DevelopmentandcIinicaIstudyOfanaIyticaImethodOf biochemicaImarkersforacutemyOcardiaIinfarction

急性心筋梗塞における生化学的 マーカーの分析法開発と臨床的 有用』性評価に関する基礎的研究

１９９５

杉 内 博 幸

DevelopmentandcIinicaIstudyOfanaIyticaImethodOf biochemicaImarkersforacutemyOcardiaIinfarction

HirOyukiSugiuchi

局

ＤｅｖｅｌｏｐmentandcIinicaIstudyofanaIyticalmethodofbiochemical markersforacutemyocardiaIinfaMion

HiroyukiSugiuchi InthetreatmentanddiagnosisofacutemyocardiaIinfarction(AMIXtheconventional

b i o c h e m i c a I m a r k e r s s u c h a s h u m a n v e n t r i c I a r m y o s i n I i g h t c h a i n - I ( H V M L C - I ) , m i t o c h o n d r i a l m a I a t e d e h y d r o g e n a ｓ e ( m r a s s f e r a n n o t a m i t e ｅ r t a s p a a I a d r i h o n t o c , m i D H ) - M ( m - A S T ) a n d h i g h d e n s i t y I i p o p r o t e i n ( H D L ) c h o I e s t e r o l a r e u s e f u l m a r k e r s

・ d s a l m e t h o a n I y t i c r , t h e s e H o w e v e aretime-consuming，invoIvecompIicatedmethdoIogy，requirerelativelyIargevolumeof s a m p l e , a n d d i f f c u I t t o a u t o m a t e

・ I n t h i s s t u d y , ｓ ｉ ｍ ｐ u r a t e a n d c o m p l e t e I y a u t o m a t e d a n a I y t i c a I m e t h o d s f o r t h e l e , r a p i d , a c c

abOvemarkersweredeveIopedandevaIuated，TheresuItsoftheseobservationsare

summarizedbelow：

1）DeveI◎pmentofanaIyticalmethodforHVMLC-landcIinicaIstudywithAMI HVMLC-lisapotentiaIcardiacspecificmarkerandhasbeenmeasuredby r

a d i o i m m u n o a s s a y ( R I A ) i n c l i n i c a l l a b o I a t o r i e s , H o w e v e r , R l A i s t i m e c o n s u m i n g a n d i n v o I v e s

complicatedmethodoIogy・Therefore，inthisstudy，ａｍｏｎoclonaIsoIidphase enzymeimmunoassaywasdevelopedforthedeterminationofHVMLC-lusingautomated

chemiIuminescencedetectionsystem(CLEIA)．ThisCLEIAassayshowedgoodprecision、

Theassayisaccurate,rapidandeasyandexhibitsawidedynamicrange・InthisclinicaI study,HVMLC-Iinserumwasfoundtobeelevatedatabout6haftertheonsetofchestpain

andIeveIsremainedeIevatedforaprolongedperiodbetween7tｏｌ４ｄａｙｓ，Ｉｎｃａｓｅｓｏｆ ｓｕｃcessfuIreperfusiontherapy,arapiddecreaseinHVMLC-lIeveIswasfound,unsuccessfuI

casesorabsenceofreperfusiontherapyexhibitedhigherconcentrationofHVMLC-Iwhich p

e r s i s t e d

．

2）DeveIopmentOfanaIyticaImethodformeasuringMDHis◎enzymesandcIinicaI studywithAMI

VariousmethodshavebeenreportedformeasuringserumMDHisoenzymes・However thesemethodsexhibitaspoorsensitivity,plaguedwithinte㎡erenceandinvolvecomplicated

methodoIogy,thusmakingthemunsuitabIeforrapidcIinicaldiagnosis・AnoveIautomated

methodwasdevelopedforthedeterminationofMDHisoenzymesinserumempIoying guanidinehydrochIorideasauniqueproteindenaturingagent，Thismethodshowedgood

reproducibility;within-runprecisionCVswereIessthan２．５％(ｍｅａｎ13.6-42.9Ｕ/L)fortotal

MDHandIessthan6､７％(ｍｅａｎ6.3-23.5Ｕ/L)form-MDH,respectively･ResuItsofthis m

e t h o d ( y ) c o r r e l a t e d w e I l w i t h t h o s e o f t h e e l e c t r o p h o r e t i c m e t h o d ( x ) g i v i n g t h e r e g r e s s i o n

equation;ｙ＝１．４６ｘ＋６．８７(､=30);r=0.99．Clinically,m-MDHactivityinserumhadgreater diagnosticvaIuethantotaIMDHactivityforjudgingsuccessfuIoutcomeofreperfusion

therapy;theprognosiswaspoorwhenthem-MDH/T-MDHratiowasgreatertha、２０％．

3)DeveIopmentofproteoIyticassayOfm-ASTandcIinicaIstudywithAMI AnautomatedmethodemployingproteoIysiswithprotease401tomeasurem-ASTin

humanserumwasdeveIoped・ＴｈｉｓmethodemploysProtease401fromSf尼pImyces specjestospecificaIlyinactivatecytosoIicAST(c-AST)butnotm-AST，Itwasalso

deveIopedanassayformeasuringapo-m-ASTwithuseofProtease401andpyridoxisaI5､‐

phosphate(PALP)．BothmethodshowedgoodprecisionwithCVslessthan7､５％with sampIesfromheaIthysubjects，ResultsofthismethodcorrelatedweIlwiththoseofan

immunochemicalmethod（r＝0.994,,=145)andshowedexcellentinhibitoryactivityof

proteaseforholo‐ａｎｄａｐｏ－ｃ－ＡＳＴｕｐｔｏ５０００Ｕ/Ｌａｎｄactivationofm-apo-ASTupto2000 U/LinthepresenceoflOOUmol/ＬｏｆＰＡＬＰ・InAMIpatients,apo/hoIoratiosIessthan20％

wereindicativeofpoorprognosisordeath．

4)DeveIopmentofdirectHDL-choIesteroIinserum AnautomatedmethodmeasuringHDL-choiesteroIwithoutpriorseparationwasdeveIoped，

usingpoIyethylenegIycol（PEG)-modifiedenzymeandsulfateda?cyclodextrin・When

choIesteroIesteraseandchoIesteroIoxidaseenzymesweremodifｉｅｄｗｉｔｈＰＥＧ，they e

x h i b i t e d s e I e c t i v e c a t a l y t i c a c t i v i t i e s t o w a r d s l i p o p r o t e i n f r a c t i o n s , w i t h r e a c t i v i t i e s i n c r e a s i n g

intheorder:ＬＤＬ<ＶＬＤＬ=ＣＭ<ＨＤＬ･

Ｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆmagnesiumions，a-cycIodextrinsuIfatereducedthereactivityof c

h o I e s t e r o I , e s p e c i a l I y i n C M a n d V L D L , w i t h o u t t h e n e e d f o r p r e c i p i t a t i o n o f t h o s e l i p o p r o t e i n

fractions・TheempIoymentofPEG-modifiedenzymeswitha-cyclodextrinsuIfateprovided s e I e c t i v i t y f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f H D L - c h o l e s t e r o l i n s e r u m i n t h e p r e s e n c e o f a s m a I I a m o u n t

o f d e x t r a n s u l f a t e w i t h o u t a n y n e e d f o r p r e c i p i t a t i o n o f I i p o p r o t e i n a g g r e g a t e s

， e s u l t s o f T h e r theHDL-cholesterolassayedinserumbythismethodcorrelatedwellwiththoseempIoyinga c o n v e n t i o n a I p r e c i p i t a t i o n m e t h o d a n d a l s o t h o s e o f a n u l t r a c e n t r i f u g a t i o n m e t h o d

