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実験 的高 アルギニ ン血症 ウサギに関す る研究

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Academic year: 2022

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(1)実験 的高 アルギニ ン血症 ウサギに関す る研究 第2編 ア ル ギ ニ ン大 量 負 荷 ウ サ ギ 尿 中 の guanidinosuccinic. acidに. つ いて. 岡山大学 医学部脳代謝研 究施設機能生 化学部 門(主 任:森 昭胤教授) 洲. 脇. 貞. 吉. (昭和53年8月24日 受稿). れ て い る2).また, Takahara15,16)ら 第1章. 言. acid(以. 下GSAと. Steinお. よ びBonas1)に. Guanidinosuccinic. 緒. は1964年. にNatelson,. vaninosuccinic 略 記 す る). GSAが. よ り. の 後,彼. らの 研 究groupを. 度 が 増 加 し て い る こ と,す. の 増 加 す る こ と が 観 察 され,尿 る物 質 の1つ. お り,灌. 毒 症 の病 因 と関係 あ. aspartic. 流 実 験 の 結 果 か ら, GSAはarginineの acidへ. のtransamidinationに. よ って 肝. は 先 報13)に お い て 報 告 し た 高 ア ル. ギ ニ ン血 症 ウ サ ギ に,さ. 報13)の. ル ギ ニ ン血 症 に お い て も み られ た ご と く,代. 検 出 され な か っ た と報 告 して. し た が っ て,私. 体chromato. よ る も の が 主 流 で あ る が,先. 投与後の尿中. に お い て 生 成 さ れ る と 述 べ て い る.. ア ニ ジ ノ化 合 物 の 化 学 的 分 析 は上. 述 の 諸 研 究 に もみ ら れ る ご と く,液 graphyに. か ら は 放 射 性GSAは. と考 え られ る に 至 っ て い る2〜12).. さ て 一 般 に,グ. 分 離 し た が,. D.L‑〔guanidine‑14C〕canavanineの. な わ ち体 内 生 成. 方,. ラ ッ トにL‑〔guanidine‑14C〕‑arginine. を 腹 腔 内 投 与 し て 尿 中 に 放 射 性GSAを. は じ め 多 くの. 研 究 者 に よ り慢 性 腎 不 全 の 患 者 で は 血 中 お よ び 尿 中 GSA濃. は 肝 に よ るcana. 還 元 的 開 裂 反 応 に よ って. 生 成 さ れ る 過 程 を 提 示 し て い る が,他. Perez17)は. 尿 毒 症 患 者 尿 よ り分 離 さ れ た グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 で あ る が,そ. acidの. 高 ア. ら に 併 せ てaspartic. を 負 荷 す る こ と に よ り,. 謝異常. r‑guanidinobutyric. acidな. acid. guanidinoacetic. acid,. どの グ ア ニ ジ ノ化 合 物. の あ る場 合 に は数 多 の 未 知 グ ア ニ ジ ノ化 合 物 が尿 中. に つ い て 知 ら れ て い る と 同 様 なtransamidination. に 出 現 し, chromatogramの. 諸peakが. 反 応 に よ り, GSAが. 離 し て お らず,特. ど酸 性 グ ア ニ ジ ノ 化 合. にGSAな. 物 の 溶 出 す る 部 分 に は, chromatogram上. overlapす. 必 ず し も単. る も の も多 く,. の 溶 出 時 間 の み で,未. spectrometry(以. よ り確 認 す る た め,ま. 第1節. 下GC/MSと. し た.飼. 略 記 す る)に. ずGSAをMoriら14)の. 4,オ. 方 法. せ た.飼. 反 応 さ せdimethylpyrimi. 導 体 と な し, GC/MSの. tic acidか. 測 定 を 行 い 尿 中GSA. ginosuccinic. 第2節. acidの. リエ ン タ ル 酵 母)を 育 室 は 室 温24℃,湿. 用 い,水. は 自由 に 摂 取 さ. 度55%に. 保 ち,. 12時 間. か ら 午 後1時. ま で を 明 る く し た.. 体 内 生 成 過 程 に 関 し て は, aspar. らtransamidinationに. の 幼 若 ウサ ギ を雌 雄 を とわ ず使 用. 料 は ウ サ ギ ・モ ル モ ッ ト用 固 型 飼 料(RC‑. の 明 暗 サ イ ク ル と な る よ う に 午 前1時. の 同 定 を 行 っ た. つ ぎ に, GSAの. 実 験 方 法. 実験 動 物. 体 重1〜1.8㎏. gaschromatography. に よ りacetylacetoneと dyl誘. たがっ. 報13)で 高 ア ル ギ ニ ン 血 症 ウ サ. ギ の 尿 中 に 見 出 し たGSAを, mass. 第2章. 知物質 を同. 定 す る こ と は か な りの 危 険 が 予 想 さ れ る.し て 本 編 に お い て は,先. 過 剰 に生 成 され 尿 中 に排 泄 さ. れ る か ど う か を 検 討 す る こ と に し た.. ア ミノ酸 負 荷 方 法. Mono‑sodiumaspartic. よ る方 法 やar. れ ぞ れ0.2M濃. 異 常 開 裂 に よ る過 程 が 想 定 さ. た.. 1393. acid及. びarginineを. そ. 度 に し た水 溶 液 を 自由 に摂 取 せ しめ.

