o o o o Q
§
はＩＤＥＣ，ＶＩＤＥＣに対する反応のタイムラグを利用した直接測定が可能である。
1２０
００
○○○ｍの
・狸暮刊脂堤剖Ｕ樋剛曹浸眠恨ｅｓ狸叩や鎖回里 判服知鄭峨ｅ口○ぢ言○﹇騎５判目Ｑ胃シ〃縮蝉ｅ辻縦廻畑剖製蝉ｅ綴蝕鑑迦ｅＰ係膿更ミ
ーロトバムｎ．托亘岬やＵ－ｅ伊奨制服○吊知埋偶毒蝋四ｅｏ‐当口函〃心長咲禦ｅ当郵
寸○↑ד・す ｍｍＶ
ｍ・卜０ｍ・の
○・①０○・ト の①・の ぬぐ
○○○○叩寸
叩○一×卜・す
●。。卜の穏○・トエロ曇①活の一○厘一一一○』①↑の①一○二．》①話』↑圏．の（⑯
ｍｍＶ
ｍ・の０ｍ・の
○・ｍ 囚・の 囚寸
○○○○一ｍ
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Ｑ○工○つ匡⑯匡山工○での一一壱○Ｅ‐①山匹で匡⑯のン一話匡↑ｏの。一一の匡のち囚⑯二○①ＥＣの・の↑①一旦、』
叩○一×卜・す のｍＶ
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０ 1.2
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ハＵく』ｎＵ（４可１１１
戸．１
Ｅ匡○⑩囚話①。匡両。』○の。く
０．８
0.6
0.4
r うじ
ｄＵ､
0.2
さらに、ＣＨＥＲに対するＰＥＧ修飾の度合（修飾率）と酵素活性およびＬＤＬに対す る相対反応性は、修飾率が上昇するほど酵素の相対活性（未修飾の場合をlOOとして）
が減少する傾向がみられた。酵素の修飾率が約４５％における相対活性は約３２％であ り、ＨＤＬに対する反応性は約100％、ＬＤＬに対しては約２０％と著しく相対反応性が 低下し、ＨＤＬに対する選択性が増加した。また、修飾率が４５％を越えるとＨＤＬに対 する反応性が低下する傾向がみられた(mablel6)。ＣＨＯＤも４０％以上のアミノ基修飾
によって同様の現象が見られた。これらの結果に基づいてＰＥＧ－ＣＨＥＲとＰＥＧ－ＣＨ○Ｄ の修飾率はそれぞれ、約４５％、約４２％のものを用いた。
－６６－
０
3０ ２８ 2４ 2６
2２ 2０ 2 2３ ５ １ ５ １ ７ １ ９ ２ １
Fractionno Fractionno
Fig.３２.GeIfiItrationchromatogramsofPEG-CHER(A)andnativeCHER(B）
Ｃｏｌｕｍｎ;Superose6HR＠，○；absorbanceat280nm,●；enzymeactivities．
a；lnCHERsolution(309/L)．
ｂ；Substrate:cholesteroIIinoleate(１０mmoI/L),ｐＨ７．０at37oC c;PEG-CHER1U/ml;CHOD,5U/ml,pH7.0at37oC Table１６.ReIationshipbetWeendegreeofmodificationinPEG-CHERandreaction s
e l e c t i v i t y t o H D L -c h o I e s t e r o l
Activated PEGadded
（/g L ) ａ
Degreeof
modification
Enzymatic a c t i v i t y
(
％ｂ)
・Relativereactivityof c h o I e s t e r o I (
％ｃ)
Ｈ Ｄ Ｌ Ｌ Ｄ Ｌ Ｈ Ｄ Ｌ / L D L
(
％）