．

2--3-1ミオシン迅速測定法の開発……･………･……９ ２－－３－１－１測定条件の設定･…………･･………･･･………･………･･･…９ 2--3--1-2固相濃度と酵素標識抗体法の検討………･－９ 2--3-1--3モノクローナル抗体の特異性･…………･………１１ 2-3-1-4基本的性能の評価………･………11 2-3-2HVMLC--Iの臨床的有用性の評価………･……１３

2-3-2-1各種疾患におけるＨＶ１ｍ」C-Iの評価………･………1３ 2--3-2-2急性心筋梗塞におけるＨＶ皿JC-Iの評価…･………･………-14 2-3--2--3再潅流療法の効果……-………1５ 章 緒

第 １ ＝………･-……--……-……-･………･………･-………-……１

第 ２ ミオシン迅速測定法の開発と急性心筋梗塞における臨床的有用性

の 評 価 章

－一一

６７８

一一一 一一一

一一一一一一一一一一一一一４一一

一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一

一一一一一一

一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一一一 一理一 一一一 一一一 一一一

一定果 一原一

１２３

２２２

目 次

９０ １２

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一

察括

考小

乱も ２２

章 Ｍ Ｄ Ｈ ア イ ソ ザ イ ム 分 別 定 量 法 の 開 発 と 心 筋 梗 塞 に お け る 臨 床 的 有用性の評価

第 ３

序………･………･………２１ 測定原理………･………･２２ 結果…･一………2３

3-1 3－２ ３－３

3-3-1ＭＤＨアイソザイム分別定量法の開発･…………･…･…………．．…………2３

３－３－１－１至適条件の検討…･……･-･･･………･………･………･…･………･･…２３

３－３－ｌ－２ＭＤＨアイソザイム阻害剤の検索一………･-…---27

１２ ４４ ６７ ３３

４５

３３

章プロテアーゼを用いたｍ－ＡＳｒｒ直接測定法の開発と心筋梗塞 おける臨床的有用性の評価

第 ４

序………一………･………･…．一一…－………3８ ３－３－ｌ－－３ＭＤＨ活性測定用試薬の基本的性能…………･･………･………28 3-3-2臨床的有用性の評価………･………3１

3-3--2--1各種疾患におけるＭＤＨ活性の評価･…･………･･…………･……･…３１ 3-3--2--2急性心筋梗塞におけるＭＤＨの有用性の評価………･…………3３

測定原理･………．．…宴･……3８ ４－２－１m-ASr活性測定法…………･………3９ ４－２－２アポ、ホロ型ＡＳＴ活性測定法………･…･………3９ 結果………･………･………･………･…3９

4-3

4-3-1m-AST直接測定法の開発………．．…………3９

４－３－１－１至適条件の設定………．．……一一………･･……３９ 4--3-1-2プロテアーゼの選択………一………･……４０

4-3-1--3プロテアーゼイシヒビターの影響･･………一一………４２ ４－３－１－４プロテアーゼ４０１の阻害効果………･…………･･…･…･………･…･………4４ 4-3--1--5m-AsT活性阻害に及ぼすアルブミンの効果･……･………･…………4５

4--3--1-6ｍ－ASI､測定試薬の性能･･………･･………･･…4７ 4-3--1--7アポASTのホロ化条件………･……･･……･･……･…･…･………４７ 4--3--1--8PALＰ添加による測定値の変化………･………･………･………･………･…50

4--3-2m-ASrr活性の臨床的有用性の評価……･………5２

4-3--2--1健常人のアポ、ホロＡＳＴ活性………･…･………･…………･………５２ 4--3--2--2種々の疾患におけるアポＡＳＴの評価………-………-.54 4-3--2-3急性心筋梗塞におけるアポ、ホロm-ASTの評価･………･…････……５５

考察………･………5７

4-4

８０ ７８

一一一一一一一一

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一

一一一一一一一一一一一一察括考小

4－５

第 ５ 章 Ｈ Ｄ Ｌ コ レ ス テ ロ ー ル 直 接 測 定 法 の 開 発

序………･………･………･………･６０ 測定原理………･………･………6１

5－１ ５－２

５－３ 結果…………･………6２

5-3.-1測定条件の設定………･………･………･………62

5-3-2酵素の選択………･…一……･………62

5-3-3ＰＥＧ修飾酵素の特徴………･………･………65

5-3--4各種リポ蛋白画分に対する修飾酵素の効果………67

5-3-5ｐＨの効果…………･………70

5--3--6a-CyD・sulの効果………･………71

5-3-7各リポ蛋白画分の反応曲線………･………75 5-3-8ＨDEC直接測定試薬の性能評価…･………7６

小括………･…･………一……･………一………5９

5－４ ５－５

第 ６ 章総括………･･･………8１

実験の部 第第第第 _２３４５

５６８９８８８８

謝辞…･･………･………9１

参考文献………･………9２

本論文は学術論文に掲載された以下の論文を基礎とするものである。

1）Mitochondrialaspartateaminotransferasebyimmunoprecipitationmethodin patientswithacutemyocardialinfarction．

Ｈ・○kabe，Ｈ・Sugiuchi，Ｎ・Yamane，Ｎ,Watanabe，Ｍ・Inoue，Ｙ､Morino，

Ｋ・Hayasaki，Ｈ・Teranishi，Ｓ･Inayama・

ClinicalPhysiologyandBiochemistryl989;7:109-118.

2）Proteolyticmeasurementofmitochondrialaspartateaminotransferaｓｅｉｎｈｕｍａｎ

ｓｅｒｕｌｎ．

Ｙ・Watazu，Ｈ・Okabe，Ｈ・Sugiuchi，Ｙ・Uji,Ｙ・Shirahase，Ｎ・Kaneda・

ClinicalBiochemistryl990;23:127-130.

3）Measurementofhumanventricularmyosinlightchain-1bymonoclonalsolid-phase enzymeimmunoassayinpatientswithacutemyocardialinfarction．

Ｙ・Uji，Ｈ・Sugiuchi，Ｈ､Okabe・

JournalofClinicalLaboratoryAnalysisl991;5:242-246.

4）Measurementofserummyoglobinbyaturbidimetriclatexagglutinationmethod．

Ｙ､Uji，Ｈ､Okabe，Ｈ・Sugiuchi，Ｓ､Sekine・

JournalofClinicalLaboratoryAnalysisl992;6:７←11.

5）SimultaneousautomatedmeasurementofserumtotalCKandCK-MMisoform ratioinserum．

Ｙ・Uji，Ａ・Karmen，Ｈ・Sugiuchi，Ｈ・Okabe，Ｋ・Hata，Ｍ・Miura・

JournalofClinicall-aboratoryAnalysisl994;8:273-276.

6）Chemiluminescenceassayofhumanventricularmyosinlightchain-1(HVMLC-1）

usingafullyautomatedrandomaccesssystem．

Ｈ・Sugiuchi,Ｙ・Uji，Ｈ・Okabe,Ｔ・IkegamiゴＭ､Yamamoto,Ｙ・Sato・

JournalofAnalyticalBio-Sciencel994;１７:344-349.

7）Directmeasurmentofhigh-densitylipoproteincholesterolinserumwith polyethyleneglycol-modifiedenzymesandsulfateda-cyclodextrin．

Ｈ・Sugiuchi,Ｙ・Uji，Ｈ,Okabe,Ｔ・Irie，Ｋ・Uekama,Ｎ・Kayahara,Ｋ・Miyauchi・

ClinicalChemistryl995;４１：717-723.