(2) 1394. 洲. 第3節. 脇. 貞. 吉. 試料の調整. 尿 は 毎 朝9時. に24時 間 尿 を 採 取 し た.グ. ア ニ ジノ. Masss. グ アニ ジ ノ化 合物 定 量 方 法. 先 報 と 同 様 にMatsumoto12)ら 第5節. GC/MS測. GSA標 た.す. Moriら. の 方 法 に よ っ た.. Mo.,. chemical. bicarbonateに. Co.. 水1.0mlを. 混 液 を 減 圧 乾 固 し,つ い で,水10mlに て2回. 洗 浄 後,減. 飽 和n‑butanolを た.つ. るsyrup様. を 使 用. : 1)0.2mlに. た.こ. 溶 解 し, ethyl. 第1節. (1)GSAの. し, n‑butano1:. acetic. て 展 開 し, GSA合. 試 料. 荷 ウ サ ギ 尿30mlを. acid:水(12:. ethylalchoholに. 減 圧 乾 固 し た.こ. れ を水1.0mlに. SA標. 3:. 溶 解,. 準 試 料 を 同 様 な 操 作 を 行 っ てGC/MS同. 試 料. . 1に. 176, 250, 278, 351に. それ ぞ れ 比 強 度. 観 察 さ れ た.そ. れぞれの. 下 記 の ご と く と 理 解 さ れ る.. m/e. pyridine. を 作 成 し た.. 176:. M+‑COOBu‑BuOH. 250:. M+‑COOBu. 278:. M+‑Bu. 351:. M+. 一 般 的 に グ アニ ジ ノ化 合 物 は揮 発 性 に とぼ しい とい うguanidine基. の 性 質 の た めGC/MSの. 測 定 は不. 可 能 と さ れ て い た が, Vetter‑Diechtleら16)はar. GC/MS:日. 立 製RMU‑6MG型. 用 し た.測 Gas. peakは. の部分. 加 え た の ち 上 記G. 導 体 のbutylester. 2‑〔2'‑(4',6'‑dimethylpyrimidyl)〕. 514, 1000, 74, 174のionが. て 抽 出 し た の ち,. 1.0mlを. spectrum. ‑aminosuccinateのmass‑spectrumはFig. ion 5)に. 成 標 品 と 一 致 す るRf値. acetylacetone. 減. 526(40×40cm)にspot. を 切 り と り, 50%. 351. よ る同 定. 標 準 試 料 のmass. す な わ ちdi‑n‑butyl. の1μlをGC/MS用. Arginine負. 278,. 実 験 成 績 お よ び考 按. GSAのdimethylpyrimidyl誘. 示 す ご と く,m/e. ウ サ ギ 尿 試 料:. Recording(m/e)250,. し た.. GC/MSに. と し た.. 1.0ml,. Ion. 160℃. 高 ア ル ギ ニ ン 血 症 ウ サ ギ 尿 中GSAの. HClgas. pyridine‑methanol(1. 圧 濃 縮 し た の ち 東 洋 〓 紙No. 45uA/SOμA. temperature. 第3章. の反 応. 間 温 浴 上 に てrefluxし. 溶 解 し,そ. 40V. current. source. Selected. の反 応 液 を再 び減 圧 乾 固 して え られ. 物 質 を 約2㎎,. Ion. St.. 圧 乾 固 せ し め,. 加 え3時. い で,こ. He. 調 整 し たの. ち, 100℃ の 温 浴 中 で10時 間refluxし. etherに. 1.0kg/cm. voltage. 加 え, sodium. よ っ てpHを8.0‑9.0に. 1%. 190℃. gas. Chamber. の 方 法14)に 準 拠 し て 行 っ. USA)10mgに. OV‑1. Target/total. な わ ち, GSA(Sigma. Louis,. temperature. pectrometry. 定方法. 準 試 料:. packing. Column Carrier. 化 合 物 測 定 用 試 料 の 作 成 法 は 先 報13)と 同 様 で あ る. 第4節. Column. 質 量 分 析 計 を使. 定 条 件 は 下 記 の ご と くで あ る.. chromatography Column. ginineのamidine基. とacetylacetoneを. dimethylpyrimidyl基. と な し, mass. を 行 い,つ. length. 50cm. Fig. 1. Mass. づ い てMoriら14)はarginineの. guanidinoacetic. Spectrum. 反 応 させ spectrometry. acid,β‑guanidinopropionic. of Dimethylpyrimidyl-GAS-butylester. ほ か,.