T a b l e 1 7 . L i p i d c o m p o s i t i o n s o f i s o I a t e d l i p o p r o t e i n f r a c t i o n s ( m g / g p r o t e i n
）
００５００００ １２５０００
１３５０３０４２０２
■●●■●■１９３１５７ ２４４４
1００．０ ７７．１ ７４．７ ６２．９ ４１．２ ３１．５ ２８．８
100.0 104.7 104.2 100.0 101.4
９９．４ ９３．１
０５０４６２３
●●●●●●●０２３０５０８ ０００４２２１
１１１０２１８６２０ ０００４９９０
■■■■●■●１１１２３４５
L i p i d
－６７－
5-3-4.各種リポ蛋白画分に対する修飾酵素の効果
超遠心法にて分離し、本実験に用いたリポ蛋白画分(HDL、ＬＤＬ、VLDL，chylo-micron）の脂質組成をＴａｂｌｅｌ７に示す。これらリポ蛋白画分に対する修飾酵素の反応 性を検討した。まず、PEG-CHERと未修飾ＣＨＯＤを組み合わせた場合のリポ蛋白画 分に対する反応性を、ＣＨＥＲとＣＨ○Ｄを組み合わせた場合と比較した。PEG-CHER
濃度が0.5～2.0Ｕ/ｍｌでHDL，ＶＬＤＬ、chylomicron由来のエステル型コレステロ
1３８９ ４３２ ２３７ ９２６
ＨＤＬＬＤＬＶＬＤＬＣｈｙＩｏｍｉｃｒｏｎ
TotaIcholesterol FreecholesteroI
T r i g l y c e r i d e s PhosphoIipids
８８０ ４８０ ４５７６ １３７６
８０ ３６ １１４９ １６０ 1９６
６５ ５７ ３４１
１）二ｍ逮叫が盆遂河罰詳再両煎ｇｏ訳丙僻で汁。で誉で舛強酔肖ｂ伊田粥ＳＨ〆叩）マ 腿ｕマメⅦロー）二ｍ違庁ぺ両河司詳強庫八・勺両○ｌ串白河龍洞ひざ．、ｌ得．ｏご苫己。Ｓ盆
逢河罰詳奔ｇｌ誤訳刷猷戸壱Ｓ一」弗剛Ⅲ国津ＳｕマメⅧ口Ｉ）マＳ河司詳什汁叫八淑 働Ｕ詠笥侭．畠と。丹粥．吊閃ｏ奔国ロ伊更事Ｓ一」弗踊田庁訴恥で顛紬害悪言剛嶺罫叫び
価什鷲宮⑮言ベラが認）。群Ｕペ・爵課嶺Ｓ勺両⑦（雨雲汽罰乞汁勺両○離隔盆脹卿）ｄ片蔦 で計響知強聖いきが蒼代山蒼餅慾理叫が鹸咽強猷が。汁雨雲ｓｏ甲田閃代噺諜嶺Ｓ勺画○
作Ｓ前昨雪餅勺両①’○四両宛Ｓ弗廿ご丙逓乞瀞黄門ｂ巨例逮叫小河罰詳奔吉Ｓ一」靴臨画 国津什淵ざ、舛診Ｕ沖（国、、謡団）。何ｓ何代戸胃ｂＦ両津叫び河罰詳Ｓ両「ご弓両の雨 雲聴洲門田滑叫が何件餅引解でぺぢが。
ReIativereactivityofchoIestero１ ．(％）一
。９台ｇｇｇ
Ｉ〆／一○○。、一一・ｍ”
○○二○・ｍ○・の。。↑○・ｍ〆酉へ ＞ 、＝〆
でｍの‐○工ｍ刀（匡一ヨー）
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○函エロｒ●亜Ｆｐｒｂ函くＦｐｒし函◎ゴ『一○ヨー。『○コ．
RelativereactivityofchoIesteroｌ （％）－Ｌ １，コやＯ〕ＯＯＯ ＯＯＯＯ．。○
↓『８℃ｍの（誤）
（、）
○○コＱご◎．（シ）
叫一
０００
０５
１
（誤）一○』①↑の①一○二。↑○ご一差○画の』のン憲一の唾
次に、PEG-CHER(１Ｕ/ｍＤの存在下におけるPEG-CH○Ｄ(1～５Ｕ/ｍｌ)を用いた測
定系での各リポ蛋白画分中のコレステロールに対する反応性について検討した。
FYg､３４に示すように、ＰＥＧ－ＣＨ○Ｄ濃度が４～５Ｕ/ｍｌで、ＨＤＬ100％、ＬＤＬ10％、
ＶＩＤＬ５０％、chylomicron75％の相対反応性を示した。
以上の結果から、ＨＤＬと他のリポ蛋白画分に対する反応性の差が最も大きい酵素濃 度（ＰＥＧ－ＣＨＥＲ１Ｕ/ｍｌ、ＰＥＧ－ＣＨＯＤ５Ｕ/ｍｌ)を以下の検討における添加量とした。