8)AnovelautomatedassayfOrmalatedehydrogenase(ＭＤＨ)isoenzymesin

humanserum．

Ｈ､Sugiuchi，Ｙ・Uji，Ｙ・Shirahase，Ｈ・Okabe・

JournalofClinicalLaboratoryAna1ysisl995inpress．

c－ＡＳＴ

ｍ－ＡＳＴ

ＣＡＧ ＣＨＥＲ

ＣＨＯＤ

ＣＫ ＣＬＥＩＡ

ＣｙＤ ａ － Ｃ ｙ Ｄ ・ ｓ ｕ Ｉ

ＥＩＡ ＧＨＣＩ ＨＤＬ ＨＶＭＬＣ－Ｉ

Ｉ ｇ Ｇ

ＬＡＤ ＬＣＸ ＬＤ－１ ＬＤＨ ＬＤＬ ｃ－ＭＤＨ ｍ－ＭＤＨ

T－ＭＤＨ ＭＯＰＳ

PＡＬＰ ＰＥＧ ＰＴＣＡ

PＴＣＲ

ＲＣＡ ＲＩＡ ＶＬＤＬ

略

表

本 論 文 で は 以 下 の 略 号 を 使 用 す る 。

cytosolicaspartateaminotransferase，細胞質上清由来アスパラギン酸 ア ミ ノ 基 転 移 酵 素

mitochondrialaspartateaminotransferase，ミトコンドリア由来アスパラ ギ ン 酸 ア ミ ノ 基 転 移 酵 素

coronaryarteriography，冠動脈造影法

cholesterolesterase，コレステロールエステル分解酵素(ＰＥＧ－ＣＨＥＲ；

ＰＥＧ修飾ＣＨＥＲ）

cholesteroloxidase，コレステロール酸化酵素 (ＰＥＧ－ＣＨＯＤ；ＰＥＧ修飾ＣＨＯＤ）

creatinekinase，クレアチンキナーゼ

chemiluminescenceenzymeimmunoassay，化学発光酵素免疫測定法 cyclodextrin，シクロデキストリン

sulfateda-cyclodextrin，硫酸化α一シクロデキストリン enzymeimmunoassay，酵素免疫測定法

guanidinehydrochloride，グアニジン塩酸塩

high-densitylipoprotein，高比重リポ蛋白（ＨＤＬ－Ｃ；ＨＤＬコレステロール）

humanventricularmyosinlightchain-I，ヒト心筋ミオシン軽鎖一Ｉ ｉｍｍｕｎｅｇｌｏｂｕｌｉｎＧ，免疫グロブリンG leftanteriordescendingartery，左前下行枝動脈

leftcircumflexartery，左回旋枝動脈

lactatedehydrogenase-isoenzymｅｌ，乳酸脱水素酵素アイソザイム１型 lactatedehydrogenase，乳酸脱水素酵素

low-densitylipoprotein，低比重りポ蛋白（ＬＤＬ－Ｃ；ＬＤＬコレステロール）

cytosolicmalatedehydrogenase，細胞質上清由来リンゴ酸脱水素酵素 mitochondrialmalatedehydrogenase，ミトコンドリア由来リンゴ酸脱水 素 酵 素

totalmalatedehydrogenase，総リンゴ酸脱水素酵素

3-(N-morpholino）propanesulfonicacid，３－(Ｎ一モリフオリノ）プロパン ス ル フ ォ ン 酸

ｐｙｒｉｄｏｘａｌ５'-phosphate，ピリドキサール５'一リン酸 polyethyleneglycol，ポリエチレングリコール

percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，経皮的冠動脈内形成 術

percutaneoustransluminalcoronaryrecanalization，血栓溶解剤冠動脈 内 注 入 法

rightcoronaryartery，右冠動脈

radioimmunoassay，放射性免疫測定法

verylow-densitylipoprotein，超低比重リポ蛋白（ＶＬＤＬ－Ｃ；ＶＬＤＬコレス

テロール）

第 １ 章 緒 言

従来の急性心筋梗塞の治療は、心筋壊死の進行を阻止するものではなく、壊死が完成 した後、引き続き発生する不整脈、心不全を阻止することがその主たる目的であった。

その後、１９７９年にRentropら1)がstreptokinaseを用いた再潅流療法を報告した。こ

れは、再潅流療法により心筋壊死の進行を阻止、心筋の梗塞を最小限に抑える治療法で ある。心筋壊死は心内膜にもっとも強く出現し、時間経過とともに次第に心外膜側に拡 大する2)。その後の研究で、この壊死をくい止めるには、再潅流療法を発症後６時間以 内に実施しないと心機能の改善は得られないことが示された3-4)。この再潅流療法の有 効性が認識されて約１０年が経過し、その間の死亡率は１/2～1/３程度に減少し5)この 治療の適応性の判断のためには早期診断が必須条件である。

急性心筋梗塞は臨床医にとって極めて日常的な疾患であり、しかも重篤な経過をとる ことが多い。通常、急性期ほど死亡率は高く、再潅流療法の効果を上げるには一刻も早 く診断をつけることが要求される。しかし、その厳密な診断は初期ほど困難である。

一般に心筋梗塞の診断は、１)胸痛、２)心電図の異常(ＳＴ波の上昇とＱ波の出現)、３）

血清逸脱酵素creatinekinase(CK)の上昇、が基準となる。しかし、再潅流療法の治

療効果が最も大きい発症後６時間以内では、ＣＫの上昇はほとんど見られないことが多 い6)。胸痛は心筋梗塞に必ずしも特異的ではなく、心電図変化もＳＴ波の上昇はあって もＱ波の出現は遅く、教科書的な心筋梗塞波形とは異なり、狭心症、心膜炎との鑑別 が困難な場合が多い。しかしながら、それでも有効な診断手段に乏しく、早期の診断に は心電図と冠動脈造影（CAG：coronaryarteriography)の併用に頼らざるを得ないの

が現状であるｑ

急性心筋梗塞と診断されたら、直ちに再潅流療法が実施される。再潅流療法は現在の ところ、１)血栓溶解剤冠動脈内注入法（PTCR:percutaneoustransluminalcoronary

recanalization)1)、２)血栓溶解剤静脈内注入法7)、３)経皮的冠動脈形成術（PTCA：

percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty)8-9)、４)緊急バイパス術10)の４種が

ある。このうち、バイパス術は重症例を対象に救命を主たる目的として行われる点でや や特殊であるが、前3者はそれぞれに特徴を有する手法で、いずれも早期潅流による心 機能の保持が目的である。緊急ＣＡＧの施行可能な施設ではＰTCRが選択されることが

１

０ 5０

００００４３２１

の①コー⑩シ①○仁①』の↑の』』①ロロコー○の①一。三コ三

ｰ － － － ～ －

多く、ｐｒＣＲの成功率は約７５％とされている1)。一部の施設ではＰ1℃Ａが選択され、

成功率は９０％と高いが技術的に熟練を要する11)。逆に静注法は成功率５０～70％(使用 薬剤により異なる)とやや劣る12)が、ＣＡＧを必要とせず、簡便でリスクも少ない。

急性心筋梗塞の予後は再潅流療法により再潅流が成功した場合、急性期の死亡率が大 幅に減少する'3-14)。再潅流療法の成否判定は予後を占う意味で重要であり、心筋梗塞

