慢性特発性蕁麻疹患者における

慢性特発性蕁麻疹患者における

抗 IgE 自己抗体および抗 FcεRIα 鎖自己抗体の 臨床的意義

日本大学大学院医学研究科博士課程 内科系皮膚科学専攻

伊﨑 聡志

修了年 2017 年

指導教員 照井 正

慢性特発性蕁麻疹患者における

抗 IgE 自己抗体および抗 FcεRIα 鎖自己抗体の 臨床的意義

日本大学大学院医学研究科博士課程 内科系皮膚科学専攻

伊﨑 聡志

修了年 2017 年

指導教員 照井 正

目次

概要

・・・・・

1

緒言

・・・・・

4

1

．慢性特発性蕁麻疹

・・・・・

4

2.

慢性特発性蕁麻疹とマスト細胞

・・・・・

4

3.

慢性特発性蕁麻疹と自己抗体

・・・・・

5

4.

自己血清皮内テスト（

autologous serum skin test, ASST

）

・・・・・

6

研究の目的

・・・・・

7

期待される成果

・・・・・

7

対象・使用試薬

・・・・・

8

(1)

倫理的考慮

・・・・・

8

(2)

対象

・・・・・

8

(3)

使用試薬

・・・・・

8

方法

1

・・・・・

11

1-1.

検体血清からの

IgG

の精製

・・・・・

11

1-2.

抗

IgE

抗体濃度測定

・・・・・

11

1-3.

リコンビナント可溶性

FcεRIα

鎖細胞外領域の精製

・・・・・

12

1-4.

抗

α

鎖抗体濃度測定

・・・・・

14

1-5. ASST

・・・・・

15

1-6.

患者背景との比較

・・・・・

15

1-7.

統計解析

・・・・・

16

結果

1

・・・・・

17

1-1. CSU

患者群と

NC

群間の精製

IgG

に含まれる抗

IgE

抗体濃度の比較 ・・・・・

17 1-2. CSU

患者群と

NC

群間の従来法抗

α

鎖抗体濃度の比較

・・・・・

17

1-3.

抗

IgE

抗体濃度と従来法抗

α

鎖抗体濃度の相関

・・・・・

17

1-4. ASST

陽性群と陰性群間の抗

IgE

抗体濃度、従来法抗

α

鎖抗体濃度の比較

・・・・・

18 1-5.

抗

IgE

抗体濃度高値群と低値群における臨床的特徴の比較

・・・・・

18

1-6. ASST

陽性群と陰性群における臨床的特徴の比較

・・・・・

19

1-7.

シクロスポリンの治療効果の比較

・・・・・

19

小括

1

・・・・・

21

方法

2 ・・・・・ 22

2-1.

血清中の可溶性

α

鎖濃度の測定

・・・・・

22

結果

2 ・・・・・ 23

2-1. CSU

患者群と

NC

群間の血清中の可溶性

α

鎖濃度の比較・・・・・

23

小括

2

・・・・・

24

方法

3

・・・・・

25

3-1.

フリーの抗

α

鎖抗体と

IgG

の片側、および両側の可変領域に可溶性

α

鎖を 結合した抗

α

鎖抗体（以下総抗

α

鎖抗体と呼ぶ）の濃度測定

・・・・・

25

3-2. IgG

の片側、および両側の可変領域に可溶性

α

鎖を結合した抗

α

鎖抗体

（可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体）の濃度測定

・・・・・

26

3-3.

フリー抗

α

鎖抗体濃度の測定

・・・・・

26

結果

3

・・・・・

27

3-1. CSU

患者群と

NC

群間の総抗

α

鎖抗体濃度の比較

・・・・・

27

3-2. CSU

患者群と

NC

群間の可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体濃度の比較 ・・・・・

27 3-3. CSU

患者群と

NC

群間のフリー抗

α

鎖抗体濃度の比較

・・・・・

27

小括

3

・・・・・

28

方法

4

・・・・・

29

4-1.

各抗

α

鎖抗体の

IgG1

、

IgG4

分画の測定

・・・・・

29

結果

4

・・・・・

30

4-1. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画総抗

α

鎖抗体価の比較

・・・・・

30

4-2. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体価の比較 ・・・・・

30 4-3. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画フリー抗

α

鎖抗体価の比較 ・・・・・

30 4-4. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG1

分画および

IgG4

分画総抗

α

鎖抗体の比の 比較

・・・・・

31

小括

4

・・・・・

32

方法

5

・・・・・

33

5-1. EXiLE

法によるマスト細胞活性化能の測定

・・・・・

33

結果

5

・・・・・

35

5-1. CSU

患者群と

NC

群間の

EXiLE

法によるマスト細胞活性化能の比較 ・・・・・

35

小括

5

・・・・・

36

考察

・・・・・

37

まとめ

・・・・・

43

謝辞

・・・・・

44

図表

・・・・・

45

引用文献

・・・・・

75

研究業績目録

・・・・・

82

略語

ASST

：

autologous serum skin test

：自己血清皮内テスト

AUC

：

area under the curve

：

ROC

曲線下面積

CHO

：

Chinese hamster ovary

：チャイニーズハムスター卵巣

CSU

：

chronic spontaneous urticaria

：特発性慢性蕁麻疹

ds-DNA

：

double stranded DNA

：二本鎖デオキシリボ核酸

EAACI

：

European Academy of Allergy and Clinical Immunology ELISA

：

enzyme-linked immunosorbent assay

：酵素免疫測定法

EXiLE

：

IgE crosslinking-induced luciferase expression

FBS

：

fetal bovine serum

：ウシ胎児血清

FcεRI

：

high affinity receptor for IgE

：高親和性

IgE

受容体

HRP

：

horseradish peroxidase

西洋ワサビペルオキシダーゼ

IgE

：

immunoglobulin E

：免疫グロブリン

E

IgG

：

immunoglobulin G

：免疫グロブリン

G NC

：

normal control

：健常者コントロール

NFAT

：

nuclear factor of activated T cells

：活性化

T

細胞核内因子

PBS

：

phosphate buffered saline

：リン酸緩衝生理食塩水

PMA

：

paramethoxyamphetamine

：パラメトキシアンフェタミン

QoL

：

quality of life

ROC

：

receiver operating characteristic

：受信者動作特性

TBS

：

tris-buffered saline

：トリス緩衝生理食塩水

TMB

：

3,3',5,5'-tetramethylbenzidine

：

3,3',5,5'-

テトラメチルベンジジン

UAS

：

urticaria activity score

：蕁麻疹活動性スコア

1

概要

背景

:

慢性特発性蕁麻疹（

chronic spontaneous urticaria, CSU

）患者の一部 に、自己抗体が検出されることがある。自己抗体が検出される

CSU

は自己免 疫性蕁麻疹と呼ばれ、他の慢性蕁麻疹に比べ症状が重篤で治癒までの期間も長 い傾向があると報告されている。自己免疫性蕁麻疹患者の血清中に含まれる自 己抗体は、