１ ２ ３ ４ ５
PEG-CH○，（u/mI）
０
Ｆｉｇ．３４．EffectsofPEG-CHODconcentrationonrelativereactivitiesofcholesteroIin
variouslipoproteinfractionsinthepresenceofPEG-CHER(１Ｕ/ml)ｉｎＭＯＰＳｂｕｆｆｅｒ (ｐＨ7.0)at37oC
O；ＨＤＬ,●；ＬＤＬ，△;ＶＬＤＬ，▲；chylomicron
－６９－
ｐＨ５～８の範囲でのＬＤＬＣに対する酵素の反応性を、ＣHERとＣＨ○Ｄ、ＰＥＧ－
ＣＨＥＲとＣＨ○Ｄ，ＰＥＧ－ＣＨＥＲとPEG-CH○Ｄの３種類の組み合わせについて検討し た(Fig.３５)。ｐＨ７付近でPEG-CHERとPEG-CHODを用いた場合のＬＤＥＣに対す
る相対反応性は２０％であり著しい低下がみられた。また、ｐＨ７ではPEG-CHERと PEG-CHODを用いたときのＨＤＥＣに対する相対反応性はほぼ100％であったが、
ＶLDI戸C，chylomicron-Cに対する相対反応性は約６０％であった(Fig.３６)。このよう
に、中性および弱アルカリ性領域において修飾酵素と各リポ蛋白コレステロールの選択 的反応が顕著なｐＨ依存性を示したことから、酵素またはアポ蛋白の酸解離の相違(例 えば、ヒスチジンのイミダゾール環の３－Ｎ基;pKa＝6.00、システインのα一アミノ基；
pKa＝８．１８）などが、これらの反応性変化に複雑に関与しているものと推察される。
HDL測定のための至適ｐＨはＨＤＥＣ選択性の高いｐＨ７を選択した。
０００
０５
１（誤）一○』①↑の①一．二。↑○昏一皇。、①』①ン需一①唾
公司公君公 ﾛ一四一日匡g－Ｑ－ｏ－ｃ－Ｃ 5-3-5.ｐＨの効果
５ ６ ７ ８
p Ｈ Fig.３５.pHprofiIesforrelativereactivitiesofchoIesteroIinLDLfractionwithnativeand
PEG-modifiedenzymes(ＣＨＥＲ１Ｕ/mI,CHOD:５Ｕ/mI)inMOPSbufferat37oC
O；ＣＨＥＲａｎｄＣＨＯＤ,●；ＰＥＧ－ＣＨＥＲａｎｄＣＨＯＤ,△；ＰＥＧ－ＣＨＥＲａｎｄＰＥＧ－ＣＨＯＤ
－７０－
０
（誤）一○』の↑の①一○二○一○言三○⑯の』のン需一の匡 1００
U
に ご G ｡ ま = 望 芸 ﾐ － ０ － O ~ Ｃ
、 A
、
、 瞳 ‘ ≧ ､ ：
5０
p Ｈ
６ ７ ８
F i g . ３eerviatlre６rfosIeiofrHpp. a c t i v i t i e s o f c h O I e s t e r o l i n v a r i o u s l i p o p r o t e i n f r a c t i o n s
withPEG-CHER(1U/ml)andPEG-CHOD(５Ｕ/ml)inMOPSbufferat37oC
O;ＨＤＬ，●:ＬＤＬ，△:ＶＬＤＬ，▲:chyIomicron．
5-3-6．a-CyD・sulの効果
１４種類のＣｙＤとそれぞれのリポ蛋白画分との相互作用を検討した結果、Mg2＋の存 在下でa-CyDsulのみがLDL、VLDL，chylomicronに作用し、濁度上昇が起こるこ
とを見い出した(Fig.３７)。これは、a-CyDsulの空洞の大きさや包接能とは関係なく むしろ硫酸化の程度に依存すると考えられる。Burkeら89)はa-CyDsulがへパリン
様活性を示し、グルコース単位当たり２個の水酸基が硫酸基に置換されると、顕著な活