の血液生化学的検査による従来の診断法だけでは判定に大きな問題を抱えるようになっ た。すなわち、従来の生化学的診断ではＣＫの高い症例ほど梗塞サイズが大きく、心筋 障害が激しいとされてきた'5)。ところが再潅流療法例では、早期に急激な再潅流を受 けると心筋内の蛋白が血中に洗い流されるｗａｓｈout現象により、梗塞サイズを必ずし も反映しない16)。これは血中ＣＫ値を指標とする再潅流療法の効果判定が困難であるこ とを示唆し、臨床上大きな問題となっている。さらに、心筋梗塞の診断的マーカーの中 で、分子量が小さく比較的ｗａｓｈout効果を受けにくいとされているミオシンやミオグ ロビンの測定はradioimmunoassay(RIA)法17)しかなく、煩雑で長時間を要し早期診断

には不向きである。また、ミトコンドリア由来のmitochondrialaspartateamino-

1 ０ ０ １ ５ ０

Ｔ ｉ ｍ ｅ ） o u r ( h

5０ 200

０ 250

Fig.１．TypicaIbloodIeveIsofbiochemicalmarkersinpatientwithacutemyocardial

infarCtionafteronsetofchestpain

O;ＣＫ,●;myogIobin,△;myosin,▲;AST,□;ＭＤＨ．

２

CHDTotaIpopulation ^{Rate/1０００}

inmenaged50-6924）

transferase(ｍ－ＡＳＤやmitochondrialmalatedehydrogenasｅ（ｍ－ＭＤＨ)は心筋壊死

が強い場合に上昇し予後の推定に有効とされている'8)が、その迅速測定法は確立されて いなかった。

患者に対するリスクが少なく、リアルタイムに情報が得られる血液生化学的検査への 期待は大きく、近年、心筋梗塞の早期診断、経時的観察、再潅流療法の成否判定、予後 の推定などにおいて迅速測定が可能な生化学的マーカーの開発が強く求められ、種々の 心筋逸脱酵素、心筋構成逸脱蛋白などの測定が可能となってきた19-20)。Fig.１に示すよ

うに、急性心筋梗塞発症後の生化学的マーカーはそれぞれ特徴ある逸脱パターンを示 す。これらの逸脱パターンから刻々変化する病態の把握がある程度可能である。

心筋梗塞の治療に対しては、いくつかの問題点を残しながらも目ざましい進歩を遂げ ている。治療面での研究と平行して心筋梗塞の予防に関する研究も成果を上げつつある

が、心筋梗塞や虚血性心疾患の既往歴のない高脂血症患者の予防(一次予防)と心筋梗塞 の再発予防(二次予防)についていくつかの報告がなされている21-23)。高脂血症と動脈硬

化との因果関係は、Gordonら24)が大がかりな疫学的調査を実施し、１９８２年に‘‘The FraminghamHeartStudy”に報告したのが最初である。当調査で得られた結果は、

血清コレステロールが２００ｍｇ/dlを越えると心筋梗塞の発生頻度の急激な上昇がみら れることと、high-densitylipoprotein(HDL)一コレステロールと心筋梗塞の発生頻度

が負の相関を示すことである（rablel)。

Number HDL

cholesteroIlevel

３ AIIleveIs

‐25 25-34 35-44 45-54 55-64 65-74 75一

００６６９９１５ ■●●■□■●● ２０３４７７９５ ９８２９７７７８

４１６５ ５０ ６３１ １４０６ １１６８ ５７８ ２１５ １１７

３９８３１５７０ ８７３９４１１ ３

その後、多くの研究者が調査研究を行って同様の結果を得ている。一次予防として、

1984年に発表されたLipidResearchClinicsグループの報告21)は、薬剤による血清コ

レステロールのコントロールが心筋梗塞の予防につながることを実証した点で評価され る。さらに、食事療法により血清コレステロールは１３％減少し、心筋梗塞の発生頻度 は対照群に比べて５０％低下することが報告されている22)。

これらの報告に基づいて、薬剤の効果や食事療法による効果を利用して、二次予防が 可能か否かが注目の的となっている。1987年にBlankenhomらにより報告されたTY1e

Cholesterol-LoweringAtherosclerosisStudy(CLAS)32)では、薬剤（コレスチポー

ル③とナイアシン）を投与した群と食事療法のみの群を２年間追跡調査したところ、総 コレステロール、トリグリセリド、low-densitylipoprotein(LDL)一コレステロールが

それぞれ26,22,43％減少し、ＨＤＥコレステロールが３７％増加した。これに対し、

食事療法のみの群では、それぞれの変化は５％にとどまった。このように、LDI戸コレ ステロールを低く、ＨＤＩ_戸コレステロールを高く維持することが再発予防につながる可 能性が示唆された。ところが、一次、二次予防に重要な情報を提供するＬＤＬ、HDI_戸 コレステロールの測定法は、煩雑で長時間を要する沈殿法や電気泳動法が集団検診や一 般病院で広く用いられている。動脈硬化の予防意識の向上が定着しつつある現在、より 簡便な直接測定法の確立が強く望まれている。

以上のことを背景として、著者は、急性心筋梗塞の治療と予防に際して重要な情報を 提供する血液生化学的マーカーの迅速分析法の開発と診断的有用性の評価を企図して本 研究に着手した。すなわち、心筋梗塞は早期診断→再潅流療法(成否判定)→予後の推定

(リハビリ)→再発予防という治療経過をたどるため、これにそって検討を進めた。

最初に、心筋構成蛋白のミオグロビンやミオシン軽鎖Ｉは分子量が小さいため再潅流

の影響を受けにくく、梗塞量に比例して上昇することから早期診断、再潅流療法の成否 判定に有用と考えられる。そこで第２章では、煩雑なＲＩＡ法により従来測定されていた 心筋構成蛋白のミオシン軽鎖Ｉの迅速測定法の確立と心筋梗塞における診断的有用性の 評価を行った。

前述の如く、ミトコンドリア由来の酵素は細胞障害が強い時のみ上昇するが、その迅 速測定法は確立されていない。また、心筋梗塞における臨床的評価もほとんどなされて いない。本研究では、これらの酵素の迅速測定法の開発と予後の推定を企図し臨床的有

４

用性に関する検討を下記のように展開した。まず第３章では、ヒト肝臓より精製した ｍ－ＭＤＨ，cytosol画分-ＭＤＨ(c-MDH)に対し、蛋白変性剤のグアニジン塩酸塩を作用

させ、ｍ－ＭＤＨのみを特異的に測定する方法を開発した。さらに、心筋梗塞における

ｍ－ＭＤＨの臨床的有用性についても検討を加えた。

第４章では、ヒト肝臓、赤血球をホモジネートしてm-ASrr，cytosol画分一AST(c-

ASDを精製し、これにプロテアーゼを作用させてc-ASTを失活させることでｍ－ＡＳＴ

のみを特異的に測定する迅速測定法を開発した。また、臓器や血清中には補酵素と結合 したホロ型と結合していないアポ型ＡＳＴが存在するため、心筋梗塞におけるアポ型、

ホロ型ｍ－ＡＳＴの臨床的有用性についても検討を加えた。

また、心筋梗塞の再発や動脈硬化の予防の指標として病院や集団検診で広く測定され ているHDL-コレステロールの測定法は、煩雑で多数検体の測定に数時間かかり問題点 が多い。第５章では、反応系にポリエチレングリコール(PEG)修飾酵素とシクロデキ ストリン(CyD)などの糖化合物を用いて、ＨＤＬコレステロール測定に関する直接法を 開発した。本法は、従来法に比べて遠心分離操作を必要とせず、自動分析機に適用でき るなど多くの利点を有し、最近実用化された。

