1 （平成２２年１２月１７日 ヒトES委員会説明資料）
東京大学医科学研究所 幹細胞治療研究センター
ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業 ＥＲＡＴＯ型研究
研究プロジェクト名：「中内幹細胞制御プロジェクト」
幹細胞から臓器を作成する
中内 啓光
幹細胞から臓器を作成する
動物性集合胚作成の必要性について
資料７８−１−１腎不全、各種心臓疾患など、臓器不全症に対する根本的な治療には臓器移植が必要。 しかし移植臓器は圧倒的に不足している。にもかかわらず試験管内で臓器を作出する ことは難しく、現在の再生医療が目指しているのは幹細胞から誘導した細胞を用いた 細胞治療である。 最近、我々はラットiPS細胞を用いてマウス個体内でラットの膵臓を作ることに成功した。 この原理がヒトとブタ等の大動物でもあてはまればブタの個体内でヒトの臓器を作成す ることが可能になり、移植ドナーの供給源として医療に大きく貢献できる。 さらに最近、免疫不全マウスに移植したiPS細胞由来の奇形腫からヒト造血幹細胞を 誘導することに成功。遺伝性血液疾患の根治療法につながる重要な成果。臨床応用 の可能性を検討するにあたっては、家畜など、より大きな動物で検証する必要がある。 マウスとラット以外の動物種（ヒトを含む）のES細胞やiPS細胞はキメラ形成能を持たな い(少し分化した）多能性幹細胞であることが明らかとなってきた。
幹細胞研究の現状
幹細胞研究の現状
体細胞の初期化 受精卵 受精卵 受精 受精 in vitro in vitro でで 分化誘導 分化誘導 分化細胞を用いた細胞療法 （糖尿病、パーキンソン病、 脊髄損傷、網膜色素変性症など） 多数の患者が臓 多数の患者が臓 器不全症等で移植 器不全症等で移植 を待っている を待っている
多能性幹細胞
(ES 細胞、iPS 細胞…)現在の再生医療が目指しているのは細胞治療
現在の再生医療が目指しているのは細胞治療
3体細胞の初期化 受精卵 受精卵 受精 受精 in vitro in vitro でで 分化誘導 分化誘導 分化細胞を用いた細胞療法 （糖尿病、パーキンソン病、 脊髄損傷、網膜色素変性症など） 多数の患者が臓 多数の患者が臓 器不全症等で移植 器不全症等で移植 を待っている を待っている
多能性幹細胞
(ES 細胞、iPS 細胞…)現在の再生医療が目指しているのは細胞治療
現在の再生医療が目指しているのは細胞治療
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キメラ動物とは
キメラ動物とは
交配では精子と卵子が受精することによりそれぞれが持つ遺伝子が交ざりあう。 これに対し、キメラ動物とは(ゲノムが異なる）細胞が混じりあった状態の個体を 意味す る。キメラは部分キメラと全体キメラに区別できる。 部分キメラ： 輸血や骨髄移植、臓器移植を受けた人。二卵性双生児のペアの８％が血 液キメラであるし、母親の血液中に子供の血液が長年にわたって存在する場合があるこ とが知られている。また研究分野でもマウス、ラット、羊、ウシ等の動物にヒト血液幹細胞、 ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、ヒトがん細胞、ヒト神経幹細胞などを移植することは日常的に 行われていて、ヒト神経細胞を持つマウスなども作成されている。これらは全て部分キメ ラである。 全体(全身性)キメラ：発生の極めて早期にゲノムが異なる胚細胞が混じると体全体に両 方の細胞が入り混じった個体が生まれてくる。異種間の胚を混ぜてキメラ個体作出まで 至った例として羊とヤギのキメラ（Geep）が 1984年に生まれているが、ラット･マウス間で 個体作出の成功例はない。 混合した時期に両方の細胞が多能性を持っていれば 全体キメラが生まれる可能性があると考えられる。ES ES 細胞を細胞を １０～１５個１０～１５個 胚盤胞へ注入 胚盤胞へ注入
ES
ES
細胞
細胞
× ×♀
♀
♂
♂
胚性幹
胚性幹