－７１－
性を示すことを報告している。本研究では、このことを考慮して平均置換度１２のαー CyDsulを用いた。a-CyDsulは非結晶性白色粉末で、水に溶け易く、負電荷を有す
る硫酸基が環状に密に配向するため、ヘパリンやデキストラン硫酸などよりも荷電密度 が高い90)。a-CyDsulは、ヘパリンやデキストラン硫酸など硫酸化多糖類と同様にア
ポＢ蛋白に富むリポ蛋白画分(chylomicron､VLDL、LDL)と強く相互作用しFig.３７ に示すような濁度上昇を惹き起こしたものと推察される。
ControI
a-CyD 6-CyD
Y-CyD HE-l3-CyD HP-aFCyD
HP-6-QyD DM-β-CyD TM-β-CyD CM-β-CyD
G 1 -l 3 -C y D
G 2 -c L -C y DG 2 -β Ｃ - ｙ Ｄ
ａ－ＣｙＤｓｕＩ ＰＭ－β-CyD
ＨＤＬ
職 趨
懸 ＝
書 琴
，
LＤＬ ＶＬＤＬ ＣＭ
§識、、.､､､､賦輸
Ｉ ‐ １ ０ Ｌ １ １ ． Ｌ Ｉ 上 一 一 一 一
０ ０ ． １ ０ ０ ． １ ０ ０ ． １ ０ ０ ． １ Absorbanceat340nm
F i g . ３interoopipfIoty７dibiurntiseeacrIn. f r a c t i o n s t r e a t e d w i t h C y D s (
５ｍｍｏＩ)ａ/Lｔ
３７°CforlOmin
HE2-hydroxyethyl,HP;2-hydroxypropyl,DM;2,6-di-O-methyl,
ＴＭ;2,3,6-tri-O-methyl,ＣＭ；O-carboxylmethyI，Ｇ１；６－O-glucOsyl，
Ｇ２;６－○一yl，maltosＰＭthyIated．;partiaIIyme
－７２－
Chyromicron
ＬＤＬ ＶＬＤＬ
０００
０５
１
（誤）一ｏ』の》の①一ｏ二・↑ｏら一三○⑯の』のン濡一の匡
5 ０ ００
5０
0０ 壁 － ０ － ０ － ０ － 【 】 0０
秤 = Z 三 ヌ E ﾆ
ＨＤＬ
5 ０
０
α一一弓α－－弓６
－７３－
ＨＤＥＣの直接測定のためには、ＨＤＬ以外のリポ蛋白画分の反応を完全に抑える必 要がある。この目的のためにPEG修飾酵素を用いたコレステロール測定系に、酵素反 応開始前にａ－ＣｙＤ･sul(0～５，mol/L)とMgCl2(０．５，１．０，２．０，mol/L)を測定系
に加え、HDL以外のリポ蛋白画分コレステロールに対する反応性を検討した(Ｈｇ､38)。
PEG-CHER(１Ｕ/ｍｌ)、PEG-CH○Ｄ(5Ｕ/ｍｌ)、ｐＨ７．０，３７℃、１０分間反応の条件下
で、ＨＤＥＣに対する反応性の低下はほとんど認められなかったが、a-CyDsul(０．５
，mol／L)およびMgCl2(２，mol/L)添加の条件下で、Ｉ_ＤＥＣに対しては約２０％、
VLDEC，chylomicron-Cに対しては約８０％の低下がみられた。
さらに、残存するリポ蛋白画分のコレステロールの反応性を抑えるために少量のデキ ストラン硫酸(０．５９/L)を測定系に加えたところ、ＨDEC以外のコレステロール反応
は完全に消失した(FYg､３９)。a-CyDsulを添加しない条件下では、デキストラン硫酸
は反応混合液の濁りを生じＨDEC測定の反応を妨害した。デキストラン硫酸を含む 反応溶液(R三1;Reagentl)は血清と混合すると濁りによる吸光度上昇(△Abs.)が大き
a -C y D s u I ( m m o I / L
）
F i g .
