神経障害性疼痛の治療薬に関する研究

第 二 章 神 経 障 害 性 疼 痛 へ の TRPV1 チ ャ ネ ル の 関 与

第 二 章 で は 、 炎 症 反 応 に よ り 誘 発 さ れ る 疼 痛 の 標 的 チ ャ ネ ル の 一 つ と 推 測 さ れ て い る TRPV1（ Transient receptor potential vanilloid 1 ）チ ャ ネ ル に 着 目 し た 。TRPV1 チ ャ ネ ル の 分 布 を 調 べ る た め 、 ラ ッ ト の 坐 骨 神 経 を 結 紮 し て 作 製 し た 神 経 障 害 性 疼 痛 モ デ ル か ら 、坐 骨 神 経 の 細 胞 体 で 構 成 さ れ る 腰 部（ L4-L5）後 根 神 経 節 を 採 取 し 、 TRPV1 チ ャ ネ ル の 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 TRPV1 チ ャ ネ ル は 、 主 に 痛 覚 伝 達 を 担 う 無 髄 C 線 維 に 発 現 す る こ と が 示 さ れ た 。 次 に 、 TRPV1 チ ャ ネ ル 選 択 的 遮 断 薬 の BCTC （ N-(4-tertiarybutylphenyl)-4-(3-chloropyridin-2-yl)tetrahydropyrazine-1(2H)-carbox-amide）の 神 経 障 害 性 疼 痛 に 対 す る 効 果 を 調 べ た 。ラ ッ ト（ Figure 2a）あ る い は マ ウ ス の 神 経 障 害 性 疼 痛 モ デ ル に BCTC を 投 与 し た と こ ろ 、疼 痛 閾 値 が 高 値 と な り 、 神 経 障 害 性 疼 痛 の 症 状 が 改 善 さ れ た 。さ ら に 、カ プ サ イ シ ン 誘 導 体 resiniferatoxin （ RTX）を ラ ッ ト 神 経 障 害 性 疼 痛 モ デ ル に 投 与 し 、TRPV1 チ ャ ネ ル を 介 す る 一 次 感 覚 神 経 の 伝 達 を 低 下 さ せ た と こ ろ 、 BCTC 投 与 の 結 果 と 同 じ く 、 疼 痛 症 状 が 改 善 さ れ た （ Figure 2b）。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 TRPV1 チ ャ ネ ル が 神 経 障 害 性 疼 痛 の 維 持 に 関 与 す る こ と が 示 さ れ た 。同 時 に 、TRPV1 チ ャ ネ ル 遮 断 薬 は 神 経 障 害 性 疼 痛 の 治 療 薬 に な る 可 能 性 も 示 す こ と が で き た 。

Figure 1 Effects of IgG on neuropathic pain in mice with partial sciatic nerve ligation (PSL). (a) Data are expressed as the median force (g) required to induce paw withdrawal, and vertical bars represent 1st and 3rd quartiles (n= 14-15/group). * P<0.05, ** P<0.01 vs. vehicle, and ## P<0.01 vs. before surgery (Dunnett’s test). (b) The mRNA expression levels of TNF-α and MCP-1 were measured using qRT-PCR at post operative day 1. The amount of the target mRNA relative to the expression of GAPDH mRNA are expressed as the mean±SEM (n=10). * P<0.05, ** P<0.01 and *** P<0.001 (Tukey’s test).

(a) (b) 0 7 14 21 28 0.001 0.01 0.1 1 10 IgG 400 mg/kg/day Vehicle * ** ## ## ## ## ## * * IgG 1,000 mg/kg/day

Days post operative

P W T ( g ) Vehicle or IgG Re la ti v e l e v e l, x 1 0 -3 0 1 2 3 4 5 ** TNF- * Vehicle IgG PSL Sham Vehicle Re la ti v e l e v e l, x 1 0 -3 0 100 200 300 400 500 *** * Sham Vehicle IgG PSL MCP-1 Vehicle

Figure 2 Effects of BCTC and resiniferatoxin (RTX) on neuropathic pain in rats with chronic constriction injury of sciatic nerve (CCI). Data are expressed as the median force (g) required to induce paw withdrawal, and vertical bars represent 1st and 3rd quartiles (n= 6-8/group). (a) BCTC were orally administered to rats. ##p<0.01 vs. CCI/vehicle group (Mann-Whitney’s U-test). * P<0.05, ** P<0.01 vs. CCI/vehicle group (Dunn’s test). (b) RTX was subcutaneously administered to rats. #P<0.05, ##P<0.01 vs. CCI/vehicle group (Mann-Whitney’s U-test). *P<0.05 vs. CCI/vehicle group (Mann Whitney’s U-test).