IgE

に対する抗体（以下抗

IgE

抗体と呼ぶ）や高親和性

IgE

受容体

high affinity receptor for IgE

（

FcεRI

）

α

鎖に対する抗体（以下抗

α

鎖抗体と 呼ぶ）が報告されている。しかし、これらの自己抗体が

CSU

の病因にどのよ うに関わっているかは未だに明らかにされていない。

活性化したマスト細胞から遊離産生されるヒスタミンやロイコトリエン

C

4

などのメディエーターは、蕁麻疹症状発症を誘導する。患者血清中に皮膚マス ト細胞を活性化する因子が存在することを検証する方法として、自己血清の皮 内注射により生じた膨疹を測定する自己血清皮内テスト（

autologous serum

skin test, ASST

）が知られている。しかし、血清中のどの成分がマスト細胞の

活性化を惹起することができるかは十分に理解されていない。

ASST

はシクロ スポリンの効果予測に利用できるとの報告もあるが、

ASST

の判定基準は施設 間で統一性がないため、臨床症状との関連性は不明瞭である。

目的：本研究では、

CSU

患者における抗

IgE

抗体および抗

α

鎖抗体と臨床的特 徴の関連性およびその役割を調べることを目的とした。

方法：

CSU

患者

109

人、および健常者コントロール

normal control (NC) 56

人 から採血を行い、血液を遠心分離し血清を得た。さらに血清から

IgG

分画を精 製した。酵素免疫測定法により、精製

IgG

分画中の抗

IgE

抗体濃度、抗

α

鎖抗

2

体濃度を測定した。血清中の可溶性

FcεRIα

鎖の細胞外領域（以下可溶性

α

鎖と 呼ぶ）濃度を調べた。抗

IgE

抗体、抗

α

鎖抗体濃度と臨床的特徴との関連性を 調べた。抗

α

鎖抗体は、血清中に可溶性

α

鎖が存在すると報告されているため、

3

種類の測定方法を用いた。①従来の測定法による、可溶性

α

鎖の結合していな い抗

α

鎖抗体（以下フリー抗

α

鎖抗体と呼ぶ）と

IgG

の片側の可変領域に可溶 性

α

鎖が結合した抗

α

鎖抗体の濃度の総和（以下従来法抗

α

鎖抗体と呼ぶ）の 測定、②

IgG

の片側および両側の可変領域に可溶性

α

鎖が結合した抗

α

鎖抗体 の濃度の総和の測定、③フリー抗

α

鎖抗体と

IgG

の片側および両側の可変領域 に可溶性

α

鎖が結合した抗

α

鎖抗体の濃度の総和（以下総抗

α

鎖抗体と呼ぶ）

の測定である。これにより、フリー抗

α

鎖抗体を算出した。検体の一部で

IgG1

分画と

IgG4

分画を測定した。

ASST

を行った

CSU

患者群についても同様の調 査を行った。

IgE crosslinking-induced luciferase expression (EXiLE)

法により 精製

IgG

のマスト細胞活性化能を調べた。統計学的解析は

Mann-Whitney-U test

または

Fisher’s exact test

を用いた。

p < 0.05

を有意とした。

結果：抗

IgE

抗体濃度は

CSU

患者群の方が

NC

群よりも統計学的に有意に高 値だった（

p < 0.0001

）が、臨床的なパラメーターとは相関がなかった。従来 法抗

α

鎖抗体濃度は

CSU

患者群と

NC

群の間に統計学的な有意差はなかった

（

p = 0.838

）が、

CSU

患者群の間では

ASST

の結果やシクロスポリンの治療 効果と相関があった（それぞれ

p = 0.0289

、

p = 0.00683

）。そこでその要因に ついて検討したところ、①可溶性

α

鎖濃度は、

NC

群の方が

CSU

患者群より も統計学的に有意に高値であった（

p = 0.0359

）。②可溶性

α

鎖が結合しておら ず、

α

鎖の架橋が可能なフリー抗

α

鎖抗体濃度は、

NC

群の方が

CSU

患者群よ りも統計学的に有意に高値だった（

p = 0.0262

）が、フリー抗

α

鎖抗体の

3

IgG1/IgG4

比は

CSU

患者群の方が

NC

群よりも統計学的に有意に高値だった

（

p = 0.0098

）。③抗

α

鎖抗体によるマスト細胞脱顆粒能の指標として

EXiLE

法を用いたところ、抗

α

鎖抗体による

α

鎖架橋の結果の

NFAT

の転写活性は

CSU

患者群の方が

NC

群よりも統計学的に有意に高値であり（

p < 0.0001

）、 また

CSU

患者群はマスト細胞活性化能と従来法抗

α

鎖抗体濃度に有意な正の 相関があった（

p < 0.0001

）。

結語：従来法抗

α

鎖抗体濃度は、

NC

との有意差がみられなかったものの、

CSU

患者群のみで検証すると従来法抗

α

鎖抗体濃度高値群は有意に

ASST

に 陽性であり、シクロスポリンが有効であったことから

CSU

の病態には抗

IgE

抗体よりも抗

α

鎖抗体が関与していると考えられた。その要因として、

CSU

患者群の抗

α

鎖抗体がマスト細胞の活性化能を持つことが明らかとなった。そ して、フリー抗

α

鎖抗体の

IgG1/IgG4

比は

CSU

患者群の方が

NC

群よりも統 計学的に有意に高値であったことから、

IgG1

分画抗

α

鎖抗体はマスト細胞の 活性化能が高いと考えられた。さらに、

NC

群では可溶性

α

鎖が抗

α

鎖抗体と マスト細胞や好塩基球の細胞膜表面の

FcεRI

との結合性を阻害している可能性 があった。一方、抗

IgE

抗体濃度は臨床的特徴と明らかな関連はなかった。以 上より、臨床の場において

CSU

患者群の抗

α

鎖抗体濃度を測定することは、

マスト細胞の活性化能を予測できるものであり、バイオマーカーとして重要で ある。

4

緒言

1.

慢性特発性蕁麻疹

蕁麻疹は日本皮膚科学会蕁麻疹診療ガイドラインの中で、「膨疹、すなわち紅 斑を伴う一過性、限局性の浮腫が病的に出没する疾患であり、多くは痒みを伴う」

と定義されている。蕁麻疹の分類を表

1

に示す。蕁麻疹は

4

つのグループ、

16

の病型に分けられており、その中で個々の皮疹に関する直接的原因または誘因 なく自発的に膨疹が出現する蕁麻疹は特発性蕁麻疹に分類される。さらにその うち

4

週以上持続するものを慢性特発性蕁麻疹（

chronic spontaneous urticaria, CSU

）と定義している。欧米では特発性蕁麻疹のうち、

6

週以上持続するものが

CSU

と定義されている⁽¹⁾。

慢性蕁麻疹のうち、

50

～

75%

が

CSU

である⁽²⁾。また生涯で

1/4

以上の人が

CSU

を経験し、定点観測では全人口の

0.5

～

1.0%

が

CSU

を患っている⁽³⁾。繰り 返される痒みや膨疹により睡眠や社会生活、外観の変化がもたらす

quality of life

（

QoL

）の低下は心不全のそれと同等とも言われており重大な社会問題とみ なされている⁽⁴⁾。

2.

慢性特発性蕁麻疹とマスト細胞

皮膚マスト細胞から放出されたヒスタミンなどの生理活性物質は、皮膚微小 血管や神経系に作用し、紅斑、膨疹、および痒みなどの蕁麻疹症状を誘発する。

マスト細胞は、抗原特異的な

IgE

が細胞表面に発現する高親和性

IgE

受容体

（

high affinity receptor for IgE, FcεRI

）に結合し、多価抗原により

FcεRI

が架 橋されると活性化する。近年ヒト化抗

IgE

モノクローナル抗体であるオマリズ マブが

CSU

に効果があることが報告されている。その効果には、以下の

3

つの 作用機序が考えられている。①オマリズマブがフリーの

IgE

と結合するため、

5

血中のフリーの

IgE

を減少させ、その結果好塩基球や肥満細胞上の

FcεRI

の発 現が低下し、脱顆粒が抑制される⁽⁵⁾、②オマリズマブとフリーの

IgE

の複合体が アレルゲンと結合する⁽⁶⁾、③形質細胞からの

IgE

産生を低下させる⁽⁷⁾。これらの ことは

CSU

患者において、マスト細胞が

IgE-FcεRI

を介するシグナル伝達経 路で活性化していることを支持している。オマリズマブを中止するとすぐに症 状が戻ってしまうことから、オマリズマブは症状を抑えることはできても治癒 はできないと報告されている⁽⁸⁾。

3.

