第４章プロテアーゼを用いたm-AST直接測定法の開発と心筋梗
4-2-1．m-AST活性測定法
プロテアーゼを用いてc-ASTを特異的に分解、失括させ、残存するm-ASrの活性
を測定する。基質としてレアスパラギン酸および２－オキソグルタル酸を用い、オキザ ロ酢酸とレグルタミン酸を生成させる。生成したオキザロ酢酸をＭＤＨを用いてレリ ンゴ酸とする。このとき、補酵素であるＮＡＤＨはＮＡＤとなるため、３４０ｎｍにおける NADHの吸光度の減少速度からm-ASrを測定する。プロテアーゼ処理なしで測定す
ると総ＡＳＴ(I蚤AST;c-ASr＋m-ASfD活性が得られ、'1砦AST活性からｍ－ＡＳＴ活性 を差し引いてc-ASr活性を求めることができる。
AST
L-aspartate＋２－oxogIutarate一oxaloacetate＋L-glutamate
M D H
oxaIoacetate＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋一二L-maIate＋ＮＡＤ＋
Scheme3・PrincipleofthedeterminationofASTactivity
4-2-2.アポ、ホロ型ＡＳＴ活性測定法
上記の測定試薬(ホロc-ASr，ホロm-ASrを測定)にPALＰを添加し、血清中アポ ASrrをホロ化して活性が増加した分をアポm-ASTとする。同様にアポc-ASTは、プ
ロテアーゼを除いた試薬にＰALPを添加して活性が増加した分(アポc-ASr＋アポｍ－
ＡＳＤから、先に測定したアポｍ－ＡＳｒｒを差し引いて求める。
4-3.結果
4-3-1．m-AST直接測定法の開発 4-3-1-1．至適条件の設定
１００，mol/Ｌのリン酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液およびグッド緩衝液を用いて、精製
－３９－
c-ASr，ｍ－ＡＳｒ活性の至適ｐＨを検討した。リン酸緩衝液では、-号ASrが低活性を示 し、Tris-HCl緩衝液におけるc-ASrr、m-ASrr活性はｐＨ７．５で最大活性を示した。ま
た、PASＴ活性測定値との比較およびm-ASrは、ｃ－ＡＳＴよりも２－オキソグルタル酸
に対して親和性が低いことを考慮して、レアスパラギン酸および２－オキソグルタル酸 の基質濃度は、２－オキソグルタル酸濃度の高い国際臨床化学連合(IFCC)の勧告法66)に
基づいて設定した。lactatedehydrogenase(ＩＤＨ)の添加は、内因性のピルビン酸を
消費してＡＳＴ活‘性の負誤差を回避することを目的とする。試薬成分濃度は、測定値が 一定になり、かつ反応のラグタイムが２分以内という条件下で設定し、その結果を Ｔａｂｌｅ８に示した。
Table８．FinaIconcentrationsofreagentsforhoIo-mASTandapo-mASTassays
Constituent
Ｂ旦旦g旦皿-１
Protease401 N A D H
CHESbuffer(ｐＨ9.5）
(PALPforapo-AST）
且旦旦ｇｇ皿旦 L-Aspartate
2 -O x o g l u t a r a t e
Lactatedehydrogenase MaIatedehydrogenase T r i s b u f f e r ( ｐＨ.5）7
4-3-1-2.プロテアーゼの選択
Finalconcn．
500Ｕ/ｍＬ １．０，ｍｏｌ/Ｌ １００ｍｍｏＩ/L
1001LmolL
270ｍｍo|/Ｌ １２ｍｍｏＶＬ ４．０Ｕ/ｍＬ ２．７Ｕ/ｍＬ １００ｍｍｏｌ/Ｌ