(3) 実験 的 高 ア ル ギ ニ ン血症 ウサ ギ に 関 す る研 究 acid,γ‑guanidinobutyric 適 応 し,. acidに. di‑metylpyrimidyl誘. butylesterと 功 し た が,私. も同様 な方 法 を. 導 体 と な し,さ. らに. し てGC/MS測. 定 を行 うこ とに成. は こ こ にGSAに. も同 様 な 方 法 を 適 応. し てGC/MS測. 1395. はarginineのaspartic. acidへ. transamidinationに. の下 記 の ご と き. よ って 生 成 さ れ る こ と を 強 く示. 唆 す る も の と い え よ う.. 定 を 行 う こ と が で き た.. (2)高 ア ル ギ ニ ン 血 症 ウ サ ギ 尿 中GSAのSelected ion. recordingに. よ る同 定. Gaschromatographyに 時 間 を 示 すpeakに. お い てGSAと. を 行 っ た.す. つ い てselected. な わ ち,上. 同 じ保 持 ion recording. 記GSA標. 準試料 につい. の て 分 析 結 果 か ら え られ たionpeakの 250,. m/e. とm/e. 278, 278及. m/e. びm/e. を 測 定 し た.そ. m/e. 250. 351のion強. Fig.. 度 比. 2の ご と き記 録 が え られ. 1に そ れ らの 成 績 を 整 理 し て 示 した.す な. わ ち, Table. 1は 標 準GSAと. 351/278,. m/e. ウ サ ギ 尿 申 の 成 分 との. 278/250は. い ず れ もpeak強. 比 の 良 い 一 致 を 示 し て お り,高 ギ 尿 中 にGSAの 第2節. う ちm/e 用 い,. 278とm/e. の 結 果,. た の で, Table. m/e. 351(M+)を. 度. ア ル ギ ニ ン血症 ウサ. 存 在 す る こ と が 証 明 さ れ た.. Arginine及. びaspartic. acid同. サ ギ の 尿 中 へ のGSAの. 時負 荷 ウ. 異常排 泄について. 先 報13)に お い て は 実 験 的 高 ア ル ギ ニ ン 血 症 ウサ ギ を 作 成 の た め5%. arginine水. を 自 由 に飲 用 せ し め. た の ちの グ ア ニ ジ ノ化 合 物 の 尿 中 排 泄 量 に つ い て報 告 し た が,そ. の 後 の 検 索 の 結 果3%. arginineを. 使. 用 し て も排 泄 さ れ る 諸 グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 の 濃 度 に は 有 意 な 変 化 が 認 め られ な い こ と か ら,本 て はmonosodium. aspartic. そ れ ぞ れ0.2M溶. 液(monosodium. 約3.1%,. arginine:約3.5%)を. し め た.負. 荷 後1週. GSA尿 ne投. acid及. aspartic. acid:. 自由 に経 口摂 取 せ. 間 の 経 日 的 変 化 をFig.. 中 へ の 排 泄 はaspartic 与 の2日. 実験 におい. びarginineを. acid及. 3に 示 す. びargini. 後 に 一 過 性 に 最 高 値 を と り, 4, 5日 後. に 一 端 対 照 値 近 く ま で 下 降 す る が,. 6,. 7日 後 よ り. 再 び 上 昇 の 傾 向 が あ る こ と が 認 め られ た.こ は 先 報13)のarginineの 経 過 と い え る が,排 る と, arginine単. acid併. 泄 量 の 絶 対 値 は3日. 対 し,. arginineとas. や や 高 く,. で は 前 者10‑24μmoles/24hrs(平 対 し,後. Selected. Ion. Acid. in. Recording. 7日. Identification. of Guanidinosuccinic. Acid(GSA). in. Rabbit 後の値. 均17μmoles/24. 者 で は22‑86μmoles/24hrs(平. の 成 績 はPerezら17)が. by. Table 1.. 用 負 荷 側 で は16‑72μmoles/24hrs. 54μmoles/24hrs)と. Urine. of Guanidinosuccinic. 目で 比 較 す. 独 負 荷 側 で は18‑44μmoles/24hrs. (平 均40μmoles/24hrs)と. hrs)に. Identification. み の 負 荷 実 験 とほ ぼ同様 な. (平 均30μmoles/24hrs)に partic. の経 過. Fig. 2. 均. 著 明 な 増 加 を 示 し て い る.以 上 提 唱 し て い る ご と く, GSA. Recording. Urine. Hyperargininemic by. Selected. Ion.