(ES)
(ES)
細胞によるキメラマウスの作製
細胞によるキメラマウスの作製
受精後 受精後 ３～４日目の３～４日目の 受精卵 受精卵 ((＝胚盤胞＝胚盤胞)) 仮親の子宮に 仮親の子宮に 胚盤胞を移植 胚盤胞を移植 キメラマウス キメラマウス の誕生 の誕生 6 注入された ES細胞 (緑) 胚盤胞注入 注入された ES細胞 (緑) 胚盤胞注入胚盤胞補完法を利用した臓器作出の原理
胚盤胞補完法を利用した臓器作出の原理
膵臓を欠損する 膵臓を欠損する 遺伝子改変マウス 遺伝子改変マウス 胎児 胎児 胚盤胞 胚盤胞 受精 受精 胚盤胞へ注入 胚盤胞へ注入マウス多能性幹細胞
マウス多能性幹細胞
(ES(ES 細胞、細胞、iPS iPS 細胞細胞……))
Pdx1KOマウス個体内でドナー iPS細胞由来臓器が 再生されるのではないか？ 7 Pdx1 Pdx1 KO マウスKO マウス = =
Pdx1 Pdx1 KOKO マウスマウス + + マウスマウス iPSiPS 細胞細胞 Pdx1 Pdx1 ヘテロマウスヘテロマウス + + マウスマウス iPS 細胞iPS 細胞 明視野 明視野 EGFP EGFP HE HE 膵島膵島 膵臓膵臓 EGFPEGFP DAPI DAPI 200 200μμmm 50 50μμmm 200 200μμmm 50 50μμmm
Pdx1
Pdx1
KO
KO
マウス内にほぼ全ての細胞が
マウス内にほぼ全ての細胞が
iPS
iPS
由来の膵臓ができていた
由来の膵臓ができていた
8この原理を利用してヒトの臓器を再生するには？
異種動物を用いた胚盤胞補完を成功させることが必要
膵臓欠損ブタ由来胚盤胞への ヒトiPS細胞の移植 ブタ個体内でのドナー iPS細胞由来臓器の再生 臓器欠損動物 異種の壁を越えた 胚盤胞補完の成立 異種の壁を越えた 胚盤胞補完の成立 臓器欠損動物を作成する 臓器欠損動物を作成する患者由来のiPS細胞
ブタ個体内で作成した 患者の臓器を移植異種動物の体内で臓器を作ることは可能か
異種動物の体内で臓器を作ることは可能か
?
?
マウス
マウス
ラット
ラット
10iPS細胞を用いてマウス-ラット間で動作原理を確認する
材料と方法
材料と方法
:
:
マウス
マウス
‐
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ラット異種間キメラ作製
ラット異種間キメラ作製
マウス マウスiPS iPS 細胞細胞 ラット同士の交配 ラット同士の交配 （（Wistar Wistar ♂♂x Wistar x Wistar ♀）♀）
胚盤胞注入 胚盤胞注入 EGFP EGFP--Tg Tg マウスマウス （（B6B6♂）♂） ラット ラットiPS iPS 細胞細胞 マウス同士の交配 マウス同士の交配 （ （B6 B6 ♂♂x BDF1 x BDF1 ♀）♀） 胚盤胞注入 胚盤胞注入 ラット ラット （（Wistar Wistar ♂）♂） マウス胚盤胞 + ラット iPS 細胞 マウス胚盤胞 マウス胚盤胞 + + ラットラット iPS iPS 細胞細胞 ラット胚盤胞 + マウス iPS 細胞 ラット胚盤胞 ラット胚盤胞 + + マウスマウス iPS iPS 細胞細胞 偽妊娠ラット 偽妊娠ラット (Wistar) (Wistar) へ移植へ移植 偽妊娠マウス 偽妊娠マウス (ICR) (ICR) へ移植へ移植 11
マウス
マウス
-
-
ラット異種間キメラは
ラット異種間キメラは
出生後成体まで発育可能であった
出生後成体まで発育可能であった
ラット胚盤胞 ラット胚盤胞 + + マウスマウス iPS iPS 細胞細胞 マウス胚盤胞 マウス胚盤胞 + + ラットラット iPS iPS 細胞細胞新生児期
新生児期
成体
成体
明視野
明視野
EGFP
EGFP
12キメラの作製効率とキメリズム
キメラの作製効率とキメリズム