本研究では２４種類のプロテアーゼの中で、最も特異的にc-ASTを阻害したスブチリ シン67)、α-キモトリプシン68)、プロテアーゼ４０１について検討した。これらの熱安定
性を４～37℃で３日間放置し検討した結果をＴａｂｌｅ９に示す。プロテアーゼ４０１はこの 温度範囲ではほぼ100％の活性を維持したが、α一キモトリプシンでは４℃で１０４%、
25℃で８８％、３７℃で１８％、スブチリシンでは､４℃で８６％、２５℃で７４％、３７℃で44％
であり、プロテアーゼ４０１が血清ＡＳＴ活性測定に用いられる３７℃で最も安定であっ
－４０－
1００
T a b l e ９roteasesabilityofthreep.Heatst
F i g . ２０teaseactivityectsofpHonpro.Eff T h e r e I a t i v e p r o t e a s e a c t i v i t y w a s e x p r e s s e d a s a n i n h i b i t i o n o f c -A S T a c t i v i t y a f t e r
incubationwith20ﾄLlofc-AST(2,300Ｕ/L)andlOulofproteaseandmeaSuredat
variouspHvaIues,at37oCfor5min．R e s i d u a l a c t i v i t y (
％ayser3daft)
－４１－
Protease 4.Ｃ 25.Ｃ ３７.Ｃ
○ ； ５ i n ( i s i l b t S u ０ Ｕ , ● I ) / m ； 『 o t y m C h a - 0 Ｕ 2 5 n ( p s i y ▲ I ) , / m ； Ｕ 0 0 , 0 ( 1 0 1 e 4 a s o t e P r I ） / m
a-ChymotrypsinSubtilisin Proteasｅ４０１
４６８０８９１
８８ ７４ １０６
８４６１４９
０
ブタ由来のｃ三ASrを基質として、その活性阻害を測定することによりプロテアーゼ のｐＨ特異性をｐＨ６～１１までの範囲で検討した(FYg､２０)。スブチリシン、α一キモト
た。なお、プロテアーゼ活性はブタc-ASrの酵素活性を５０％阻害する活性を１単位と して表現した。
５ ６ ７ ８ ９ １ ０ １ １ １ ２ ｐＨ
（誤）のの、①ぢ』ｓｏ言皇。⑩①皇⑯一①匡 イ 8 ０
6 ０
４０
2０ Ｏ － Ｃ
｡＝Ｃ
リプシンおよびプロテアーゼ４０１はアルカリプロテアーゼであり、アルカリ領域で高 活性を示すが、第１試薬の条件としては、第２試薬のｐＨと最終反応試薬のｐＨを考慮
して、ｐＫａ＝９．３である１００，mol/Lの２－(N-cyclohexylamino)ethanesulfonicacid
(CHES)緩衝液ｐＨ９．５を用いた。また、ＴａｂｌｅｌＯに示すように、これらのプロテアー ゼは試薬組成中のＩ－ＤＨやＭＤＨに対しても作用し、プロテアーゼ４０１は細菌由来の ＬＤＨ活』性を約２０％、イースト由来のＭＤＨ活性を約１０％失活させ、スブチリシンはブ タＬＤＨに対して影響しないが、細菌由来のＬＤＨ活性を約３０％失活させた。α-キモ
トリプシンはそれぞれにほとんど影響を与えなかったが、熱安定性に優れたプロテアー Ｉ－ＤＨ活』性を約２０％、イースト由来のＭＤＨ活性を約１０％失活させ、スブチ
タＬＤＨに対して影響しないが、細菌由来のＬＤＨ活性を約３０％失活させた。
トリプシンはそれぞれにほとんど影響を与えなかったが、熱安定性に優れた､