慢性特発性蕁麻疹と自己抗体

CSU

患者の血清中に、自己抗体が存在していることが報告されている⁽⁹⁾。自 己抗体が検出される

CSU

を自己免疫性蕁麻疹と呼ぶ。

IgE

に対する抗体（以下 抗

IgE

抗体と呼ぶ）もしくは

FcεRI

の

α

鎖に対する抗体（以下抗

α

鎖抗体と呼 ぶ）が主な自己抗体であることが報告されている⁽¹⁰⁾。全

CSU

患者の

5

～

10%

に 抗

IgE

抗体が、

30

～

45%

に抗

α

鎖抗体が検出される⁽¹⁾。また

Hatada

らは

CSU

患者において自己反応性抗二本鎖デオキシリボ核酸（

double stranded DNA, ds- DNA

）

IgE

抗体が有意に上昇しており、

CSU

患者の好塩基球を直接活性化する ことを報告した⁽¹¹⁾。

自己免疫性蕁麻疹は他の

CSU

に比べて症状が重篤で、寛解に至るまでの期間 も長い傾向にあり⁽¹²⁾、自己抗体が慢性特発性蕁麻疹の重症化や治療効果の阻害 に関与することが示唆される。しかしながら、健常者や他の自己免疫性疾患にも 自己抗体が検出されている⁽¹³⁾。また自己抗体が常に血中に存在するにもかかわ らず蕁麻疹の出現は他の

CSU

と同様に消長がある。

CSU

の自己抗体に注目した研究は数多く存在する。臨床組織学的に検討した 報告⁽²⁾、抗

α

鎖抗体の新しい検出法を提案する報告⁽¹⁴⁾、

CSU

を含めた多数の自

6

己免疫疾患における抗

α

鎖抗体を検証した報告⁽¹³⁾、患者血清中の自己抗体が好 塩基球を活性化するという報告⁽¹⁰⁾、

CSU

患者血清の中でマスト細胞を活性化す るものとしないものがあるとする報告など⁽¹³⁾、その切り口も様々である。ただ し複数の自己抗体の中で、抗

α

鎖抗体に着目した研究が多く、

CSU

における抗

IgE

抗体について検証する報告⁽¹⁵⁾は少ない。これまでに

CSU

の自己抗体に関す る研究が進められているが、未だに病態や臨床症状との関連について明確な結 論は得られていない。その理由として、自己抗体と他の因子が複合的に絡み合い、

CSU

の病因になることがうかがわれる。

4.

自己血清皮内テスト（

autologous serum skin test, ASST

）

皮膚マスト細胞を活性化させる血清中の因子を確認する方法として、自己血 清の皮内注射により生じた膨疹を測定する

ASST

が知られている。

ASST

陽性 のうち一部が抗

IgE

抗体あるいは抗

α

鎖抗体による反応と考えられている⁽¹⁶⁾。

ASST

陽性の患者では

CSU

治療の第

3

選択であるシクロスポリンが有用である とされているが⁽¹⁷⁾、

ASST

の陽性率は、患者の選択法や重症度、皮内注射する血 清量、

ASST

施行から計測までの時間、生理食塩水注射部位と比べどれほど膨疹 が大きければ陽性とするかの判断基準が施設間で異なるため、

4.1

～

76.5%

と幅 がある⁽¹⁷⁾。そのため

ASST

と臨床症状の関連性は未だ明らかにされていない⁽¹⁷⁾。

ASST

陽性患者の血清で膨疹を惹起する因子を追求した研究がある。その研究 は膨疹を惹起する因子は

IgG

分画、補体、

IgE

ではないと報告しており、未だ その成分は不明である⁽¹⁸⁾。

7

研究の目的

本研究では、

CSU

患者における抗

IgE

抗体および抗

α

鎖抗体と臨床的特徴の 関連性とその役割を調べることを目的とした。

期待される成果

この研究結果は、

CSU

の病態、および効果的な治療法を選択するための検査 法を提示することができる。さらに、自己抗体が

CSU

の病態にどのように関与 するかを解明できる。

8

対象・使用試薬

(1)

倫理的考慮

本研究の生命倫理に関しては、日本大学医学部倫理委員会、臨床研究委員会に 研究倫理および臨床研究審査申請書を提出し、委員会の承認を得た。患者の血清 採取に際して、承認番号

RK-150908-12

として承認を得た。ヒト皮膚由来培養 マスト細胞の使用に際して、承認番号

RK-120210-03

として承認を得た。すべ ての被験者は、ヘルシンキ宣言に従い、インフォームドコンセントを得た。安全 対策に関しては、日本大学遺伝子組換え実験実施規定に定める学長の確認を受 けた後に実施した。

(2)

対象

2005

～

2015

年の間に日本大学医学部附属板橋病院の皮膚科を受診した

109

人の

CSU

患者（男

34

人、女

75

人：平均年齢

46.4

歳）と

56

人の健常者（

normal control, NC

）（男

24

人、女

33

人：平均年齢

34.5

歳）を対象とした。

109

人の

CSU

患者のうち、

61

人に

ASST

が施行され、

25

人が陽性であった（陽性率：

40.9 %

）。

CSU

の 診 断 は

European Academy of Allergy and Clinical Immunology

（

EAACI

）の診断基準に従った。

NC

はアトピー素因がなく、アレ ルギー疾患と慢性蕁麻疹の既往がなく、現在蕁麻疹を発症していない人々を対 象とした。

(3)

使用試薬

以下の試薬はそれぞれ下記の会社から購入した。

Ab-Rapid SPiN EX

（

ProteNova, Kagawa, Japan

）

Amicon centrifugal filter units

（

Merck millipore, Darmstadt, HE, GER

）

9

Amicon ultra-4 centrifugal filter devices

（

Merck Millipore, Darmstadt, HE, GER

）

ビオチン標識マウス抗ヒト

IgG

（

Clone G18-145

）（

BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA

）

ビオチン標識マウス抗ヒト

IgG1

（

Clone G17-1

）（

BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA

）

ビオチン標識マウス抗ヒト

IgG4

（

Clone G17-4

）（

BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, USA

）

Centricon Plus-70

（

Merck Millipore, Darmstadt, HE, GER

）

マウス抗ヒト

FcεRIα

モノクローナル抗体（

CRA1

、

isotype IgG2bκ

）

（

BioAcademia, Osaka, Japan

）

マウス抗ヒト

FcεRIα

モノクローナル抗体（

CRA2

、

isotype IgG1κ

）

（

BioAcademia, Osaka, Japan

）

ウシ胎児血清（

Gibco, Waltham, MA, US

）

Geneticin

（

Gibco, Waltham, MA, USA

）

GlutaMAX-I

（

Gibco, Waltham, MA, USA

）

HiTrap NHS-activated HP column

（

GE healthcare, Tokyo, Japan

）

HRP

標識マウス抗ヒト

IgE

モノクローナル抗体（

Fitzgerald, North Acton, MA, USA

）

HRP

標識マウス抗ヒト

IgG

モノクローナル抗体（

Clone G18-145

）（

BD Pharminge, Franklin Lakes, NJ, USA

）

HRP

標識ストレプトアビジン（

Biolegend, San Diego, CA, USA

） ヒト

IgE, myeloma

（

Calbiochem, Darmstadt, HE, GER

）

ヒト

IgG

（

Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA

）

10

Hygromycin B

（

Invitrogen, Waltham, MA, USA

）

Ionomycin

（

Plymouth Meeting, PA, USA

）

Luciferase Assay Buffer (Promega, Madison, WI, USA) Luciferase Assay Substrate (Promega, Madison, WI, USA) MEM

（

Gibco, Waltham, MA, USA

）

MEM α, no nucleosides

（

Gibco, Waltham, MA, USA

）

メトトレキサート 水和物（

Sigma-Aldrich, Darmstadt, HE, GER

） パラメトキシアンフェタミン（

BioVision, Milpitas, CA, USA

）

PBS

（

TAKARA, Shiga, Japan

）

Penicillin-Streptomycin

（

Sigma-Aldrich, Darmstadt, HE, GER

）

TBS

粉末（

Roman Industries, Tokyo, Japan

）

TMB microwell peroxidase substrate system

（

KPL, Gaithersburg, MD, USA

）

Tween 20

（

Tokyo Chemical Industry, Tokyo, Japan

）

11

方法 1

1-1.