(4) 1396. 洲. Fig. 3. GSA. 第4章. Excreation. in the. 結. 脇. Urine. 貞. 吉. of Rabbit. Loaded. ま た,高 論 ginineと 私 は 先 に ウ サ ギ にarginineを. 負 荷 して作 成 し た. 高 ア ル ギ ニ ン 血 症 ウ サ ギ の 尿 中 に,液 gram上GSAと し た が,こ toneと. C/MSの. 排 泄 され るこ. 行 うこと. たG. 測 定 に御 協 力 い た だ い た 山之 内 製 薬 株 式 会 社 開. 献. J. E., Cohen, B. D. and Natelson, Application. 2) Cohen, B. D., Stein,. to human urine.. I. M. and Bonas,. pathway for urea. S. Separation. and. Microchem.. 7,. acids. by column. I. M., Cohen,. synthesis.. experimental. azotomia. J.,. 8,. errors. of. certain. aciduria. 371-382,. A possible. 1968.. and identification. of. of. guanidino. guanidinosuccinic. 1964.. R. S. Guanibinosuccinic. of the urea. guanidino. in uremia.. in the method of separation. Isolation. B. D. and Kornhauser, and inborn. estimation 63-77, 1963.. Amer. J. Med. 45, 63-68,. chromatography.. Microchem.. J.,. J. E. Guanidinosuccinic. S., Stein, I. and Bonas, J. E. Improvements. acid from human urine. Stein,. 体 内 でaspartic. 発 研 究 所 測 定 室 市 村 孝 道 氏 に 感 謝 い た しま す.. compounds.. 4). 測 定 し, GSAは. 同時 に負 荷 し た. 終 わ りに あ た り,終 始 御 懇 篤 な 御 指 導 と御 校 閲 を 賜 わ. 文. organic. acidを. りま し た 森 昭 胤 教 授 に 深 く感 謝 の意 を捧 げ ま す.ま. と を 確 認 し た.. alternate. ア ル ギ ニ ン血 症 ウ サ ギ 作 成 の 過 程 にar. に よ っ て 生 成 さ れ る こ と を 示 唆 す る成 績 を え た.. 見出. 定 を 行 い,高. ア ル ギ ニ ン 血 症 ウ サ ギ 尿 中 にGSAが. 3) Natelson,. Acid. acidがarginineとtransamidinationを. 導 体 と し,そ. つ い てGC/MS測. 1) Bonas,. Aspartic. 該 物 質 をacetylace. 反 応 さ せdimethylprimidyl誘. のbutylesterに. and. 同 モ ル のaspartic. の ち 尿 中 のGSAを. 体chromato. 同 一 溶 出 時 間 の 大 き なpeakを こ に 確 認 の た め,当. Arginine. cycle.. acid. in renal. failure,. New Eng. J. Med., 280. 926-930,. 1969. 5) Cohen, B. D. Guanidinosuccinic. acid in uremia.. Arch. Intern.. Med.,. 126, 846-850,. 1970..

