 用 い て 解 析 し た 。 発 芽 後3週 間 のTi世 代 の 草 丈 を 比 較 し た と こ ろ、rolC形質転換イネではro．′cをもたない形質転換イネとくらべ、約15一20％の草丈 の 低 下 がみ られ た。rD´C形 質転 換 タバ コに おい ても 草丈 の低 下が 報告 され てお り、 ′D厄 遺 伝 子 産 物 は 単 子 葉 植 物 に お い て も 生 理 的 に 作 用 す る こ と が 示 さ れ た 。 第 二章 イネ核タンパク質と′D´C遺伝子5．上流域との相互作用
真 核 生 物 の 遺 伝 子 は 、 主 に プ ロ モ ー タ ー 上 の 調 節 配 列 と そ れ ら の 配 列 を 特 異 的 に 認 識 す る 転写 因子 とが 相互 作用 し、 発現 調節 がな され てい る。 第 二章 で1ま、 ′D´ 匸遺 伝子 の プ ロ モ ー 夕 一 領 域 と 特 異 的 に 結 合 す る 因 子 を 検 出 す る こ と を 目 的 に 解 析 を 行 っ た 。 葉 、 お よ び カ ル ス よ り 抽 出 し た 核 タ ン パ ク 質 とRC94十23断 片と を用 いて ゲル シフ ト分 析 を 行 っ た 。 葉 、 カ ル ス と も にRC94十23断 片 と 特 異 的 に 複 合 体を 形成 する 因子 が検 出さ れ た 。 次 に こ のDNA結 合 タ ン パ ク 質 の 認 識 配 列 を 決 定 す る た め に 、DNaseIフ ッ ト プ リ ン ト 法 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 葉 と カ ル ス 双 方 の 核 タ ン パ ク 質 中 に ‐76か ら ‐66の 領 域
（A1WnTrTIADをDN謎eIの 分 解 か ら 保 護 す る 因 子 が 存 在 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 さ ら に 上 流 域 のRC203‐92断 片に つい てゲ ルシ フト 分析 を 行っ たと ころ 、葉 の核 タン パ ク 質 か ら は 結 合 因 子 が 検 出 さ れ た が 、 カ ル ス で は 検 出 さ れ な か っ た 。 葉 の 核 タ ン パ ク 質 を用 いてDNaseIフ ット プリ ント 法を おこなった結果、‐203から‐164のAT含量の高い領 域 がDNascIの 分 解 か ら 保 護 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。 タ バ コ に おけ るm′cプ ロモ ータ ー中 間 欠 失 実験 の結 果か ら−196から −135まで の領 域に 正の 転写 調 節配 列が 存在 する こと が示 さ れ て お り 、 ま たm´C遺 伝 子 の 発 現 が 葉 で 強 く カ ル ス で は ほ と ん ど み ら れ な い こ と か ら 、 こ の 領 域 に 結 合 す る 核 タ ン パ ク 質 が 正 の 転 写 因 子 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 第3章 塩基配歹u特異的な一本鎖DNA結合タンパク質の検出
′、°．´C遺伝子はショ糖 によってその発現が活性化され、プロモーター解析から‐136から ー94の 領 域 が そ の 活 性 化 に 重 要 で あ る こ と が 示 さ れ て い る 。 そ こ で こ のDNA領 域 に 注 目 し 、相互作用する因子の検出を試みた。
タ バ コ の 芽 生 え 核 抽 出 物 を 用 い、 ‐136か ら，n1を 含む オ リゴ ヌク レオ チド をプ ロー プ と し て ゲ ル シ フ ト 分 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 二 本 鎖DNAプ 口 ー ブ とIま 特 異 的 な 結 合 が み ら れ ず 、 一 本 鎖DNAプ ロ ー プ と の み 複 合 体 形 成 が み ら れ た 。 こ の 結 合 因 子 は 一 本
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鎖DNAの トップス トランドに 特異的な 結合がみられ、その相補鎖とは結合しなかった。
ま た 一本 鎖DNAと の 結 合に は 、こ の 領 域内 に存在す るGCATCの繰り返 し配列が 重要で ある ことが変 異プロープ を用いた 競合実験 の結果か ら明らか になった。サウスーウェ スタ ン法によ る解析によ り、この 一本鎖DNA結合因子は、約43 kDaの蛋白質(RCS2;rolC ssDNA binding protein2）であることが示された。
第4章 イネG ‑box結合タンパク質の単離
近年 、 多く のDNA結合モ チ―フが 植物遺伝 子のプロ モーター内 に同定さ れている 。 そ の モチ ー フのーつG‑boxは、CCACGTGGの回 文配列構 造をもち 、いくっか の植物の 遺 伝子で様々な刺激に反応するCIS配列として同定されている。ro′C遺伝子のプロモーター 内にも3っのG．box様配列が存在する。′D´〔；遺伝子の発現とG‐box様配列との関係につい て 解 析 す る こ と を 目 的 に 、 イ ネ の G・ box結 合 タ ン パ ク 質 を 単 離 し た 。 G‐box結合因子として単離されたパセリCPRF3を用いて、G‐box様配列を含むfD´〔；遺伝子 51上流域の断片をプローブにゲルシフト分析を行った。その結果、f。´（のG．box様配列も CPRF3に 認 識さ れ る こと が 示さ れ た 。次 に、 このCPRF3をプ ローブにイ ネの根由 来の cDNAライ ブラリー からG．box結合 因子のクローニングを行った。4っのク口ーンが得ら れ た が、 み な同 一 のmRNA由来 で ある と 推測 された。 そのうちで 最長のcDNAに ついて 塩基配列を決定したところ、他のGBF（G‐boxb血d血gproteりと高い相同性がみられた。推 測さ れるタン パク質の→ 次構造か ら、C末側にb．ZIP構造（塩基性領域ーロイシンジッ パ ー ）を も ち、N末側 にプロリ ン残基の 多い酸性 領域を有す るタンパ ク質であ ること が 示 され た 。これら はGBFsに共通 の構造で あること から、単離 したクロ ーンをRGBF1