第 三 章 神 経 障 害 性 疼 痛 へ の 脊 髄 カ ン ナ ビ ノ イ ド CB2受 容 体 の 関 与 一 次 感 覚 神 経 を 介 し て 伝 達 さ れ た 侵 害 刺 激 は 、 脊 髄 後 角 に 存 在 す る 様 々 な 神 経 伝 達 物 質 を 介 し て 二 次 神 経 へ と 伝 達 さ れ 、脊 髄 -視 床 路 あ る い は 脊 髄 -網 様 体 路 を 経 て 、 大 脳 知 覚 領 野 で 痛 み の 感 覚 と し て 認 識 さ れ る 。 近 年 、 末 梢 神 経 か ら の 持 続 的 な 異 常 入 力 が 、 脊 髄 グ リ ア 細 胞 を 活 性 化 さ せ 、 脊 髄 後 角 の 神 経 細 胞 の 反 応 閾 値 の 低 下 が 誘 発 さ れ る と の 仮 説 が あ る 。 末 梢 神 経 系 だ け で な く 、 脊 髄 で の 炎 症 反 応 も 神 経 障 害 性 疼 痛 の 発 症 に 関 与 す る こ と が 推 察 さ れ る こ と か ら 、 脊 髄 で の 炎 症 反 応 に 関 与 す る 分 子 カ ン ナ ビ ノ イ ド CB2 受 容 体 に 着 目 し 、 神 経 障 害 性 疼 痛 へ の 関 与 に つ い て 検 討 し た 。 カ ン ナ ビ ノ イ ド 受 容 体 に は 、 カ ン ナ ビ ノ イ ド CB1 と CB2受 容 体 の 2 種 類 の 受 容 体 サ ブ タ イ プ が あ り 、と も に Gi / oタ ン パ ク 質 共 役 型 の 受 容 体 で あ る 。 カ ン ナ ビ ノ イ ド CB1 受 容 体 刺 激 薬 は 、 脊 髄 の CB1 受 容 体 を 介 し て 鎮 痛 作 用 を 示 す こ と が 知 ら れ て い る の で 、cAMP 産 生 能 の 減 弱 を 指 標 に 、被 験 薬 の カ ン ナ ビ ノ イ ド CB1 及 び CB2 受 容 体 刺 激 作 用 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、 JWH133 （ (6aR,10aR)-3-(1,1-Dimethylbutyl)-6a,7,10,10a-tetrahydro-6,6,9-trimethyl-6H-dibenzo [b,d]pyran）は カ ン ナ ビ ノ イ ド CB2受 容 体 へ の 刺 激 作 用 を 示 し 、そ の EC5 0値 は 63 nM、 か つ 最 大 抑 制 率 は ほ ぼ 100%で あ っ た 。 JWH133 は カ ン ナ ビ ノ イ ド CB1受 容 体 よ り も カ ン ナ ビ ノ イ ド CB2受 容 体 に 対 し て 、約 40 倍 の 高 い 親 和 性 を 示 し た（ Figure 3a）。 次 に 、JWH133 を マ ウ ス 神 経 障 害 性 疼 痛 モ デ ル の 脊 髄 く も 膜 下 腔 内 に 投 与 し た と こ ろ 、 疼 痛 閾 値 が 高 値 と な り 、 神 経 障 害 性 疼 痛 の 症 状 が 軽 減 さ れ た 。 さ ら に 、 カ ン ナ ビ ノ イ ド CB2受 容 体 knockout（ KO） マ ウ ス で は 、 JWH133 の 神 経 障 害 性 疼 痛 改 善 作 用 が 観 察 さ れ な か っ た （ Figure 3b）。 こ れ ら の こ と か ら 、 脊 髄 の カ ン ナ ビ ノ イ ド CB2 受 容 体 を 標 的 と し た 薬 物 は 、 神 経 障 害 性 疼 痛 の 治 療 薬 に な る 可 能 性 を 示 し た 。