検体血清からの

IgG

の精製

Ab-Rapid SPiN EX

を用いて、患者の血清から

IgG

分画を精製した。付属の カラムの下部についているスナップオフプラグを外し、カラムを付属の

2 mL

チ ューブにセットした。

2000 × g

で

5

秒間遠心し、ゲル保存液を取り除いた。カ ラム内に

PBS 600 μL

を入れ、

2000 × g

で

5

秒間遠心し、ゲルを平衡化した。

カラムの下にスナップオフプラグを刺し込み、

PBS

で

5

倍希釈した血清

600 μL

を入れた。

30

～

60

秒に

1

回転倒混和しながら

10

分間反応させ、スナップオフ プラグを外し

2000 × g

で

5

秒間遠心した。

PBS 600 μL

をカラムに入れ、

2000

× g

で

5

秒間遠心し、合計

3

回洗浄した。カラムの下にスナップオフプラグを刺 し込み、付属の溶出液（

0.1 M Glycine-HCl

）（

pH 2.5

～

3.0

）を

200 μL

入れた。

タッピングで混和後、

1

分間静置した。スナップオフプラグを外し、付属の中和 液（

1 M Tris

）

5 μL

が入ったマイクロチューブにカラムをセットした。

2000 × g

で

5

秒間遠心し、

IgG

溶出液を回収し、

PBS 300 μL

を加えた。

Amicon centrifugal filter units

付属の回収チューブに付属のフィルターデバ イスをセットし、総量

500 μL

の

IgG

溶出液を入れた。

15000 × g

で

15

分間遠 心した。新しい回収チューブにフィルターデバイスを逆さまにセットし、

1000

× g

で

2

分間遠心した。回収した

IgG

溶出液に

PBS 600 μL

を入れ、最終的に 血清の

5

倍希釈の精製

IgG

とした。

1-2.

抗

IgE

抗体濃度測定

酵素免疫測定法（

enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA

）により、抗

IgE

抗体濃度を測定した。詳細な方法を図

1

に示す。

Maxisorp plates

（

Cosmo

bio company, Tokyo, Japan

）にヒト

IgE, myeloma

（

1 μg / mL

）を

100 μL

入

12

れ、

pH 7.4

、

4

℃で一晩静置して固相化した。

Tris-buffered saline

（

TBS

）

1000 ml

に、

Tween 20

を

0.1 %

になるように加え、洗浄液として用いた。洗浄液でプ レートを

4

回洗浄した。

PBS

に

FBS

を

10%

になるように加え、ブロッキング 液として用いた。非特異的な結合を防ぐため、ブロッキング液

100 μL

を入れ、

室温で

1

時間ブロッキングした。洗浄液でプレートを

4

回洗浄し、

PBS

で

10

倍 希釈した精製

IgG

分画を

100 μL

加え、室温で

2

時間静置した。洗浄液でプレ ートを

4

回洗浄し、

PBS

で

1

万倍希釈した

Horseradish peroxidase

（

HRP

）標 識マウス抗ヒト

IgG

モノクローナル抗体を

100 μL

入れ、室温で

1

時間静置し た。洗浄液でプレートを

4

回洗浄し、

3,3',5,5'-tetramethylbenzidine

（

TMB

）

microwell peroxidase substrate system

を用い発色させた。

2N H

2

SO

4で反応 を停止させ、

Multiskan GO microplate spectrophotometer

（

Thermo Fisher Scientific, Kanagawa, Japan

）を使用し

450 nm

の吸光度を測定した。ヒト

IgG

を

50 ng /mL

から

0.775 ng / mL

まで倍々希釈で固相化し、

HRP

標識マウス抗 ヒト

IgG

モノクローナル抗体で検出したものを指標にし、ある検体の精製

IgG

に含まれる抗

IgE

抗体濃度をヒト

IgE, myeloma

（

1 μg / mL

）を固相化した

ELISA

で半定量的に測定した。プレート間の補正のため、その検体の抗

IgE

抗

体を毎回必ず測定し、検量曲線を描き、検体の精製

IgG

に含まれる抗

IgE

抗体 濃度を算出した。

1-3.

リコンビナント可溶性

FcεRIα

鎖細胞外領域の精製

FcεRIα

鎖細胞外領域を分泌する

CHO

（

Chinese hamster ovarian

）細胞（

CHO

/ FcεRIα

）の培養上清からリコンビナント可溶性

FcεRIα

鎖細胞外領域（以下可 溶性

α

鎖と呼ぶ）を精製した⁽¹⁹⁾。

MEM α 45 mL

、ウシ胎児血清（

Fetal bovine

serum, FBS

）

5 mL

（

10%

）、

5 mM

メトトレキセート

25 μL

で培養用培地を作

13

成した。

T225

フラスコ（

CORNING, Corning, NY, USA

）に

CHO / FcεRIα

を

1 × 10

⁶

cell

でまき、培養用培地

30 mL

で培養した。

70

～

90%

コンフルエントに なったら、

MEM α 49.5 mL

、

FBS 0.5 mL

（

1%

）、

5 mM

メトトレキセート

25 μL

で作成した回収用培地

30 mL

に交換した。

96

時間後に上清を回収した。新 しい回収用培地

30 mL

を入れ、さらに

96

時間後に

2

回目の上清を回収した。

以上を繰り返し行い、上清を

1000 mL

貯めた。

HiTrap NHS-activated HP column

にシリンジを接続し、

5 ml

の

1 mM HCl

を、流速

1

滴

/

秒（または

0.2

～

1 ml / min

）で送液した。マウス抗ヒト

FcεRIα

モノクローナル抗体（

CRA2

）

10 mg

を限外濾過し、

0.2 M NaHCO

3

/ 0.5 M NaCl

（カップリング液）

1 mL

に溶媒を交換した。

CRA2 1 mL

を流速

1

滴

/

秒（ま

たは

0.2

～

1 ml / min

）で送液した。カラム出口を付属のストッププラグで密閉

し、室温で

30

分間反応させた。

3 ml

のカップリング液を、流速

1

滴

/

秒（ま たは

0.2

～

1 ml / min

）で送液した。

6 ml

の

0.5 M C

2

H

7

NO / 0.5 M NaCl

（ブロ ッキング液）を流速

1

滴

/

秒（または

1

～

2 ml / min

）で送液した。

6 ml

の

CH

3

COONa / 0.5 M NaCl

（洗浄液、

pH 4.0

）を流速

1

滴

/

秒（または

1

～

2 ml / min

）で送液した。

6 ml

のブロッキング液を流速

1

滴

/

秒（または

1

～

2 ml / min

）で送液し、室温で

30

分間反応させ、未反応活性基に対する非特異的な結 合を防ぐため、ブロッキングを行った。

6 ml

の洗浄液を流速

1

滴

/

秒（または

1

～

2 ml / min

）で送液した。

6 ml

のブロッキング液を流速

1

滴

/

秒（または

1

～

2 ml / min

）で送液した。

6 ml

の洗浄液を流速

1

滴

/

秒（または

1

～

2 ml / min

）で送液した。

Phosphate buffered saline

（

PBS

）

2 mL

を流速

1

滴

/

秒

（または

1

～

2 ml / min

）で送液し、免疫カラムを作成した。

Centricon Plus-70

のフィルターカップに上清

70 mL

を入れ、回収カップに セットした。

3500 × g

で

15

～

40

分間遠心した。フィルターカップに濃縮カップ

14

を逆さまにセットし、遠心分離機にそのデバイスを逆さまに設置し、

1000 × g

で

2

分間遠心した。濃縮カップをフィルターカップから外し、濃縮液を回収した。

濃縮液を

PBS

で希釈し、総量

1 mL

にした。作成した免疫カラムに濃縮液

1 mL

を入れ、室温で

4

時間反応させた。

PBS 10 mL

で

2

回洗浄し、

0.1 M Glycine / 0.2 M NaCl

（溶出液、

pH2.7

）

5 mL

で溶出した。溶出物を

1 mL

ずつ採取し、

1M Tris-HCl

（中和液、

pH9.0

）で直ちに中和した。

Amicon ultra-4 centrifugal filter devices

のフィルターデバイスに溶出物を 入れ、

7500 × g

で

10

～

20

分間遠心した。回収チューブから濃縮液を回収し、

PBS

で希釈した。

1-4.