ゼとしてプロテアーゼ４０１を選択し、以下の実験に用いた。
Table１０.ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＬＤＨａｎｄＭＤＨ
a-Chymotrypsin
SubtiIisin Proteasｅ４０１
LＤＨ
ＰｉｇｈｅａｒｔＳＥ
1００ １００
８０
1００ ７０ ８０
ＭＤＨ
Ｙｅａｓｔ ＴＦ
1００ ９５
９０ 1００
ValuesarepercentagesofresiduaILDHandMDHactivities・
SE;Ｓ値phyﾉOcoccusep/de"刀眺，ＴＦ;７１heﾉmus＃avus．
4-3-1-3.プロテアーゼインヒビターの影響
プロテアーゼ４０１に対するプロテアーゼインヒビターの影響をヒトc-AST，
ノｕフーノーセ４ｕ１に対りつフロフーノ'－セインヒヒターの影響をヒトc-ASfr，ｍ－ＡＳＩ、を基質として検討した(Tablell)。生体内に存在するα１－アンチトリプシン、α２－マク
ログロブリン、トリプシンインヒビターでは顕著な阻害は認められなかったが、外因性
のオボムコイド、リマ豆トリプシンインヒビター、phenylmethylsulfOnylfluo-ridｅおよびaprotininはプロテアーゼ401を阻害した．
－４２－
０００
T
a b I e l l
・ e a s t e r o f p s o c t f e E f i n h i b i t o r s o n p r o t e a s e 4 0 1 a c t i v i t y
Inhibitor ％(）nao)itibihnl
１０ ５０ １００ ControI
a 1 -A n t i t r y p s i n ( ｍml）g/
１ ５ １０
a 2 -M a c r o g l o b u I i n ( ｍg/ｍｌ）
１ ３ ５
P a n c r e a t i c t r y p s i n i n h i b i t o r ( ｍ）lm/g
０．１ ０．５ １．０
L i m a b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r ( ｍ）g/ml
１ ５ １０
O v o m u c o i d t r y p s i n i n h i b i t o r ( m g / m I
）
１ ５ １０
P h e n y I m e t h y I s u l f o n y l f I u o r i d e ( U g / m l
）
１０ ３０ ５０
A p r o t i n i n ( U / ｍｌ）
４０ １２０ ２４０
EDTA-2Na(ｍg/ｍｌ）
０．４ ０．８ １．２
０
１２４１４５０５０３６９ ５５０１２４ ０００１２３
a)after5minincubationinserumatpH７．８ａｎｄ３７°Ｃ
２０１
－４３－
8 ０
プロテアーゼ401の精製ヒトc-AST，m-ASTに対する阻害効果を、３７℃、５分の反 応条件下で検討した。プロテアーゼ401は３００Ｕ/ｍ１以上でc-ASrr活性を完全に阻害
したが、ｍ－ＡＳｒの活性阻害はほとんど認められなかった(Fig.２１)。しかし、プロテア ーゼ401の５００Ｕ/ｍｌはｍ－ＡＳＴ活性を約６％阻害した(反応２０分後)が、c-ASr活
性を完全に阻害するために要する時間は５分以内であり、ＡＳＴアイソザイムの迅速測 定には充分である(FYg､２２)。
６０
つ 一 Ｃ
1００
4-3-1-4.プロテアーゼ４０１の阻害効果
（誤）言皇。⑮－，コで一の①匡