以下に本研究で得られた成果を詳述する。

５

第２章ミオシン迅速測定法の開発と急性心筋梗塞における臨床的

有用性の評価

2-1．序

心筋ミオシンは筋原線維を構成する収縮蛋白で、ＡｆｌＰからの化学エネルギーを収縮 という物理的作用に変換する筋肉の収縮機序において中心的役割を果たしている。その 蛋白分子は、２つの重鎖(分子量約200,000)と小さい軽鎖Ｉ(分子量約28,000)および

軽鎖II(分子量約20,000)のサブユニットから構成されている。矢崎ら25)は、特にミオ

シン軽鎖が、心筋細胞の障害を反映する生化学的マーカーとして以下に示すような特性 を報告した。（１）筋細胞における構造蛋白の約６０％を占め、最も含有量の多い蛋白であ る．(2)心筋と骨格筋ではミオシンのサブユニット構成が異なり、さらに、軽鎖は分子 量のみでなくアミノ酸組成を中心とした一次分子構造が異なる26-27)。(3)各サブユニツ

トはＰＨ変化などにより容易にミオシン分子より解離し、障害時には筋原線維より直接 ミオシン軽鎖が遊離してくる。(4)ミオシン軽鎖は分子量が小さく障害時に細胞外に逸 脱しやすく、ＳＨ基などの含有量が少ない安定な蛋白である28)。(5)ミオシンの各サブユ

ニットは生合成された軽鎖がミオシン分子に組み込まれる前に遊離形で細胞質中に存在 しており、障害時に構造蛋白でありながら早期に細胞外に逸脱してくる29)。

このような生化学的特徴からヒト心筋ミオシン軽鎖－１(HVMLC-I；humanventri-

推定、予後の推定などに関する重要な情報を提供する可能性が示唆されている。

ミオシン軽鎖の測定法としては、ＲＩＡ法30)による方法があるが、煩雑で測定に約２０ 時間も要しベッドサイドにおける迅速測定は困難であり、ＲＩＡ法以外の感度に優れた

固相を用いたモノクローナル抗体によるenzyme-linkedimmunosorbentassay

(ELISA)法31,36)が開発され、ＲＩＡと比較して測定時間も約４時間と短縮したが、操作 が煩雑で熟練を要する。

そこで本研究では、このＥＩＡ法の酵素反応検出系に化学発光を利用した

６

chemiluminescenceenzymeimmunoassay(CLEIA)法を応用して、測定時間４５分

で測定できる完全自動化システムを構築し、さらにこの方法を用いて心筋梗塞における HVMLC-Iの臨床的有用性を検討した。

2-2.測定原理

チューブ固相を用いたへテロジニアスEIAを基本原理とし、標識酵素としてグルコー スオキシダーゼ(G○D)を用いて検体中の抗原と標識抗体のサンドイッチ複合体を形成 させた後、基質としてグルコースを用い、酵素反応により生成する過酸化水素をルミ ノール/マイクロペルオキシダーゼ（m-P○D)の化学発光系に導いて検出する(FYgs,２，

３ )

。

③

Ａ ｇ

- K

・ . ° 1 a . o n l i b

｡

･

ソ l ④ o ａ b ｎ a ｌ , . ｉ . ９ m ． y ， z 次 n ｡

・ a d n i i

b o

･ ソ

g I u c o s e

i l

k 畠

② ＧＯＤ

Fig.２.PrincipIeoftwostepsandwichimmunoassayforHVMLC-Iintheserum

７

Enzymereaction

Labelingenzyme;ＧＯＤ，Substrate;Glucose

Ｈ

r

〕 ９

O H

gIucose

Hglucoseoxidase(GOD）

０ ２ Ｈ ０ 2 ２

＝ １

O H

gIuconicacid

Luminescentreaction Luminescentreagent;Iuminol＋m-POD(microperoxidase）

く

Ｎ Ｈ ２

Ｏ

Ｉ ＣへＮＨ Ｃ－ＮＨ

ｌ ｌ

Ｏ

Ｈ ２ ０ ２

－

ｍ－ＰＯＤ 〕 く

Ｏ

Ｉ Ｃへ０－

Ｃ－Ｏ－

|

’

０

十Ｎ２

luminoI e ） a t t d s t e c i x ( e ５ o n n i - a i - d i n － l e a t h p h o - i n m a

……M……･畑Ｉ

ＣＯＯ－

＋Iuminescence ＣＯＯー

NH2 5

- a m i n o - p h t h a I e i n - d i

~ a n i o n ( g r o u n d s t a t e

）

Fig.３．DetectionofenzymeactivitybychemiIuminescentreactionusingIuminoIand

microperoxidase

2-3.結果

８

2-3-1．ミオシン迅速測定法の開発

2-3-1-1．測定条件の設定

ミオシン測定試薬の最終的濃度は、抗HVMLC-Iモノクローナル抗体(HVMLC-

Table2のように設定した。

Table２．ReagentconstituentsforHVMLC-lassay

Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ

B S a ) b u f f e r ( w a s h s o l L I t i o n

）

enZyma加尼agenif glucoseoxidase glucose acetatebuffer

Lunmescenオノ弓eagenオ

ｌｕｍｉｎｏｌ

ｍ ｉ ｃ ｒ ｏ ｐ ｅ ｒ ｏ ｘ ｉ ｄ ａ ｓ ｅ

ＣＨＥＳｂ）buffer

Concentration

0.01mol/Ｌ(ｐＨ7.4）

4.5ｍＵ/ILgFablfragment l8mg/ｍ1

0.035ｍｇ/ｍ１ ０．１１３ｍｇ/ｍ1 0.05mol/Ｌ(ｐＨ9.5）

a)phosphatebufferedsaline．ｂ)２－(N-cyclohexylamino)ethanesuIfonicacid

2-3-1-2.固相濃度と酵素標識抗体法の検討

従来のＥＩＡをCLEIAに応用する場合、充分な発光量(測定感度)を得るために抗体の

５０，１００，LLｇ/ｍｌの４種類の固相ポリスチレンチューブを作製し、抗ヒトIgGおよび

ｎｇ/ｍｌ)の反応性により検討した。ミオシン濃度が０(buffer)、１，５，２５，１２０ｎｇ/ｍｌ の標準液をそれぞれ固相チューブに加えて測定した場合の発光量(検量線)をFig.４に

較して発光量の幅が狭く、またバックグラウンドの発光量が高く、ＩｇＧの固相への非特

９

Ｏ△□十

抗体の固相濃度は１０座ｇ/ｍｌ程度が適当と考えられた。

ａ

1０００

００１（。①の×く。）

buffer

ＯｊｌＯ

ａ－の仁①一匡一災）匡災）３匡一ＥコーーＥの二○

異的吸着が多いことが示唆された。HVMLC-I抗体が高濃度の固相チューブは高感度に

，９/ｍｌの正常～異常境界域で測定幅が小さくなった。これらの結果より、HVMLC-I

０ ． ０ １

Ｆｉｇ．４．１ntensityofchemiIuminescenceinvariousmyosinconcentrationswithenzyme

IgGIabe１０，５lLg/mI；△，１０肌g/mI;□,50llg/mI；＋,1001』g/m1．

Fab‘IabeI●’５仏g/ｍＩ；▲，１０ﾄLg/ｍＩ；■,５０１Lg/ｍｌ；★,１００lLg/ｍ1．

１ １ ０ １ ０ ０

m y o s i n c o n c e n t r a t l o n ( n g / m l

）

1０００

－１０－

2-3-1-3.モノクローナル抗体の特異性

HVMLC-I以外の類似物質（ヒト心室筋ミオシン軽鎖11，ヒト心房筋ミオシン軽鎖Ｉ，

ヒト心房筋ミオシン軽鎖II，ヒト骨格筋ミオシン軽鎖、ヒト平滑筋ミオシン軽鎖、ヒト 血清ミオグロビン）に対する交叉反応をELISA法にて検討した。Ｔａｂｌｅ３に示すよう