抗

α

鎖抗体濃度測定

過去に報告されている、リコンビナント可溶性

α

鎖を固相化する方法で抗

α

鎖抗体濃度を測定した(14), (20)-(21)。この測定法で検出される抗

α

鎖抗体を、以下 従来法抗

α

鎖抗体と呼ぶ。測定法の詳細を図

2

に示す。

Maxisorp plates

に前述 のリコンビナント可溶性

α

鎖（

1 μg / mL

）を

100 μL

入れ、

pH 7.4

、

4

℃で一晩 静置して固相化した。

TBS 1000 ml

に、

Tween 20

を

0.1 %

になるように加え、

洗浄液として用いた。洗浄液でプレートを

4

回洗浄し、非特異的な結合を防ぐ

ため、

10% FBS

を

100 μL

入れ、室温で

1

時間ブロッキングした。洗浄液でプ

レートを

4

回洗浄し、

PBS

で

10

倍希釈した精製

IgG

分画を

100 μL

入れ、室 温で

2

時間静置した。洗浄液でプレートを

4

回洗浄し、

PBS

で

1

万倍希釈した

HRP

標識マウス抗ヒト

IgG

モノクローナル抗体を

100 μL

入れ、室温で

1

時間 静 置 し た 。 洗 浄 液 で プ レ ー ト を

4

回 洗 浄 し 、

TMB microwell peroxidase

substrate system

を用い発色させた。

2N H

2

SO

4で反応を停止させ、

Multiskan

GO microplate spectrophotometer

を使用し

450 nm

の吸光度を測定した。プレ

15

ート間の補正のため、ヒト型化した抗

α

鎖モノクローナル抗体⁽²²⁾を

62.5 ng /

mL

から

0.975 ng / mL

まで倍々希釈したものを毎回必ず測定し、検量曲線を描

き、検体の精製

IgG

に含まれる従来法抗

α

鎖抗体濃度を算出した。

1-5. ASST

Konstantinou

らが報告した

ASST

の方法を⁽¹⁷⁾、一部改変して

ASST

を行っ た。静脈血を

10 mL

採取し

15

分静置した後、

3000 rpm

で

15

分遠心分離し血 清を回収した。

1mL

シリンジと

27G

針を用い、血清

50 μL

を前腕屈側に皮内注 射した。陰性コントロールとして血清注射部位から

3

～

5 cm

離した部位に生理

食塩水を

50 μL

皮内注射した。

30

分後に判定し、膨疹の直径が陰性コントロー

ルより

2 mm

以上あるものを陽性とした。

1-6.

患者背景との比較

実験で得られたデータと患者背景（性別、年齢、罹患期間、

ASST

の結果、重 症度、他疾患の自己抗体の有無、末梢血非特異的

IgE

値、一般採血結果、シク ロスポリンの治療効果、臨床経過）を調査した。重症度は日本皮膚科学会の蕁麻 疹診療ガイドラインに準じた。重症度分類を表

2

に示す。

1

：無症状、

2

：症状 はあるが気にならない、

3

：不快ではあるが我慢できる、

4

：支障はあるが何とか 生活できる、

5

：社会生活ができない、

6

：ショックないしそれに準ずる症状と分 類した。他疾患の自己抗体として、抗核抗体、抗サイログロブリン抗体、抗マイ クロゾーム抗体を測定した。臨床経過の分類を表

3

に示す。臨床経過は、寛解

:

治療をしなくても症状が出現しない、再燃性

:

治療を

step up

する途中で膨疹が 完全に消失する期間があるが

step down

すると再燃する、持続性

:

治療を

step

up

しても症状は軽快するが膨疹は完全に消失せず

step down

すると悪化する、

16

抵抗性

:

治療に全く反応しない、不明

:

短期で通院を中断し経過が不明の状態と 分類した。シクロスポリンの治療効果は、シクロスポリン内服開始前と開始

4

週 後の

Urticaria activity score

（

UAS

）

7

を比較し改善率を算出した⁽²³⁾。

UAS7

と は患者の痒みの程度と（

0 = none, 1 = mild, 2 = moderate, 3 = severe

）膨疹の 数（

0 = none, 1 = 1~20, 2 = 21~50, 3 = 50

以上）によるスコアを

1

日ごとに合 計し（スコア

: 0

～

6

）、さらにそのスコアを

1

週間分合計したものである（スコ ア

: 0

～

42

）⁽²⁴⁾。

1-7.

統計解析

実験データの

2

群間の統計学的解析は

Mann-Whitney-U test

または

Fisher’s

exact test

を用いた。

p < 0.05

を有意とした。

17

結果 1

1-1. CSU

患者群と

NC

群間の精製

IgG

に含まれる抗

IgE

抗体濃度の比較

CSU

患者群は中央値

0.627 μg / mL

（四分位範囲

: 0.379 – 1.01

）（

n = 109

） であり、

NC

群は中央値

0.373 μg / mL

（四分位範囲

: 0.246 – 0.602

）（

n = 56

） だった。

CSU

患者群の方が

NC

群よりも抗

IgE

抗体濃度は統計学的に有意に高 かった（

p < 0.0001

）（図

3

）。

Receiver operating characteristic

（

ROC

）曲線を 描き導き出したカットオフ値は

0.465 μg / mL

だった。以下ではカットオフ値以 上を高値群、カットオフ値未満を低値群と呼ぶ。抗

IgE

抗体濃度高値群の

CSU

患者と、抗

IgE

抗体濃度高値群の

NC

とのオッズ比は

4.46

だった。

1-2. CSU

患者群と

NC

群間の従来法抗

α

鎖抗体濃度の比較

CSU

患者群は中央値

0.355 μg / mL

（四分位範囲

: 0.239 – 0.553

）（

n = 109

） であり、

NC

群は中央値

0.386 μg / mL

（四分位範囲

: 0.232 – 0.563

）（

n = 56

） だった。

CSU

患者群と

NC

群間の従来法抗

α

鎖抗体濃度に統計学的な有意差は なかった（

p = 0.838

）（図

4

）。

1-3.

抗

IgE

抗体濃度と従来法抗

α

鎖抗体濃度の相関

CSU

患者群と

NC

群それぞれにおいて、抗

IgE

抗体濃度と、従来法抗

α

鎖抗 体濃度に相関があるかどうかを

Spearman

検定で調べた。

NC

群では

r = 0.118

、

p = 0.390

であり、相関がなかった（抗

IgE

抗体濃度および抗

α

鎖抗体濃度が極

端に高値だった

1

検体は除いて検定した）が、

CSU

患者群では

r = 0.324

、

p =

0.0006

であり、相関があった（図

5

）。

18

1-4. ASST

陽性群と陰性群間の抗

IgE

抗体濃度、従来法抗

α

鎖抗体濃度の比較

ASST

陽性群の抗

IgE

抗体濃度の中央値は

0.738 μg / mL

（四分位範囲

: 0.424 – 1.21

）（

n = 25

）であり、

ASST

陰性群の抗

IgE

抗体濃度の中央値は

0.628 μg / mL

（四分位範囲

: 0.272 – 0.954

）（

n = 36

）であった。

ASST

陽性群と

ASST

陰 性群間の抗

IgE

抗体濃度に統計学的な有意差はなかった（

p = 0.189

）（図

6

）。

ASST

陽性群の従来法抗

α

鎖抗体濃度の中央値は

0.450 μg / mL

（四分位範囲

: 0.304 – 0.799

）（

n = 25

）であり、

ASST

陰性群の中央値は

0.319 μg / mL

（四分 位範囲

: 0.214 – 0.506

）（

n = 36

）だった。

ASST

陽性群は

ASST

陰性群よりも 従来法抗

α

鎖抗体濃度は統計学的に有意に高かった（

p = 0.0289

）。

ROC

曲線を 描き導き出したカットオフ値は

0.578 μg / mL

だった。

ASST

陽性で従来法抗

α

鎖抗体濃度高値群と、

ASST

陰性で従来法抗

α

鎖抗体濃度高値群とのオッズ比 は

4.13

だった（図

7

）。

1-5.