(5) 実 験 的高 アル ギ ニ ン血 症 ウサ ギ に 関 す る研 究. 6) Horowitz, H. I. Ureimic 7) Lonergan, Med.,. 8) Giovannetti, 9) Dobbelstein,. cause. Arch. Intern. Med., 126, 851-854, 1970.. Klinische. uremia.. in uremia.. Arch.. K. and Natelson,. of Kidney dysfunction.. M., Kishikawa,. and in the sera. Klin. Wschr.,. 49,. 1077-1083,. S. Urinary A.. Guanidino. 49, 348-357,. 1971. and Uramie.. of experimental. in the. rabbits.. Biochem.. uremic. Anal. Biochem.,. 89, 393-399,. sera. K., Nakanishi,. and canavaninosuccinic. S. and Natelson,. S.. acid. Arch. Biochem.. Med.,. liver.. J. Clin. Invest.,. 18) Vetter-Diechtle,. 57, 807-809,. uremic 16, 1-8,. mass spectrometry. of guanidino. Biophys.,. in the reductive 145, 85-95,. acid, a substance. cleavage. of canavanine. 1971.. of guanidinosuccinic. acid. by perfused. 1976.. H., Vetter, W., Richter, W., and Biemann, K. Ein fur Massenspektrometrie und. Gaschromatographie. geeignetes. Argininderivat.. お. 1978.. 1978.. Studies. 17) Perez, G., Rey, A., and Schiff, E. The biosynthesis. of. アル ギ ニ ン大 量 負 荷 ウサ ギ の血 清,尿. 15) Takahara, K., Nakanishi, S. and Natelson, S. Cleavage of canavaninosuccinic found in the urine of uremic patients. Clin. Chem., 15, 398, 1969. 16) Takahara,. ratio. 1973.. compounds. T. and Matsumoto, H. Gas chromatography. in brain.. some. M. Guanidinbernsteinsaure. よび脳 組 織 中 の ア ミノ酸 並 び に グ ァニ ジ ノ化 合物 に つ い て,岡 山 医 学 会 誌. 90, 1093‑1104,. compounds. and. 34, 141-148, 1968.. guanidinoacetate/guanidinosuccinate. 13) 洲脇 貞吉:実 験 的 高 アル ギ ニ ン血 症 ウサ ギ に 関 す る研 究,第1編. 14) Mori, A., Ichimura,. Intern.. 1971.. Clin. Chem., 19, 315-321,. H. and Mori,. and brain. guanidines. G. and Edel, H. H. Guanidinbernsteinsaure. Befunde. Klin. Wschr.,. M., Takahara,. that. Clin. Sci.(Oxf.),. G. and Weinzierl,. Untersuchungen. H., Grunst, J., Schuberts,. II. Tierexperimentelle. 12) Matsumoto,. in chronic. H., Edel, H. H., Schmid, M., Schubert,. : An indicator. activity. P. L. anb Biagini, M. Evidence. haemolysis. and Uramie. l. Mitteilung: 10) Dobbelstein,. patients 1976.. function.. 1970.. S., Cioni, L., Balestri,. compounds. 11) Sasaki,. and platelet. E. T., Semar, M. and Lange, K. Transketolase. 126, 851-854,. related. toxins. 1397. Experientia,. 24, 340-341,. 1968.. rat.

(6) 1398. 洲. Experimental. arginine. loaded. 貞. model. II. Identification of the. 脇. of. hyperargininemia. of guanidinosuccinic rabbit. and. a possible. Sadayoshi Department. 吉. University. (Director:. pathway. in urine of. its formation. SUWAKI. of Neurochemistry, Okayama. acid. Institute. for Neurobiology. Medical School. Prof. A. Mori). Authentic guanidinosuccinic acid was converted into dimethylpyrimidyl derivative by reaction with acetylacetone, the carboxyl group was esterified by butylalcohol, and this deri vative was analysed by the GC/MS technique. Then guanidinosuccinic acid was identified in urine of arginine loaded rabbit by means of selected ion recording. On the other hand, aspartic acid and isomolar of arginine was loaded simultaneously to rabbit, and a higher level of guani dinosuccinic acid was detected in the urine of 2 or 3 days and one week after. This fact suggest that guanidinosuccinic acid could be produced by transamidination of aspartic acid, receiving amidine group of arginine..

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