A. A. 異種間キメラの作製効率異種間キメラの作製効率 B. B. 胎児繊維芽細胞のキメリズム解析胎児繊維芽細胞のキメリズム解析 100 100 75 75 50 50 25 25 0 0 ラット ラット マウスマウス マウスマウス ラットラット ホスト胚 ホスト胚 ドナー細胞ドナー細胞 マウスマウスiPS iPS 細胞細胞 ラットラットiPS iPS 細胞細胞
ラット
ラット マウスマウス マウスマウス ラットラット マウス
マウスiPS iPS 細胞細胞 ラットラットiPS iPS 細胞細胞
移植胚 移植胚 ( (総移植数 総移植数 = 100 % ) = 100 % ) キメリズム キメリズム (EGFP (EGFP 陽性率 陽性率 ) ) 24 24 2626 7070 3030 100 100 75 75 50 50 25 25 0 0 キメラ キメラ 非キメラ 非キメラ 非胎児 非胎児 ← ←移植胚数移植胚数 (%) (%) (%)(%)
異種間胚盤胞補完法により
異種間胚盤胞補完法により
マウス内にラットの臓器を作出できるか示す
マウス内にラットの臓器を作出できるか示す
膵臓欠損マウス内に
ラット iPS 細胞由来の膵臓を作出
受精卵 ラット iPS 細胞 Pdx1 KO マウス 14Pdx1 KOKO マウス + ラット iPS 細胞 Pdx1 ヘテロマウス + ラット iPS 細胞 明視野 EGFP A. ラットの膵臓を持った Pdx1 KO マウス (８週目) B. マウス内に作出されたラット膵臓の形態
ラットの膵臓を持った Pdx1 KO マウスは
成体まで発育できた
15B. B. 糖負荷後の血糖値推移糖負荷後の血糖値推移 HE HE EGFP EGFP DAPI DAPI 200 200μμmm A. A. 膵臓の形態と膵臓の形態と EGFP EGFP 陽性細胞の分布陽性細胞の分布
Pdx1 KO マウスに作出されたラットの膵臓は
組織学的および機能的に正常な膵臓であった
(mg/dl) (mg/dl) 0 0 2 20000 4 40000 6 60000 0 0 3030 6060 9090 120120 ((分分)) STZ STZ--糖尿病モデル糖尿病モデル Pdx1 Pdx1 KOKOマウスマウス+ + ラットラットiPSiPS細胞細胞 Pdx1 Pdx1 ヘテロマウスヘテロマウス+ + ラットラットiPS iPS 細胞細胞 16 200 200μμmmテラトーマ
テラトーマ
三胚葉系へ分化した組織を含む良性腫瘍HSCs
造血系サイトカインやストローマ細胞を投 造血系サイトカインやストローマ細胞を投 与することで、テラトーマ内に 与することで、テラトーマ内に 造血幹細胞を誘導できるのでは？ 造血幹細胞を誘導できるのでは？テラトーマ形成を利用した造血幹細胞の誘導法
テラトーマ形成を利用した造血幹細胞の誘導法
造血系サイトカイン
ストローマ細胞
誘導された造血幹細胞は骨髄に 誘導された造血幹細胞は骨髄に ホーミングするのでは？ ホーミングするのでは？ 浸透圧ポンプでサイトカインを持続投与１）大動物でも多能性幹細胞を使って臓器を作ることができるのか？ → ブタ等の大動物を使った動作原理の確認。 ２）この原理を応用してヒトの臓器を他の動物の個体内で作出するには動物性集合胚の作 成が必須である。動物性集合胚のヒトまたは動物の胎内への移植は、現在のガイドラ インでは不可。(英国では可能。中国は規制無し） → ガイドラインの見直し → 胚盤胞ではなく胎仔に多能性幹細胞や前駆細胞を移植する ３）マウスやラットのiPS細胞と異なりヒトのiPS細胞はキメラ形成能が無い。 → キメラ形成能を持つ本当のiPS細胞を樹立する必要がある。そのために はキメラ形成能を調べる手段が必要。動物性集合胚の研究が必須となる。 (日本のガイドラインではin vitroで原始線状ができるまで可能） ４）ヒトと家畜のキメラを作出する際にヒト細胞が脳や生殖細胞を持つ動物ができる可能性 がある。（現実には既にヒトの神経細胞を持つマウスは多数作られていて特に問題に はなっていない） → 胚盤胞ではなく胎仔に多能性幹細胞や前駆細胞を移植する → 神経系や生殖系に分化しないように加工した多能性幹細胞を用いる。