抗

IgE

抗体濃度高値群と低値群における臨床的特徴の比較

CSU

患者群と

NC

群の間で統計学的な有意差が出た抗

IgE

抗体濃度と臨床的 特徴との関連を調べた。

ROC

曲線から得られた抗

IgE

抗体濃度のカットオフ値

（

0.465 μg / mL

）を基に測定結果を

2

群に分け、カットオフ値以上を高値群、

カットオフ値未満を低値群とし、患者の特徴を比較したものを表

4

に示す。抗

IgE

抗体濃度高値群の従来法抗

α

鎖抗体濃度の平均は

0.540 μg / mL

だった（

n

= 74

）。低値群の平均は

0.347 μg / mL

だった（

n = 35

）。抗

IgE

抗体濃度高値群 の方が低値群よりも従来法抗

α

鎖抗体濃度が有意に高かった（

p = 0.0267

）。治 療経過については抗

IgE

抗体濃度高値群と低値群の間に統計学的な有意差はな かった。

19

1-6. ASST

陽性群と陰性群における臨床的特徴の比較

ASST

陽性群と陰性群間の臨床的特徴との関連を調べた。

ASST

陽性と陰性で 測定結果を

2

群に分け、患者の特徴を比較したものを表

5

に示す。

ASST

陽性群の従来法抗

α

鎖抗体濃度の平均は

0.597 μg / mL

だった（

n = 25

）。

ASST

陰性群の平均は

0.396 μg / mL

だった（

n = 36

）。

ASST

陽性群の方 が

ASST

陰性群よりも従来法抗

α

鎖抗体濃度が統計学的に有意に高かった（

p = 0.0294

）。

ASST

陽性群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の平均は

76.8%

だっ た（

n = 18

）。

ASST

陰性群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の平均は

21.1%

だった（

n = 9

）。

ASST

陽性群の方が

ASST

陰性群よりもシクロスポリン 治療による

UAS7

改善率が統計学的に有意に高かった（

p = 0.00179

）。

1-7.

シクロスポリンの治療効果の比較

シクロスポリン治療による

UAS7

改善率について詳細に検討した。抗

IgE

抗 体濃度高値群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の中央値は

75.0%

（四 分位範囲

: 18.3 – 100

）（

n = 19

）であり、低値群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の中央値は

55.0%

（四分位範囲

: 15.0 – 95.7

）（

n = 8

）だった。抗

IgE

抗体濃度高値群と低値群間のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率に統 計学的な有意差はなかった（

p = 0.585

）（図

8

）。

ASST

陽性群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の中央値は

97.1%

（四 分位範囲

: 58.0 – 100

）（

n = 18

）であり、陰性群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の中央値は

16.7%

（四分位範囲

: 0.00 – 20.0

）（

n = 9

）だった。

ASST

陽性群の方が陰性群よりもシクロスポリン治療による

UAS7

改善率は統計学的 に有意に高かった（

p = 0.00179

）（図

9

）。

20

ASST

施行例で従来法抗

α

鎖抗体濃度のカットオフ値（

0.578 μg / mL

）を基 に

2

群に分けシクロスポリンの効果を比較したところ、従来法抗

α

鎖抗体濃度 高値群のシクロスポリン治療による

UAS7

改善率の中央値は

100%

（四分位範 囲

: 100 – 100

）（

n = 7

）であり、低値群のシクロスポリン治療による

UAS7

改 善率の中央値は

33.3%

（四分位範囲

: 16.7 – 86.1

）（

n = 20

）だった。従来法抗

α

鎖抗体濃度高値群の方が低値群よりもシクロスポリン治療による

UAS7

改善率 は統計学的に有意に高かった（

p = 0.00683

）（図

10

）。

21

小括 1

抗

IgE

抗体濃度は

CSU

患者群の方が

NC

群よりも統計学的に有意に高かっ たが、臨床的なパラメーターとは相関がなかった。従来法抗

α

鎖抗体濃度は

CSU

患者群と

NC

群の間に統計学的な有意差はなかったが、

CSU

患者群の間 では

ASST

の結果やシクロスポリンの治療効果と相関があった。臨床的な評価 項目と相関があったのは抗

α

鎖抗体濃度であったため、

CSU

の病態に強く関 連しているのは抗

α

鎖抗体濃度であることが推測された。血清中に可溶性

α

鎖 が存在することが報告されている^(25)-(26)。抗

α

鎖抗体濃度に

CSU

患者群と

NC

群の間に統計学的な有意差が出ない理由として、

NC

群の血清中には可溶性

α

鎖が多く存在し、抗

α

鎖抗体とマスト細胞や好塩基球の細胞膜表面の

FcεRI

と の結合を阻害しているという仮説をたてた。そこで次に血清中の可溶性

α

鎖を 測定し検討した。

22

方法 2

2-1.

血清中の可溶性

α

鎖濃度の測定

ELISA

により、血清中の可溶性

α

鎖濃度を測定した。詳細な方法を図

11

に

示す。

96 well EIA/RIA plates

（

CORNING

）にマウス抗ヒト

FcεRIα

モノクロ ーナル抗体（

CRA1

）（

3 μg / mL

）を

50 μL

ずつ入れ、

4

℃で一晩静置し固相化 した。

0.05% Tween-20 PBS

（

PBS-T

）を洗浄液として用いた。洗浄液

300 μL

でプレートを

3

回洗浄し、

10% FBS

を

200 μL

ずつ入れ室温で

1

時間静置しブ ロッキングを行った。洗浄液でプレートを

3

回洗浄し、

2

倍希釈した

CSU

、

NC

の血清を

50 μL

ずつ入れ、

4

℃で一晩静置した。洗浄液でプレートを

5

回洗浄 し、ヒト

IgE, myeloma

（

2 μg / mL

）を

50 μL

ずつ入れ、室温で

1

時間静置し た。洗浄液でプレートを

5

回洗浄し、

HRP

標識マウス抗ヒト

IgE

（

0.5 μg / mL

） を

50 μL

ずつ入れ室温で

1

時間静置した。洗浄液でプレートを

5

回洗浄し、

TMB microwell peroxidase substrate system

を用い発色させた。

2N H

2

SO

4で 反応を停止させ、

Multiskan GO microplate spectrophotometer

を使用し

450

nm

、

570 nm

の吸光度を測定した。プレート間の補正のため、リコンビナント

可溶性

α

鎖を

100 ng / mL

から

1.56 ng / mL

まで倍々希釈したものを毎回必ず 測定し、検量曲線を描き、検体の血清中の可溶性

α

鎖濃度を算出した。指標とし た検量曲線の感度以下だった検体は、すべて最低感度濃度の

1/2

（

0.78 ng / mL

） として算出した。

23

結果 2

2-1. CSU

患者群と

NC

群間の血清中の可溶性

α

鎖濃度の比較

血清中に可溶性

α

鎖が存在することが報告されているため、

CSU

患者群と

NC

群間の血清中可溶性

α

鎖濃度に有意差があるかを検証した。

CSU

患者群の 血清中の可溶性

α

鎖濃度の中央値は

1.74 ng / mL

（四分位範囲

: 0.78 – 5.50

）（

n

= 109

）だった。

NC

群の血清中の可溶性

α

鎖濃度の中央値は

3.14 ng / mL

（四 分位範囲

: 0.78 – 10.7

）（

n = 56

）だった。

NC

群の方が

CSU

患者群よりも血清 中可溶性

α

鎖濃度は統計学的に有意に高かった（

p = 0.0438

）（図

12

）。

24

小括 2

NC

群の血清中の可溶性

α

鎖濃度は

CSU

患者群と比較して統計学的に有意に 高く、抗

α

鎖抗体とマスト細胞や好塩基球の細胞膜表面の

FcεRI

との結合を阻 害しているという仮説を支持する結果が得られた。血清中に可溶性

α

鎖が存在 することが確認されたため、血清中の抗

α

鎖抗体は、理論上以下の

3

つの形が 存在することになる。①可用性

α

鎖が結合していないフリー抗

α

鎖抗体、②

IgG

の片側の可変領域に可用性

α

鎖が結合した抗

α

鎖抗体、③

IgG

の両側の可 変領域に可用性

α

鎖が結合した抗

α

鎖抗体である。抗

α

鎖抗体の分類を図

13

に示す。そこで次に、特に活性化能が高いと思われるフリー抗

α

鎖抗体濃度を 測定した。

25

方法 3

3-1.