３８.Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆａ－ＣｙinroIsteolefchesoＤvitictireaivelatnreI2oMgCandsuI･
v
a r i o u s l i p o p r o t e i n f r a c t i o n s w i t h P E G -C H E R ( １ Ｕ / m I ) a n d P E G - C H O D ( ５ Ｕ / m I ）
inMOPSbuffer(ｐＨ7.0)ａｔ３７ｏＣＯ；０．５，mol/ＬＭｇＣｌ２，●；１，mol/ＬＭｇＣｌ２，△；２，ｍｏｌ/ＬＭｇＣＩ２．
０ ０
０ ２ ４ ６ ０ ２ ４ ６ ０ ２ ４ ６ ０ ２ ４ ６
１Ｊや１
。＠．“の．ｍ幸の。誘○↓三，○一ｍ○コ『の一ｍこぐの『の、ｏ雲く三のの○↓◎ゴ○一のの一の『○一ヨく、『一○厘の一一℃○つ『○一の一コ
↓『ｍ◎雪○コの乏一芸℃ｍの‐○工ｍ刀（一Ｃヘヨー）》万ｍの‐○工○口（、Ｃヘヨー）一厘’○『ロ・の匡一（○・ｍヨヨｏ一戸）》
四コＱＱの蓉国コの三里の（○・○ｍ誤）一コ三○℃のワニの『（ロエ『．○）里ｓｏ○・
○》工ｏｒ●一戸ロｒ陽一くＦｐｒし一○ゴ『一○ヨー。『○コ．
Absorbanceat555nm 一 ○。
コム の⑯『色．】
↑
RelativereactMtyofchoIesteroI(％） 一 （Ｊ１０ ０。。
、
『一『ゴの（コニコ）
一○○
０
詞０画
↑
レアロの．
一ｍ①
互い、＋（ヨヨ○一Ｆ）
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。、、や○・○コの．＠のの．一コ凹可の○『す⑳．○の○↓の①己ヨ里、、、コヨーコロこ◎のＱ
（○・○○ｍ誤乏く）一コ芸の↓一『の《『の、、の．一のｏ一二○コ（ア）の己の↓↓の◎厨◎↓
のロの○『ロ四コ◎の。ゴ四コ、のの（、）
難で八○・．○一くの．乏一芸○三Ｒ‐○ペロ・の三．
。
△Absorbance(％）
０１ ０Ｉ
や○ ○二
Ｑ‐○ペロ・の三
○・ｍ一
一・の三（コヨゴ○一へＦ）
三一一一コＱの×言四コの匡一↓画↓の
Ｒ‐○『ロ・の三○コ芸の
０．０５
5-3-7.各リポ蛋白画分の反応曲線
前節までの結果に基づいて、血清中ＨＤＥＣを選択的に測定するための試薬組成を Tablel4のように設定した。この反応試薬を用いて、リポ蛋白画分に対する酵素反応
により生成したキノン色素の吸光度を波長５５５ｎｍで１５秒間隔で５分間測定した時間
推移をＨｇ､４１に示す。本試薬はHDECに特異的であり、ＬDEC，VLDEC，chylo-micron-Cに対しては吸光度の増加を示さなかった。ＨＤＥＣは、酵素試薬(R-2)を添
加後約３分で吸光度の増加がほぼプラトーに達し、短時間でＨＤＥＣの測定が可能なこ とが示唆された。
0.2
０
Ｅこの叩の話の○匡⑩ｅ○の。く
0.15
２←Ｒ
０．１
く、測定値に影響を与えた(Fig.４０A)が、a-CyDsul(0.5～１．０，mol/I_)存在下では 濁度の減少がみられた(Fig.４０B)。
０
１ ２ ３
Ｔｉｍｅin）(m
４ ５
F i g . ４１．ithctionswoteinfrasIipoprinvariouesteroIonofchoIereactisesofthTimecour
PEG-modifiedenzymeSiｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆａ－ＣｙＤ・suI，MgCI2anddextransuIfateat pH6､5,37oＣ
Ｏ:ＨＤＬ,●:ＬＤＬ，△:ＶＬＤＬ,▲:chylomicron．
－７５－