に、ヒト骨格筋ミオシンとの交叉反応が17.6％とやや高値を示したが、その他の類似 物質とは１０％以下の交叉反応を示し、本法のモノクローナル抗体は特異性に優れてい

ると考えられた。

Table３.Cross-reactivityofhumanventicularmyosinlightchain-Iwithother

●

myosIns

００６４６２０ ０８０２ＺＯ

Ｏ１０

１く

C r o s s - 肥 i v i t c a t y (

%

） Myosins

－１１－

Humanventricularmyosinlightchain-I HumanventricularmyosinIightchain-Il Humanatrialmyosinlightchain-l HumanatrialmyosinIightchain-lI HumanskeIetalmusclemyosinlightchain HumanplanemusclemyosinIightchain HumanserummyoglObin

HV1InJC-I標準液(500ｎｇ/ｍｌ)を生理食塩液で５段階希釈して検量線を作製し、

HVMLC-I高値の患者血清を用いて直線性を検討した。その結果、最小測定限界値

０．５ｎｇ/ｍｌで直線性は５００ｎｇ/ｍｌまで得られ、十分な測定範囲であると考えられた

(Ｆ１9.5)。同一サンプルの１０回連続測定での同時再現性は、正常値付近(平均値２．８７

ｎｇ/ｍｌ）および異常高値(平均値10.61ｎｇ/ｍｌ）の測定において、変動係数(ＣＶ値）

はそれぞれ、5.91％および3.91％と良好であった。共存物質であるアスコルビン酸

2-3-1-4.基本的性能の評価

(～５０ｍｇ/dl)、ビリルビン(～40ｍｇ/dl)、グルコース(～1000ｍｇ/dl)、ヘモグロビ

（一Ｅ蔵ｓ一‐○Ｊ三ン工

を添加して行い、回収率は95.5～99.9％と良好であった。

1０００ １

1００ OOOOO

1 ０

（。①の×く１）登一の匡①Ｅ一言①○の①ＥＥ．壱Ｅの二○

10000

ＵＯＯ０Ｕ０００

ン(～500ｍｇ/dl)、乳び(Intra-1ipos、、～1％)などのHVh虹』C-I測定値への影響は

みられず、また、抗凝固剤のクエン酸、EDTA，ヘパリン、フシ化ナトリウム、シュウ 酸による影響も全くなく、本分析法の良好な特異性が示された。添加回収試験は、

HVMLC-I濃度が、３．１ｎｇ/ｍｌおよび16.3ｎｇ/ｍｌの血清にHVMI-C-I(1～４０ｎｇ/ｍｌ）

l / ５ ２ / ５ ３ / ５ ４ / ５ ５ / ５ DiIutionratio

１

０ ． １

【 】

－１２－

0 . 1 １ １ ０ １ ０ ０ １ ０ ０ ０ １ ０ ０ ０ ０ H

V M L C - l ( n g / m I

）

Fig.５．StandardcurvesandlinearityforHVMLC-IusingCLEIAprocedureunder optimaIassayconditions

ChemiIuminescenceintensity(ILAxsec)wasexpressedasafunctionofHVMLC-l

concentration

●

の範囲内にあり、計算による正常値(平均値±２ＳD)は、０～4.3ｎｇ/ｍｌとなった。

０ ５０

y=1.03ｘ＋1.042

r=0.996 ,＝5０

y=1.03ｘ＋1.042

r=0.996

００００４３２１ ,＝5０

（一Ｅうこ匡一の○〆Ｅ）己ｏ二一①Ｅの◎匡①◎の①ＥＥ．一一Ｅの二○

●

従来法のＲＩＡ法（幻と本法①との相関を患者血清７０例を用いて調べた。Ｈｇ､６に 示すように、相関係数r＝0.996、回帰式ｙ＝1.030ｘ-1.042となり、良好な相関を示

した｡‘正常値は、健常人１１３例の血清においてHVMLC-Iを測定し、そのヒストグラ ムより設定した。ヒストグラムは対数正規分布を示し、健常人の99.5％が０～５ｎｇ/ｍｌ

1 ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０

RIAmethod(myosinng/ml）

5 ０ ０

Fig.６.CorreIationbetweenCLMLAandRIAmethodsforHVMLC-l

2-3-2.HVMLC-lの臨床的有用性の評価

2-3-2-1．各種疾患におけるHVMLC-lの評価

－１３－

－１４－

H V M L C - I (

､ g / m I

）

２ ０ ３ ０ ４ ０ 1

０ 5０

０

ＮＯｒｍａｌ （ ） 0 6 = ､ ●

A c u t e m y O c a r d i a I ( n

= 3 2

） _infarction

O l d m y o c a d i a I

（ ） = 1 2 ､

infarCtion

Anginapectoris（､=5）

Heartfailure ） （ 2 = ､ Myocardosis ） （ 5 = ､ Musculardystrophy

（ 2 = ､ 8

） P

O I y m y O s i t i

s ） （ 5 = ､

De『matOmyositis（､=3）

C h r o n i c r e n a I

（ 1 = n 8

） _failure

Liverdisease（､=25）

Others ） （ 5 1 = n

Fig.７．SerumHVMLC-IIeveIsinpatientswithvariousdiseases

2-3-2-2.急性心筋梗塞におけるHVMLC-Iの評価

心疾患の生化学的マーカーとして、ＣＫ、CK-MB，ＣＫ－ＭＭアイソフオーム33)、 ^ヘヘヘ オグロビン、ｌactatedehydrogenase-isoenzymel(I-D-1)34)を測定し、HVMLC-I

との関係を急性心筋梗塞３２症例において比較した。患者血清は、発症から３日間は３ 時間毎に採血し、その後は１日に１回の採血を行ったものを対象として測定した。

Table4に示すように、HVMLC-Iは心筋梗塞発症から６時間以内の早期に上昇は認 健康人(n＝60)、心疾患（ｎ＝56)、筋肉疾患(ｎ＝34)、腎疾患(n＝18)、肝疾患(n＝

25)について、HVMLC-Iを測定し臨床的評価を行った(Ｆ１9.7)。腎疾患と肝疾患では

値の上昇は認められなかったが、筋肉疾患(筋ジィストロフィー、多発性筋炎、皮膚筋 炎)ではその急性期で軽度の上昇が認められた。心疾患では急性心筋梗塞の全症例で著

しい上昇が認められ、陳旧性心筋梗塞、不安定狭心症でも軽度の上昇が認められた。

－頭凸8口

● ● ●

Ｄ●●･●･･･●･ロ●●●副ﾛ8屯

■ ｰ ｰ ● ●

●●

Ｐ

● ● ● 画

、

● ● ● ●

■

函》卸

凸ｑ

● ●

2 0 . 5 ( 8 . 3 - 3 0 . 0

） 1 9 . 5 ( 8 . 3 - 3 0 . 0

） ８ ． ） 0 . ３ 4 1 - 5 . 1 ( ８ ． ） 0 . ５ 4 1 - 3 . 2 ( 2 9 . 5 ( 1 4 - 5 0

） 8 4 . 0 ( 4 8 - 1 2 0

）

withacutemyocardialinfarction

４４

﹈− ３３

FrequencyofOver leveIswithAMIa）

intheearIystage ( w i t h i n 6 h o u I s

）

Hoursto尼ach atmaximaI

a c t i v i t i e s ( r a n g e

）

Duration eIevated

a c t i v i t i e s ( d a y s Marker(尼fe砲､Ｃｅ『ange） ）

3-6 7-14

43％（９/21）

48％(10/21）

67％(14/21）

91％(19/21）

25％（３/12）

０％（Ｏ/13）

CKb)(43-172Ｕ/L）

CK-MB（３－１５Ｕ/L）

CK-MM3/MM1c)(0.3-0.8）

Myoglobin(18-79ｎｇ/m0

LD-1(230-430Ｕ/L）

HVMLC-I(0-4.3ｎｇ/ml）

められないが、その後徐々に上昇して発症から約８４時間で最高値に到達し、その測定

c)CK-MM3/MＭ１；CK-MMisoformratio．

５５●●１１－』１１

－１５－

2-3-2-3.再潅流療法の効果 a

) Ａ Ｍ ℃ Ｉ a 1 i n f i a l I d o c a Ｃ e m y , b ) c u t o n ; a t i Ｋ s e n a e k i t i n B a ; c I