フリーの抗

α

鎖抗体と

IgG

の片側、および両側の可変領域に可溶性

α

鎖を

結合した抗

α

鎖抗体（以下総抗

α

鎖抗体と呼ぶ）の濃度測定

総抗

α

鎖抗体濃度を測定できる

ELISA

を構築し、その濃度を測定した。その 詳細な方法を図

14

に示す。

96 well EIA/RIA plates

に

CRA1

（

3 μg / mL

）を

50 μL

ずつ入れ、

4

℃で一晩静置し固相化した。

0.05% Tween-20 PBS

（

PBS-T

）を 洗浄液として用いた。洗浄液

300 μL

でプレートを

3

回洗浄し、

10% FBS

を

200 μL

ずつ入れ室温で

1

時間静置しブロッキングを行った。洗浄液でプレート

を

3

回洗浄し、リコンビナント可溶性

α

鎖（

100 ng / mL

）を

50 μL

入れ、固相 化した

CRA1

が準飽和状態となるように、室温で

3

時間静置した。洗浄液でプ レートを

3

回洗浄し、

100

倍希釈した

CSU

、

NC

の精製

IgG

を

50 μL

ずつ入 れ、

4

℃で一晩静置した。洗浄液でプレートを

5

回洗浄し、ビオチン標識マウス 抗ヒト

IgG

（

1 μg / mL

）を

50 μL

ずつ入れ、室温で

1

時間静置した。洗浄液で プレートを

5

回洗浄し、

10% FBS

で

1000

倍希釈した

HRP

標識ストレプトア ビジンを

50 μL

ずつ入れ室温で

30

分間静置した。洗浄液でプレートを

5

回洗 浄し、

TMB microwell peroxidase substrate system

を用い発色させた。

2N H

2

SO

4で反応を停止させ、

Multiskan GO microplate spectrophotometer

を使

用し

450 nm

、

570 nm

の吸光度を測定した。プレート間の補正のため、可溶性

α

鎖

100 ng / mL

を入れた後、ヒト型化した抗

α

鎖モノクローナル抗体⁽²²⁾を

10

ng / mL

から

0.156 ng / mL

まで倍々希釈したものを毎回必ず測定し、検量曲線 を描き、検体の精製

IgG

に含まれる総抗

α

鎖抗体濃度を算出した。

26

3-2. IgG

の片側、および両側の可変領域に可溶性

α

鎖を結合した抗

α

鎖抗体（可

溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体）の濃度測定

可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体濃度を測定できる

ELISA

を構築し、その濃度を測 定した。その詳細な方法を図

15

に示す。

96 well EIA/RIA plates

に

CRA1

（

3 μg / mL

）を

50 μL

ずつ入れ、

4

℃で一晩静置し固相化した。

0.05% Tween-20 PBS

（

PBS-T

）を洗浄液として用いた。洗浄液

300 μL

でプレートを

3

回洗浄

し、

10% FBS

を

200 μL

ずつ入れ室温で

1

時間静置しブロッキングを行った。

洗浄液でプレートを

3

回洗浄し、

100

倍希釈した

CSU

、

NC

の精製

IgG

を

50 μL

ずつ入れ、

4

℃で一晩静置した。洗浄液でプレートを

5

回洗浄し、ビオチン 標識マウス抗ヒト

IgG

（

1 μg / mL

）を

50 μL

ずつ入れ、室温で

1

時間静置した。

洗浄液でプレートを

5

回洗浄し、

10% FBS

で

1000

倍希釈した

HRP

標識スト レプトアビジンを

50 μL

ずつ入れ室温で

30

分間静置した。洗浄液でプレートを

5

回洗浄し、

TMB microwell peroxidase substrate system

を用い発色させた。

2N H

2

SO

4で反応を停止させ、

Multiskan GO microplate spectrophotometer

を

使用し

450 nm

、

570 nm

の吸光度を測定した。プレート間の補正のため、可溶

性

α

鎖

100 ng / mL

を入れた後、ヒト型化した抗

α

鎖モノクローナル抗体⁽²²⁾を

10 ng / mL

から

0.156 ng / mL

まで倍々希釈したものを毎回必ず測定し、検量 曲線を描き、検体の精製

IgG

に含まれる可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体の濃度を算 出した。

3-3.

フリー抗

α

鎖抗体濃度の測定

総抗

α

鎖抗体濃度から可溶性

α

鎖結合抗体濃度を引き、フリー抗

α

鎖抗体濃 度を算出した。

27

結果 3

3-1. CSU

患者群と

NC

群間の総抗

α

鎖抗体濃度の比較

CSU

患者群は中央値

0.895 μg / mL

（四分位範囲

: 0.520 – 2.54

）（

n = 42

）で あり、

NC

群は中央値

1.05 μg / mL

（四分位範囲

: 0.586 – 2.25

）（

n = 42

）だっ た。

CSU

患者群と

NC

群間の総抗

α

鎖抗体濃度に統計学的な有意差はなかった

（

p = 0.734

）（図

16

）。

3-2. CSU

患者群と

NC

群間の可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体濃度の比較

CSU

患者群は中央値

0.697 μg / mL

（四分位範囲

: 0.269 – 1.40

）（

n = 42

）で あり、

NC

群は中央値

0.417 μg / mL

（四分位範囲

: 0.261 – 0.850

）（

n = 42

）だ った。

CSU

患者群と

NC

群間の可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体濃度に統計学的な有 意差はなかった（

p = 0.209

）（図

17

）。

3-3. CSU

患者群と

NC

群間のフリー抗

α

鎖抗体濃度の比較

総抗

α

鎖抗体と可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体濃度の測定は同じプレートで行い、

測定値の差をフリー抗

α

鎖抗体濃度として算出した。

CSU

患者群は中央値

0.325

μg / mL

（四分位範囲

: 0.163 – 0.979

）（

n = 42

）であり、

NC

群は中央値

0.546

μg / mL

（四分位範囲

: 0.309 – 1.51

）（

n = 42

）だった。

NC

群の方が

CSU

患者 群よりもフリー抗

α

鎖抗体濃度は統計学的に有意に高かった（

p = 0.0262

）（図

18

）。

28

小括 3

フリー抗

α

鎖抗体が主にマスト細胞や好塩基球の活性化能を持つと考えられる が、フリー抗

α

鎖抗体濃度は

NC

群の方が

CSU

患者群よりも統計学的に有意に 高かった。そこで

2

つの仮説を考えた。①

Soundararajan

ら⁽²⁷⁾は、

CSU

患者の 総

IgG

における

IgG1

分画が

IgG4

分画より好塩基球活性化能が高く、抗

α

鎖 抗体の機能の決定には

IgG

分画の配分が重要であると考察した報告があるため、

NC

群ではマスト細胞の活性化能の低い

IgG4

分画の抗

α

鎖抗体濃度が高い可能 性がある。②フリー抗

α

鎖抗体が

CSU

患者群では既にマスト細胞や好塩基球に 結合しているため見かけ上低値にみえる可能性がある。そこで②は検討が難し いため、次に①の検証を行った。

29

方法 4

4-1.