（ri∞G‐boxb血d血gprotcりと命名した。近年GBFが遺伝子の転写を活性化させるとぃう報告 がなされており、このRGBF1あるいはCPRF3が、植物内で′D´c遺伝子の発現に重要な役割 を果たしているということが推測される。
′。だ遺伝子は原核生物由来の遺伝子であるが、そのプロモーター構造は真核生物型 で あり、感 染宿主に なる双子葉 植物のみ ならず単子葉植物においても発現することが 明らかになった。本研究ではそのプロモーター上に結合する因子をいくっか同定した。
こ れらの因 子のさら なる研究は 、rolC遺伝子 のみならず植物遺伝子の転写制御の研究 に大きく貢献するだろう。
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学 位 論 文 審査 の 要旨 主査゛教授 谷藤茂行 副査 教授 吉川正明 副査 教授 内宮博文
（東京大学分子細胞生物学研究所）
学 位 論 文 題 名
IvIolecular studies of transcriptional regulation of the r02C gene in higher plants
（ 高 等植 物に おけ るrolC遺 伝子 の転 写制 御に 関す る分 子的 研究）
土壌細菌Agrobacterium thlzo名enesが双子藁植物に感染すると毛状根が生ずる。
それは、その細菌が保有するRiプラスミドの一部分、すなわちTーDNAが植物のゲノム 内に組み込まれ、T．．DNAに含まれる遺伝子が発現した結果である。特にrolC遺伝子は植 物の形態形成に大きな影響を及ばす。申請者は従来導入が困難とされていた単子藁植 物のイネにrolC遺伝子をエレク卜口ポレーション法で導入することに成功し、その遺 伝子の発現機構を研究して次のような諸知見を得た。
rolC遺伝子のプ口モーターを大腸菌由来のローグルクロニグーゼ〔GUS)の構造遺伝子 にっなぎ、それを薬剤耐性遺伝子との同時エレク卜ロポレーション法によってイネの プロトプラストに導入し、再分化させて形質転換植物を得た。GUS活性によって示され るrolCプ口モーターの活性は、双子藁植物のタバコでみられたように、嚢や根の維管東 内の篩部細胞に局在化していた。
次に、rolC遺伝子を組み込んだイネの植物体を育成し、自花授粉によって得た後代植
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物を調査して、rolC遺伝子の発現が単子葉植物のイネでも丈を短くすることを示した。
rolCプ ロモータ ーのDNA断片と、イネの葉、あるいはカルス細胞からの核抽出物を用 い たゲルシ フト解析 法によっ て、この プラスミ ドの遺伝子のプ口モー夕一に植物の核 蛋 白質が結 合するこ とを示し た。さら に、DNaseIフットプリント法で酵素分解から保 護 される領 域を調べ た。その 結果、AT含 量の高い‑76〜．66 bp領域をDNaseIによる分 解から保護する核蛋白質が葉とカルスの両方の細胞に存在することがわかった。また、
葉の核抽出物の方には、・203〜−164 bp領域をDNaseIによる分解から保護する蛋白質が 含 まれてい た。rolC遺伝 子はカル スではほ とんど発 現せず、葉において顕著に発現す る ので、葉 の核内に 存在する この核蛋 白質が正 の転写制御因子であると推定された。
多くの植物遺伝子のプ口モーターにはG−ボックスと呼ばれる共通配列があり、それが 外界からの種々の刺激に応答するシス配列であると言われている。このG‑ボックス類似 配 列がrolCプロ モーター にも3個含まれているので、それがシス配列として機能してい るか否かを調べた。まず、パセりのG・ボックス結合蛋白質（GBF）のcDNAを発現ペクター に っなぎ、 大腸菌で 発現させ てGBFを合成 した。rolCプロモー夕一はこのGBFと結合す る ことがゲ ルシフ卜 法で証明された。他方、パセりのGBFのcDNAをプローブとして、イ ネ のcDNAライブ ラリーか らイネのGBFのcDNAを選び 出した。RGBF1と名ずけられたその cDNAク ローンの 一次構造 の解析から、イネのGBFはダイズやシロイヌナズナのそれらに 相 同性を有 すること が示され、rolC遺伝子の植物細胞内での発現においてG−ホックス 類 似 配 列と そ れ に結 合 するGBF蛋 白質 と の相 互 作 用が 関 連するこ とが示唆 された。
また、―13 6〜−111 bp領域にっいては、それが単鎖に変性された時だけ特異的に核蛋 白 質と結合 できるこ とがわか った。こ の研究は 若いタバコの芽生えの核抽出物を用い ているが、その特異的結合は卜ップ鎖との間だけに認められた。この結合には、その領 域 内に含ま れる2個のGCATC配列が重 要なこと を塩基置 換の変異を 導入したDNA鎖との 競 合実験に よって証 明した。 また、タ バコのこ の単鎖DNA結合蛋白質の分子量はSouth ー Test ern法 で 43KDaで あ る こ と も わ か り 、 そ れ はRCS2と 名 ず け ら れ た 。 上 記の知見 は、植物 に導入さ れたプラ スミド遺 伝子の発現機構のみならず、植物遺 伝 子全般の 転写制御 の分子機 構を理解 しようと する時にも大きく貢献するもので高い 評 価を受け ている。 最終試験の結果も満足すべきものであり、参考論文（4編）の質も 高く、審査員一同は申請者が博士（理学）の学位を受ける充分な資格を有すと認めた。
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