ミオグロビンとＣＫ－ＭＭアイソフオームは、発症から６時間以内の陽性率が９１％と

るのが速い。HVMLC-Iは発症からほぼ６時間後から上昇し始め、７－１４日間に渡り長

期間、異常高値を継続するため、ミオグロビンやＣＫ－ＭＭアイソフォームの測定の機 会を逸した時、心筋傷害の変化を長期的にモーターするのに有用であると考えられる。

Ｆ１9.8に梗塞血管が右冠動脈(RCA;rightcoronaryartery)の同一部位である急性心

筋梗塞２症例について、生化学的マーカーの推移を示す。症例１は、冠動脈血栓溶解療

潅流療法を実施すると、上昇していたＣＫ、CK-MB，ＣＫ－ＭＭアイソフォーム、ミオ

グロビンは急速に低下し数日で正常域に復したが、LD-1、HVMLC-Iは長時間の高値

、。

剛輔罰で計。

Timesfromupperreferencevalues さｇｇ台ｇｇ３９８

一ｍ。画。。

『一ヨの（ゴ○こ『）

一○○一ｍ。

『一『．①（ゴ○匡『）

。。 、。

。＠．の．○コ⑳．＠のの一コくの．○匡のロ一○。。のヨーｏｍ－ｏｍａ－ｍｏヨ四『天の『の、津の『。．の①《○↓◎ゴのの一つ望．^●

○》Ｆロ‐一》●》工くこＦｏＩ胃》□》○不二、》■一○六》レーョ舌の一ｏウーニレ一室ご望三三一・

い、○

“○○

ｰ ０，

、○○

、、。

画の。

の○○

０

を維持するが、成功例では再潅流後、急速なHVMLC-Iの低下がみられた。

１

1 ４ 0０

（一Ｅａｓ－，○Ｊ三ン工

8０

6 ０

4０

2 ０

ＩＤ－１の推移は２症例とも変動傾向は同じで、半減期が７９時間と長いため、長時間高 値を持続した。HVlI虹ＪＣ－Ｉは、症例１では約３０ｎｇ/ｍｌ前後であるが、症例２では４０

～９０ｎｇ/ｍｌの高値を保持した。HVMI-C-Iは血中からの消失率が速い(半減期が約４．５

時間）にもかかわらず長時間高値を示したのは、長期にわたり梗塞部心筋から流出し続 け る こ と に よ る も の と 考 え ら れ る 。

再潅流療法の成功例(n=10）と不成功例(n=5)とでは、各症例でのHVMLC-I最高値

意差(p＜0.001)が認められた。この違いはＣＫ，CK-MB，ＣＫ－ＭＭアイソフォーム、

ミオグロビン、ＬＤ－ｌでは認められない。Fig.９に長期間の観察が可能な３症例(再潅流

療法成功１０例、不成功５例、実施しなかった４例)のHVMLC-I流出パターンを示

す。再潅流療法不成功、実施しなかった例では急速な値の上昇がみられ、長期間高値

４ ６ ８ ２ 1

Ｔ ｉ ｍ ｅ d a y ） (

1 ０ ０ ２

Fig.９．ChangesinserumHVMLC-lIevelsafterreperfusiontherapy

○;norepe汁usiontherapy,●；successfuIrepe巾sion,

■ ； u n s u c c e s s f u I r e p e r f u s i o n ．

－１７－

の①．’⑯ンの○匡①』①↑①』

ｐ＜0.01ｐ＜０．０１ ｐ＜0.01

０

５２

』の。。．ＥＣ』↑の①Ｅ一」

－１８－

５０

冠動脈の梗塞部位と生化学的マーカーの最高値との関係を検討した結果をFig.１０に

anteriordescendingartery;内径約３ｍｍ）、ＬＣＸ(leftcircumfleXartery;内径約１

～２ｍｍ)、ＲＣＡ(内径約４ｍｍ)のそれぞれのsegmentに分類し検討した。RCAseg-

１(ｎ＝６）とＬＡＤｓｅｇ－６，７(ｎ＝８）は、ＣＫ，ＣＫ－ＭＢの最高値において有意差を認めな いが、ミオグロビンでは、ＲＣＡｓｅｇ－１とLADseg-6,7において有意差がみられた(ｐ＜

0.01)がLADseg-6,7とI-CXseg-11,12(ｎ＝４)の間では差はなかった。

HVlI皿』C-Iでは、平均値±ＳＤでRCAseg-1;４８．３±１２．０ｎｇ/ｍｌ，LADseg－６，７；

２２．１±６．４ｎｇ/ｍｌ、LCXseg-11,12；７．８±３．５ｎｇ/ｍｌでありＲＣＡとＬＡＤ，ＬＡＤ

とＬＣＸそれぞれにおいて有意差(p<0.01)がみられた。

Ｆｉｇ．１０．RelationshipbetweencoronarysegmentandmaximumIevelsofcardiac markerproteins

IndexisexpressedasmuItipIesofupperreferenceinterva１．

Ａ;ＲＣＡｓｅｇ－１，Ｂ;ＬＡＤｓｅｇ-6,7,Ｃ;ＬＣＸｓｅｇ-11,12．

ＲＣＡ；ery，onaryartrightcorＬＡＤ；artery，scendingeriordeleftant

Ｌ Ｃ Ｘ ； r y ． a I t e f I e x i r c u m e f t c l

Ａ Ｂ Ｃ ＣＫ－ＭＢ

Ａ Ｂ Ｃ Ｍ ｙ ｏ ｓ ｉ ｎ Ａ Ｂ Ｃ

ＣＫ

A B C

Myoglobin

2-4.考察

近年、血清中微量蛋白の測定法は、ＲＩＡからEIA，ＥＩＡからCLEIAへと移行しつつ ある。これは､EIAが低感度であり、反応時間を長くとらないと比色に十分な感度が得

られないためである。一定の反応時間での感度は、比色法と蛍光法と化学発光法を比較 すると、比色より蛍光が約1,000倍、さらに蛍光より化学発光が約100～1,000倍高い

感度が得られる35)。このため、化学発光法は反応時間を短縮してもＥＩＡ法と同程度ま たはそれ以上の高感度に測定できる。

高感度、測定時間の短縮を目的として、著者はHVMLC-IのＥＩＡ法をCLEIA法に

応用した。その結果、測定は４５分で可能となり、測定範囲が広いため５００ｎｇ/ｍｌまで 直線的(EIA法は１００ｎｇ/ｍｌ)36)に測定できる。また再現性、干渉物質の影響など性能

的に問題もなく、精度と正確性に優れ、さらに、今回測定に使用した化学発光免疫測定

できる測定法となった。

Seidelら37)は、心筋由来と骨格筋由来のミオシン軽鎖は一次構造でＮ末端のアミノ

酸配列が異なることを報告し、Ｗａｎｇら38)は、ポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ法で約 50％が骨格筋由来のミオシン軽鎖が交叉反応を示すとしている。本法で用いた心筋由来