500 ４０
２０
０
1 ０ ０ ２ ０ ０ ３ ０ ０ ４００
Protease401(U/ｍＩ）
０
F i g . ２ s a e t o r p １ f o s t c e f f E . e 4 0 1 o n A S T a c t i v i t i e s o f c -A S T ( 2 , 0 0 0 Ｕ T S A - m , ) L / ( 6 0 0 Ｕ ） L /
andhumanserum(600Ｕ/ｍＩａｓｃ－ＡＳＴａｎｄｌＯＯＵ/Ｌａｓｍ－ＡＳＴ)after5minincubationat
pH7､５ａｎｄ３７°Ｃ●；c-AST，○；m-AST，▲；serum
－４４－
０ １００
8０
００６４
（誤）二言一一。⑩一画．で一の①匡
2０
０ １０ ５1 ２０
T i m e ( m i n
） ５
Fig.２２.Timecoursesforinactivationofc-AST(2,000Ｕ/L)ａｎｄｍ－ＡＳＴ(1,070Ｕ/L)with protease401(500Ｕ/L)ａｔｐＨ９５ａｎｄ３７ｏＣ
●；c-AST,○；m-AST．
4-3-1-5.m-AST活性阻害に及ぼすアルブミンの効果
プロテアーゼ401は、c-ASI,活性を１００％阻害するがm-AST活性をも少量（約６％）
ではあるが阻害する。このm-ASI､活性に対する阻害を防止するためにＢＳＡ(bovine seruma]bｕｍｉｎ）の効果をプロテアーゼ401、スブチリシン、α一キモトリプシンにつ
－４５－
で約2.8％）のでm-ASr活性の阻害は認められない。
０５
（誤）ニーーンーー。ロトのく，Ｅ－，コで一の①匡
1００ 一 四 一 廻 一 盛
いて検討した(Fig.２３)。その結果、0.5％ＢＳＡの添加で完全にm-AST活性の阻害が回
避された。通常の血清を測定する場合は、アルブミンが血清中に含まれる(反応溶液中
０
０ ０ ． １ ０ ． ３ ０ ． ５ ０ ． ７ ０ ． ９ １ ． １ １ ． ３ １ ． ５
Bovinese｢umaIbumin(％ｗ/v）
F i g . ２３50Ｕnconcentrationsonactivityofm-AST(1,2.Effectsofalbumi/L)after5min
incubationwithproteasesatpH７．５ａｎｄ３７ｏＣ
Ｏ ； 0 0 Ｕ ( 5 s i n y p o t r h y m - c a ● ) , / m l ； 0 Ｕ 5 0 0 1 ( e 4 e a s r o t p L ) ， / ▲ 5 0 Ｕ n ( i s i t i l u b ; s ) ． / m l
－４６－
4-3-1-6.m-AST測定試薬の性能
同一血清の１０回連続測定における同時再現性は、低値(平均値±ＳＤ；６．８±０．６ Ｕ/L)では8.8％、高値(平均値±ＳＤ;５０．４±１．０Ｕ/L)では2.0％の変動係数(ＣＶ値）
を示した。また、同じ血清を用いた１０日間測定における日差再現性は、すべて１０％
以下であった。
プロテアーゼによる阻害は、精製c-ASr活性の7,000Ｕ/Ｌ(正常上限の200倍)まで
完全に不活化することができた。精製したm-ASTを用いての直線性は、1,500Ｕ/Ｌま で認められ、日常検査に供するに充分な結果であった。
共存物質であるビリルビン(～40ｍｇ/dl)、乳ぴ(Intra-lipos③、～１％)、アスコルビ ン酸(～５０ｍｇ/dl)、グルコース(～1,000ｍｇ/dl)、ヘモグロビン(～500ｍｇ/dl)など