Figure 3 Effects of i.t. administration of JWH133 on neuropathic pain in mice with partial sciatic nerve ligation (PSL). (a)

The ability of JWH133 to activate mouse CB2and CB1receptors was assessed in a functional cAMP assay using CHO cells

expressing recombinant mouse cannabinoid receptors. (n=2). (b) Data are expressed as the median force (g) required to induce paw withdrawal, and vertical bars represent 1st and 3rd quartiles (n= 8-10/group). *P<0.05, **P<0.01 vs. PSL/vehicle group (Mann-Whitney’s U-test).

(a) -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -20 0 20 40 60 80 100 120 _A CB1 CB2 JWH133 (log M) % of c on tr ol -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -20 0 20 40 60 80 100 120 _A CB1 CB2 CB1 CB1 CB2 CB2 JWH133 (log M) % of c on tr ol □ CB1 ■ CB2 % of Co nt rol JWH133 (log M) -5.00 0.001 0.01 0.1 1

論 文 審 査 の結 果 の要 旨 疼 痛 は 、 生 体 の 損 傷 あ る い は 障 害 が 生 じ た 時 に 危 機 回 避 を 行 う 上 で 最 も 重 要 な 感 覚 と さ れ 、 第 6 の バ イ タ ル サ イ ン と も 呼 ば れ る 。一 方 、実 質 的 な 組 織 傷 害 が 修 復 さ れ て い る に も 関 わ ら ず 、 疼 痛 が 持 続 す る 状 況 は 慢 性 疼 痛 と 呼 ば れ る 。 慢 性 疼 痛 は 、 バ イ タ ル サ イ ン と し て の 疼 痛 の 生 理 学 的 な 役 割 を 逸 脱 し 、 患 者 の 生 活 の 質 (QOL) を 著 し く 低 下 さ せ る 。慢 性 疼 痛 の 中 で も 神 経 障 害 性 疼 痛 は 治 療 が 難 し く 、そ の 治 療 は 患 者 の QOL の 改 善 に 大 き く 寄 与 す る と 期 待 さ れ る 。 こ の 神 経 障 害 性 疼 痛 の 治 療 で は 、 薬 物 に よ る 治 療 が 主 流 と な る 。 し か し な が ら 、 現 時 点 で 神 経 障 害 性 疼 痛 に 用 い ら れ る 薬 物 は 、 眠 気 お よ び 眩 暈 な ど の 中 枢 性 の 有 害 事 象 を 発 症 す る 頻 度 が 高 い た め 、 患 者 の 薬 物 治 療 へ の 満 足 度 は 非 常 に 低 い 状 態 に あ る 。 そ の た め 、 新 た な 機 序 の 神 経 障 害 性 疼 痛 治 療 薬 の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 神 経 障 害 性 疼 痛 モ デ ル を 用 い 、 神 経 障 害 疼 痛 が 生 じ る 機 序 お よ び 新 た な 疼 痛 治 療 薬 の 作 用 点 に つ い て 検 討 し た 。 第 1 章 で は 、 神 経 障 害 性 疼 痛 へ の 炎 症 反 応 の 寄 与 に つ い て 検 討 し た 。 神 経 障 害 性 疼 痛 が 発 症 し て い る 状 態 で 、 坐 骨 神 経 で の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 発 現 レ ベ ル の 上 昇 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 を 見 出 し た 。 免 疫 系 細 胞 の 活 性 化 を 抑 制 す る 免 疫 グ ロ ブ リ ン 投 与 が 、 神 経 障 害 性 疼 痛 を 軽 減 さ せ た こ と か ら 、 疼 痛 の 発 症 に 末 梢 神 経 か ら 脊 髄 神 経 で の 炎 症 反 応 が 関 与 す る こ と を 示 し た 。

第 2 章 で は 、transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) チ ャ ネ ル の 神 経 障 害