のHVMLC-Iモノクローナル抗体は、骨格筋ミオシン軽鎖と約１８％の交叉反応を示

し、心筋ミオシンに特異性が高いものである。

臨床的には、腎疾患、肝疾患では上昇が見られず、筋肉疾患の急性期で軽度の上昇を

認めた。急性心筋梗塞では100％の陽性率を示し、HVMLC-I値が３０ｎｇ/ｍ1以上の場

合は急性心筋梗塞である可能性が高いと考えられる。さらに、急性心筋梗塞以外の心疾

患(不安定狭心症、心不全、心筋炎)では上昇しないことから、これらの症例は、心筋細 胞の崩壊まで至らないものと考えられ、血中HVMLC-Iの測定が急性心筋梗塞に診断

的特異性が高いことが示唆される。

急性心筋梗塞発症後のHVMLC-I値の変動パターンには、６時間以内の早期上昇は

認められないが、その後徐々に上昇して約３日でピークに達し１週間以上の高値を持続 する。矢崎ら28)は、早期に上昇し、１週間以上にわたり高値を保つ理由として、まずフ

リー分画の軽鎖が血中に流出し、次に梗塞部心筋の細胞構築が１週間以上の長期間にわ

－１９－

たって徐々に崩壊するのと平行して上昇すると報告している。本研究でもこれを裏付け る結果が得られ、このようにHVMLC-I高値持続期間が長いため、他の生化学的マー

カーが正常範囲に復してもHVMLC-Iの測定は、早期診断の機会を逸した場合、ある いは、自覚症状がなかった心筋梗塞患者に有用である。

本研究では、異常高値の程度は再潅流療法の成否と密接に関連することが示唆され た。これは、再潅流療法が心筋細胞崩壊の広がりを防ぐために、HVMLC-Iの流出を低

下させると考えられる。再潅流療法が成功し梗塞部位が再潅流するとHVMLC-Iの急

梗塞部位と最高値との関係では、HVMLC-IのみがＲＣＡ＞ＬＡＤ＞ＬＣＸの順に高値を

示す傾向が認められた。これは梗塞血管が大きいほど心筋の壊死範囲が広いことを示

し、ある程度、梗塞部位の推定が可能であることをも示唆している。

2-5.小括

HVMLC-Iの測定は、従来、ポリクローナル抗体を用いたRIAで測定されており、近

年、モノクローナル抗体によるＥＩＡ法が開発され測定が簡略化された。しかしながら、

それでも測定時間が約４時間と長時間、かつ煩雑であるために、緊急を要する急性心筋 梗塞の診断には不向きである。著者は、このＥＩＡ法を化学発光による測定系に応用し、

45分で測定できるシステムを確立した。本法は、従来法より測定範囲が広く500ｎｇ/ｍｌ

まで測定可能となり、測定精度や正確性も優れ、心筋梗塞の迅速診断に有用性が高いと 考えられる。臨床的には、急性心筋梗塞のみが100％の陽性率を示し、心筋梗塞で診断 的意義が高いことが示された。また、再潅流療法の成功例よりも不成功例が高値を示

し、心筋壊死の程度を反映すると考えられた。また、梗塞血管の大きさに比例して高値

－２０－

第３章ＭＤＨアイソザイム分別定量法の開発と心筋梗塞における

臨床的有用性の評価

3-1．序

リンゴ酸脱水素酵素(malatedehydrogenase;ＭＤＨ,ＥＣ1.1.1.37)は、

し リ ン ゴ 酸 十 N A D ＋ ご オ キ ザ ロ 酢 酸 十 Ｎ A D H ＋ Ｈ ＋

の反応を触媒する酵素で、分子量は約７万であり、約３．５万の２個の同一サブユニット

から構成される。ＭＤＨは心臓、肝臓、腎臓、赤血球、骨格筋などのほとんどの臓器に 存在する。ＭＤＨアイソザイムは、細胞局在の違いによりcytosolに存在するｃ－ＭＤＨ

(ＭＤＨ１）とミトコンドリアに存在するｍ－ＭＤＨ(ＭＤＨ２)と呼ばれる遺伝子の異なる２

種類のアイソザイムがある。逸脱酵素として急性肝炎、心筋梗塞など細胞破壊が著しい 疾患で上昇するが39)､測定方法の感度が低く、測定法も操作が煩雑なので臨床検査には あまり利用されていない。

ＭＤＨ活性測定法としては、オキザロ酢酸を基質にしたβ一NADHの吸光度減少測定 法3)としリンゴ酸を基質にしたβ一NADHの吸光度増加測定法40)がある．吸光度減少測

定法は吸光度増加測定法の約３倍の感度を有しているが、オキザロ酢酸が水溶液中で非

酵素的にピルビン酸になるため乳酸脱水素酵素の干渉を受け、しかも至適濃度域が狭い な ど の 問 題 が あ る た め 、 感 度 の 低 い 吸 光 度 増 加 法 で 測 定 さ れ る 場 合 が 多 い 。 ま た 、 ＭＤＨアイソザイムの測定は、電気泳動法41)、カラムクロマトグラフィー法42)、thio-

NADとβ一ＮＡＤの活性比からｍ－ＭＤＨ量を推定する方法43)が報告されているが、操作

が繁雑で測定に数時間かかり検出感度が低いためあまり用いられない。これらの測定上 の問題点は、種々の疾患での正確な臨床的評価を困難にしており、高感度で迅速な測定 法の開発が望まれている。

そこで本研究では、イオン性界面活性剤や蛋白変性剤がＭＤＨ活性を阻害する44-45）

ことを利用したＭＤＨアイソザイムの分別測定の簡便法を開発し、さらに、種々の疾 患、特に心筋梗塞での臨床的評価を行うことを主な目的とした。

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3-3.結果

3-3-1．ＭＤＨアイソザイム分別定量法の開発

3-3-1-1．至適条件の検討

以下に述べる至適条件の検討から、Table5に示すようなＦＭＤＨとｍ－ＭＤＨ活性 測定の試薬組成を設定した。

Table５．FinalconcentrationsofreagentsfoｒＴ－ＭＤＨａｎｄｍ－ＭＤＨ

TotalMDH Constituent

幽 g 唾 旦

L-malate oxamicacid

MEAbuffer(ｐＨ10.45）

B昌旦g旦皿皇 β-NＡＤ

FinaIconcn．

５０，mol/Ｌ ６３，mol/Ｌ ３００ｍｍｏｌ/Ｌ

３０，ｍｏｌ/Ｌ

ｍ－ＭＤＨ Constituent

雌ｇｅ４ｚｕ

ＧＨＣｌ β-NAD HEPESbuffer(ｐＨ8.0）

旦塑g旦a2

L-maIate

MEAbuffer(ｐＨ10.7）

Finalconcn．

１．４，mol/Ｌ ３０，mol/Ｌ ５０，ｍｏｌ/Ｌ

１００，mol/Ｌ ３００ｍｍｏｌ/Ｌ

FYg､１１に緩衝液、ｐＨとＭＤＨ活性の関係を示す。ｃ－ＭＤＨ，ｍ－ＭＤＨともｐＨ１０．２

～10.6で最大活性を示した。緩衝液は、ジエタノールアミン(DEA)よりモノエタノー

(ＭＥＡのｐＫａ９､５，ＤＥＡのｐＫａ９､0)。反応液中のMEA濃度０．２４mol/Ｌのとき最大 の残存活'性が得られた。

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