のm-AST活性測定値への影響は認められなかった。また抗凝固剤のEDTA、クエン 酸、ヘパリンによる影響も認められず、本法の良好な精度が確認された。
本法と免疫学的分画法との相関を患者血清５５例を用いて検討した結果、相関係数ｒ＝
0.992、回帰式ｙ＝1.05ｘ－１．６８(ｙ＝本法、ｘ＝免疫学的分画法)と良好であった。
4-3-1-7.アポＡＳＴのホロ化条件
m-AST測定試薬は、補酵素のPALＰを含まないためホロ型のｍ－ＡＳＴのみを直接測
定する。さらにこの試薬からプロテアーゼを除いてＦＡＳＴを測定し、計算によりホロ 型のc-ASTを求めることができる。血清中のＡＳＴのアポ型を測定するには、PALＰを
含んだ試薬と血清を反応させてアポ型をホロ化する必要がある。このときの緩衝液、
ｐＨ、PAI_Ｐ量、ホロ化に要する時間について2,000Ｕ/Lの精製アポc-ASrr、アポｍ－
ＡＳｒをＡＳＴフリー血清に添加した試料を用いて、上述のｍ－ＡＳＴ測定の試薬組成を基 本として検討した。
緩衝液：リン酸緩衝液はTris-HCl緩衝液やグッド緩衝液よりもm-ASrr活性が低値 になりホロ化に長時間を要したが、Tris-HCl緩衝液やグッド緩衝液は、ほぼ同程度の 活性が得られた。
至適ｐＨ：PALＰによるホロ化のための至適ｐＨは、m-AST測定試薬からプロテアー
ゼを除いてPALＰを添加した試薬を用いて検討した。Fig.２４Ａに示すように、アポ、一－４７－
ASrはｐＨ8.5、アポc-ASrはｐＨ９．５でホロ化による最大活性が得られ、至適ｐＨは 大きく異なった。この結果から、ホロ化の至適ｐＨは、アポｍ－ＡＳｒとアポc-ASrの 活性が９０％得られるｐＨ９．０を選択した。
ＰALP量：アポm-ASr，アポｃ=ASrのホロ化に必要なPALＰ量は、アポ、穴ASTで は１０“ｍCl/L，アポc-ASTで１００“ｍCl/Ｌとなった(Ｈｇ､２４B)。
1００
8０
（誤）量一芸。、』のく
6 ０
４０
6 . 5 ７ ． ５ ８ ． ５ ９ ． ５ １ ０ ． ５ １ １ ． ５
ＰＨ
2０
Fig.２４(B).EffectsofPALPconcentrationsonASTactivityafter5minincubation
aｔ３７ｏＣ
Ｏ；apom-AST(600Ｕ/L),●；apoc-AST(600Ｕ/L)，▲；holoc-AST(2,000Ｕ/L)．
Theactivitiesofapom-ASTandapoc-ASTafter5minincubationwithPAＬＰ(100 UmoI/L)ａｔｐＨ９､oand37oCwereexpressedaslO０％．
０ ． １ １ ． ０ １ ０ . Ｏ
ＰＡＬＰ）l/LmolL(
０ 1００．０
Fig.２４(A).pHprofilesforASTactivitywithPALPafter5minincubationat37oＣ
Ｏ；ａｐｏｍ－ＡＳＴ(6,00Ｕ/L)ｗｉｔｈＰＡＬＰ(１０ILmol/L)，●；apoc-AST(6,00Ｕ/L)ｗｉｔｈＰＡＬＰ (1001｣ｍＣｌ/L)，▲；hoIoc-AST(2,000Ｕ/L)ｗｉｔｈＰＡＬＰ(500lLmol/L）inthepresenceof
protease401．
－４８－
2０
害よりもPALＰによるホロ化が速く進行することが認められた。
０ 1００
8０
（誤）二言一。画』のく
6０
4 ０
ホロ化に要する時間：アポｍ－ＡＳｒｒはアポc-ASrよりも早くホロ化が終了し、５分で アポ酵素は完全にホロ化された(FYg､２５)。ホロｃ－ＡＳｒはプロテアーゼ４０１の存在下で PALＰと反応させたが、最初の２分で若干の活性増加がみられ、プロテアーゼによる阻