各抗

α

鎖抗体の

IgG1

、

IgG4

分画の測定

ditection antibody

をビオチン標識マウス抗

IgG4

および

IgG1

（

1 μg / mL

） に変更し、方法

3

と同様の

ELISA

の系を用い、

IgG4

分画および

IgG1

分画総 抗

α

鎖抗体価を算出した。同様に

IgG4

分画可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体価を算 出した。

IgG4

分画総抗

α

鎖抗体価から

IgG4

分画可溶性

α

鎖結合抗体価を引き、

IgG4

分画フリー抗

α

鎖抗体価を算出した。

30

結果 4

4-1. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画総抗

α

鎖抗体価の比較

CSU

患者群の吸光度は中央値

0.0250

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.00716 – 0.0598

）

（

n = 42

）であり、

NC

群の吸光度は中央値

0.0315

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.0148 – 0.0850

）（

n = 42

）だった。

CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画総抗

α

鎖抗体 価に統計学的な有意差はなかった（

p = 0.0931

）（図

19

）。

4-2. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体価の比較

CSU

患者群の吸光度は中央値

0.0252

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.00968 – 0.0483

）

（

n = 42

）であり、

NC

群の吸光度は中央値

0.0227

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.00974 – 0.0629

）（

n = 42

）だった。

CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画可溶性

α

鎖結 合抗

α

鎖抗体価に統計学的な有意差はなかった（

p = 0.540

）（図

20

）。

4-3. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG4

分画フリー抗

α

鎖抗体価の比較

総抗

α

鎖抗体と可溶性

α

鎖結合抗

α

鎖抗体の測定は同じプレートで行い、測 定値の差をフリー抗

α

鎖抗体の吸光度として算出した。

CSU

患者群の吸光度は 中央値

0.000575

（

OD450

）（四分位範囲

:

－

0.00211 – 0.0105

）（

n = 42

）であ り、

NC

群の吸光度は中央値

0.00973

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.00361 – 0.0176

）

（

n = 42

）だった。

NC

群の方が

CSU

患者群よりも

IgG4

分画フリー抗

α

鎖抗 体価は統計学的に有意に高かった（

p < 0.0001

）（図

21

）。

ASST

試行例でも同様に比較した。

ASST

陽性群の

IgG4

分画フリー抗

α

鎖抗 体価の中央値は

0.00175

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.000469 – 0.0150

）（

n = 8

） であり、

ASST

陰性群の中央値は

0.000623

（

OD450

）（四分位範囲

: 0.000145 –

0.00935

）（

n = 8

）であった。

ASST

陽性群と

ASST

陰性群間の

IgG4

分画フリ

31

ー抗

α

鎖抗体価に統計学的な有意差はなかった（図

22

）。

4-4. CSU

患者群と

NC

群間の

IgG1

分画および

IgG4

分画総抗

α

鎖抗体の比の 比較

CSU

患者群と

NC

群間の総抗

α

鎖抗体の

IgG1

分画と

IgG4

分画の比に有意 差があるかを検証した。

CSU

患者群の総抗

α

鎖抗体の

IgG1

分画と

IgG4

分画 の比の中央値は

1.01

（四分位範囲

: 0.478 – 1.76

）（

n = 42

）であり、

NC

群の総 抗

α

鎖抗体の

IgG1

分画と

IgG4

分画の比の中央値は

0.677

（四分位範囲

: 0.304

– 1.12

）（

n = 42

）だった。

CSU

患者群の方が

NC

群よりも総抗

α

鎖抗体の

IgG1

分画と

IgG4

分画の比は統計学的に有意に高かった（

p = 0.0098

）（図

23

）。

32

小括 4

IgG4

分画の抗

α

鎖抗体はマスト細胞や好塩基球を活性化させる能力に劣り、

NC

群では

IgG4

分画の抗

α

鎖抗体濃度が高い可能性がある、という仮説を支持 する結果が得られた。そこで実際に

CSU

患者と

NC

の精製

IgG

がマスト細胞 を活性化するかどうか確認実験を行なった。しかし、抗

IgE

抗体や抗

α

鎖抗体 の濃度は、

IgG

全体の

1/5000

～

1/50000

であり、結果は自己抗体濃度が高い検 体でもマスト細胞の脱顆粒率が、多くて

1

～

2%

上昇したのみであった。したが って、マスト細胞を用いた

CSU

患者と

NC

の精製

IgG

によるマスト細胞の活 性化能の検証は不可能と判断した。血清中に存在する、食物アレルギーの特異的

IgE

によるマスト細胞の活性化を検証する感度の高い実験系が、中村亮介博士

（国立医薬品食品衛生研究所、医薬安全科学部）から

IgE crosslinking-induced

luciferase expression (EXiLE)

法として報告されており⁽²⁸⁾、次にこの

EXiLE

法 で解析を進めた。

33

方法 5

5-1. CSU

患者群と

NC

群の精製

IgG

によるマスト細胞活性化能の測定

ヒト

FcεRIα/β/γ

鎖と

nuclear factor of activated T cells

（

NFAT

）

-responsive luciferase reporter

を発現したラット好塩基球白血病細胞株（

RBL-2H3

細胞）

（以下この細胞を

RS-ATL8

細胞と呼ぶ）は、国立医薬品食品衛生研究所、医薬 安全科学部、第三室、中村亮介室長よりご供与して頂いた。この

RS-ATL8

細胞 はヒト

FcεRI

の架橋で

NFAT

の核内移行が起こったとき、

luciferase

が発現す る細胞である。この細胞に基質（

luciferase assay substrate

）を添加することに よ り 発 光 す る 。 発 光 強 度 に よ り

FcεRI

の 架 橋 の 程 度 を 測 定 す る 方 法 が

Nakamura

らによって

EXiLE

法として報告された⁽²⁸⁾。この細胞を用いて

CSU

患者群と

NC

群の精製

IgG

分画による

FcεRI

架橋の強度に差があるかどうかを 調べるため、

Nakamura

らの方法に準じ、最適な条件を設定した。

RS-ATL8

細 胞を

2 × 10

⁵

cells/well

で

24 well plate

（

CORNING

）に播種し、

37 º C

、

5% CO

2

下で

2

日間培養した。培地は

MEM

、

10% FBS

、

1% GlutaMAX-I

、

1% Penicillin- Streptomycin

、

Geneticin

（

0.5 mg/mL

）、

Hygromycin B

（

0.2 mg/mL

）で作成 した（以下

MEM

培地と呼ぶ）。

2

日後、

well

中の上清を除去し、

MEM

培地を

2 mL

加え、ピペッティングで

plate

に接着している

RS-ATL8

細胞をはがし、

1 mL

ずつ別の

well

に播種して、上記同様に培養した。

2

日後、

well

中の上清 を除去し、

MEM

培地を

2 mL

添加した。その

well

から細胞をはがし、

2 × 10

⁴

cells/well

で、

96 well plate

（

CORNING

）に播種し、一晩培養した。翌日、

well

中の上清を除き、

PBS

で

well

を洗浄後、

CSU

および

NC

由来の精製

IgG

分画

（

30 ng/mL

）を

50 μL

ずつ添加し、

3

時間刺激した。刺激後、上清を完全に除 去し、

luciferase assay buffer

で、細胞を破砕した。細胞破砕液を

20 μL

ずつ

96

well white plate

（

BERTHOLD, Tokyo, Japan

）に添加し、さらに

luciferase

34

assay substrate

を

50 μL

ずつ加え、

Centro LB 960

（

BERTHOLD

）で発光を 検出した。

fold increase

は、

RS-ATL8

細胞に

MEM

培地のみを添加した発光強 度を

1

として算出した。同一プレートに必ず

CSU

患者群と

NC

群を置き、内在 性のコントロールとして、

CRA1

および

paramethoxyamphetamine

（

PMA

）（

1 μg/mL

）

+ Ionomycin

（

10 μg/mL

）（以下

P + I

と呼ぶ）刺激による発光強度を 毎回測定した。

1 ng/mL

の

CRA1

の刺激によって

fold increase

が

10

未満の実 験データは刺激が適切に入っていないものとして採用せずやり直すこととした。

また

NFAT-responsive luciferase reporter

のみを発現した

RBL-2H3

細胞を神 奈川県衛生研究所、理化学部、秋山晴代先生よりご供与して頂いた。この細胞は ヒト

FcεRIα/β/γ

鎖を発現していない細胞（以下

RBL-NL4

細胞と呼ぶ）で、

RS-

ATL8

細胞のネガティブコントロール細胞として用いた。