５ ７
Ｔｉｍｅn）(mi
９ １1
３ １
-１
Fig.２５.TimecoursesforactivationofASTwｉｔｈＰＡＬＰａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅ４０１ａｔｐＨ９・oand
37oC
○;apom-AST(600Ｕ/L)withPALP(10仏ｍｏＩＡ),●；apoc-AST(600Ｕ/L)ｗｉｔｈＰＡＬＰ
(10伽、Ｃｌ/L)，▲；ａｐｏｃ－ＡＳＴ(2,000Ｕ/L)ｗｉｔｈＰＡＬＰ(10叩ｍｏI/L)andprotease401 (
5 0 0 Ｕ．)lm/
－４９－
０
とした。
1００
０
０５
（誤）易一一皇。⑯一ｍ弓一の①匡
▲
△
▲○ ▲○
プロテアーゼの反応性：PALＰの存在下でのプロテアーゼ４０１の作用について検討 した(Fig.２６)。ホロm-ASrはプロテアーゼ４０１による阻害は認められなかった。また
アポc-ASrr、ホロｃ－ＡＳｒｒはプロテアーゼ４０１の濃度が５００Ｕ/ｍｌでほぼ失活したが、
2～3％の残存活性が認められた．ＰALPが存在しない場合〔プロテアーゼ４０１が３００ Ｕ/ｍｌで完全にc-ASrは失活した(Ｈｇ､２１)〕と比較して、プロテアーゼ量を多く必要
200 ４ ０ ０ ６ ０ ０ 1０００
P r o t e a s e 4 0 1 ( U / ｍｌ）
８００
F i g . ２ t i T a c A S o n o n s t i r a e n t n c ６ c o 0 1 s e 4 e a o t f p r s o c t f f e . E v i t y w i t h P A L P ( 1 0 0 ｕ ｍ ｏ ｌ / L ）
after5minincubationatpH9・ｏａｎｄ３７ｏＣ
○；apoc-AST(600Ｕ/L),●；holom-AST(2,000Ｕ/L),▲；hoIoc-AST(2,000Ｕ/L）
4-3-1-8.PALＰ添加による測定値の変化
PALＰ添加試薬の性能は添加しない場合（上述）とほとんど変わらなかった。本法で
－５０－
（ごつ）つ。皇のＥ－ｇ－Ｅ①二８ＥコＥＥ一
○四一○○一○ｍ。
。（懸怪ｅ圏・即画）狸慕四ｓ龍達斗露Ｐ起胆屋穿下。〃訳男露憎 起胆目虫下日垂旨襲ｅ埋偶毒小牡Ｕ一筆ロ借ｅ侶螺下日〃Ｉ。語ト心長伽堅ｅ精哩回養 狸Ｊ悪理ｖ品Ｐ判郵霊．。Ⅱ消却叩や員蜂伽円軍国。（鉦判ｅトＮ・助国）狸Ｊ睡理ｖ品・掲 牌○・門型型伊荊堅ｅ憤延回・霊・ＯＬ遥悪理ｅ単埋侶翠下。自虫下日ｅ如蝶ｓ樋Ｊ員艦 如閏司国。（圏・叩国）狸今源蝉Ｐｓｎ里裁悪理ｅ剖填偶毒霊卦燃銀知咲編ｅ員艦閏卑国ｅ
（ミコ）冒呈のＥ－ｇ－Ｅの二ｇＥ．ＥＥ一
○○の○○寸○○Ｎ。
（ミコ）ロ。二①Ｅ－ｇ－Ｅ①二８ＥコＥＥ一
○○の○○寸○○ｍ。
（ミコ）つ。皇のＥ－ｇ－Ｅの二８ＥコＥＥ－
ｏｍ－○○壱○ぬ。
。。○○CＯ“《。←(－１/､)dlV3U11jvlpoUlau』oMIoelo｣．
。。Ｏ くつこ。。
。〔。竜『｡』ｈ/､)dlVdlnoUl1MpoUle山o1lIoelo』． ０。こうＣｌ｡。ｕ〕ｕフＣｕトｈ/､)ｄ~1Vｄ叩１ＭPoUlSu』oMIoelo｣．
～lｎ
。一一○Ｅユロ○一）ＱＪくα言○名一芸』○二一三』のく‐◎で匡⑮』のく，Ｅ』○一 つ○至のＥ－ｍｏ－Ｅ①二．○匡．ＥＥ一の名でこ⑯つ○二①Ｅで①の。。○』Ｑの逼匡①の一三の旦匡○一話一①』』○○・卜“・つ正
。。００ｍ。ｕフーーｈ/､)ｄ~lVdlnoU11AApoUle山oMloa1o』．
唖翫︲﹇
即四‐Ｆｏｘ⑮己