学位論文の内容の要旨
論 文 提 出 者 氏 名 寺﨑 宏明
論 文 審 査 担 当 者 主 査 下門 顕太郎 副 査 岡﨑 睦、大橋 勇
論 文 題 目 A quantitative method for evaluating local perfusion using indocyanine green fluorescence imaging
（論文内容の要旨） 【 要 旨 】
Ind ocyanine Green(ICG )は 血 中 に 投 与 さ れ る と 直 ち に タ ン パ ク と 結 合 し 蛍 光 を 発 す る 。 さ ら に 血 管 内 に と ど ま り 胆 汁 内 に 排 泄 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る 。 こ の 蛍 光 は 近 赤 外 線 で あ り 人 体 を 容 易 に 通 過 す る た め に 体 外 か ら の 観 察 が 可 能 で あ る 。 こ の 性 質 を 利 用 し て 局 所 の 微 小 循 環 を 定 量 的 に 評 価 す る 方 法 を 考 案 し 臨 床 応 用 し た 。 励 起 光 の 光 源 と 蛍 光 を 感 知 す る カ メ ラ が 一 体 と な っ た 装 置 PDE (Ph otodynami c Eye :HA MAMATSU P hotonics K.K.)を 用 い て コ ン ピ ュ ー タ ー 上 に 蛍 光 を 記 録 、一 定 の 範 囲 で の 輝 度 を プ ロ ッ ト し 解 析 し た 。ま ず ICGの 至 適 濃 度 を 決 定 す る た め に 、採 取 し た 血 液 に 濃 度 を 変 え た ICGを 混 合 し 、そ れ ぞ れ の 輝 度 を 測 定 プ ロ ッ ト し 、 そ の 値 か ら 検 査 に 用 い る 濃 度 を 0.1mg/kgと 決 定 し た 。 足 部 虚 血 を 評 価 す る た め に 、足 背 の 広 範 囲 で 輝 度 が 上 昇 開 始 点 か ら 最 大 値 の 1/2に 達 し た 時 間 を T1/2と 規 定 し た 。中 央 値 は Fontaine II度 :23se c（ 中 央 値 ）、III度 :41 sec （ 中 央 値 ） と 有 意 差 を 認 め た 。 経 皮 酸 素 分 圧 検 査 (transcu taneous o xygen pre ssure: Tc P02)の プ ロ ブ と 同 じ 部 位 の 輝 度 の 上 昇 開 始 10秒 後 の 値 を PDE1 0と 規
定 し た 。 TASC II(Trans Atlantic Inter-Soc iety Cons ensus II) に お け る 重 症 虚 血 肢 の 指 標 で あ る TcP02<30mmH g に 対 し ROC curveを 用 い て カ ッ ト オ フ 値 28が 得 ら れ 、 感 度 100%、 特 異 度 86.6 %で あ っ た 。 ICG蛍 光 法 を 用 い て 局 所 の 組 織 血 流 の 定 量 的 な 評 価 が 可 能 で あ っ た 。 【 は じ め に 】 虚 血 肢 に お い て 創 治 癒 予 測 、手 術 適 応 や 術 後 の 追 加 治 療 の 必 要 性 の 判 断 を す る う え で 局 所 の 微 小 循 環 の 評 価 は 重 要 で あ る 。現 在 の と こ ろ 臨 床 で は 足 関 節 血 圧 (an kle press ure: AP)、 足 趾 血 圧 (toe pre ssure: TP)、 経 皮 酸 素 分 圧 (TcP02)
、 皮 膚 濯 流 圧 (skin pe rfusion p ressure: SPP)な ど を 測 定 し 評 価 し て き た 。 AP や TPは 比 較 的 太 い 動 脈 の 血 圧 の 測 定 で 局 所 の 微 小 循 環 に つ い て は 間 接 的 な 評 価 で あ る 。 ま た TcP02や SPPは 直 接 的 な 評 価 で あ る が 、 測 定 部 に 接 触 型 の プ ロ ブ を
- 2 - 使 用 す る た め 潰 瘍 部 に は 直 接 使 用 で き ず 比 較 的 近 傍 の 健 常 部 の 測 定 に と ど ま る な ど 、 そ れ ぞ れ の 検 査 法 に 欠 点 を 有 し て い た 。 そ こ で わ れ わ れ は 低 侵 襲 で 非 接 触 型 、 さ ら に 血 流 を 直 接 的 に 評 価 で き る ICG蛍 光 測 定 法 に 着 目 し た 。 【 対 象 と 方 法 】 使 用 し た 装 置 は 励 起 光 の 光 源 と し て 波 長 760nmの 発 光 ダ イ オ ー ド (Lig ht Emi tting Dio de: LED)と 励 起 光 の 波 長 を カ ッ ト す る レ ン ズ に 覆 わ れ 近 赤 外 光 に 感 度 を 有 す る CCDカ メ ラ が 一 体 と な っ た 蛍 光 観 察 装 置 PDEで あ り 、 観 察 し た 画 像 は 全 て コ ン ビ ュ ー タ ー 上 に 記 録 し た 。 記 録 し た 画 像 上 で あ る 一 定 の 範 囲 を 固 定 し ROIs（ ROIs Analy sis Progra m:HA MAMATSU P hotoni cs K .K.)を 用 い て 輝 度 を 256 階 調 で 表 示 し て time-intensity curveに プ ロ ッ ト し た 。
至 適 血 中 濃 度 を 算 定 す る た め に 採 取 し た 血 液 中 に ICGを 混 和 、 濃 度
0.0 001-0.002 5mg/mlを 作 成 し 20cmの 距 離 か ら PDEを 用 い て 2.8mW/ cm2の 強 度 の 励 起
光 下 で 撮 影 し 輝 度 を 測 定 し た 。
200 7年 一 2009年 に 当 科 入 院 中 の 造 影 剤 使 用 歴 の あ る 末 梢 動 脈 疾 患
(pe ripheral arte rial disea se: PAD)症 例 34例 34肢 を 対 象 と し た 。 蛍 光 灯 の み 使 用 し た 室 温 18-28度 の 室 内 で 、 15分 間 の 安 静 臥 位 の 後 、 膝 を 軽 く 屈 曲 し 足 背 が 上 を 向 く よ う に し た 。足 背 か ら 20cmの 高 さ に PDEを 固 定 し た 。ICGO. 1mg/kgを 肘 静 脈 よ り 静 注 し 、 静 注 後 直 ち に 20cmの 距 離 か ら 2.8mW/cm2の 強 度 の 励 起 光 下 で 撮 影 し た 。 実 際 に は 投 与 し た 後 10-20秒 程 度 で 皮 下 の 動 脈 か ら 蛍 光 を 発 し 増 強 し て く る 。そ の 後 次 第 に 組 織 の 輝 度 が 上 昇 し た 後 に 末 梢 か ら 静 脈 が 描 出 さ れ 徐 々 に 中 枢 側 の 静 脈 が 鮮 明 に 描 出 さ れ て く る 。末 梢 の 動 脈 に 病 変 が あ る 場 合 は 側 副 血 行 路 を 介 し て い る た め 動 脈 は 鮮 明 に は 描 出 さ れ ず 、先 に 末 梢 の 組 織 の 輝 度 が 上 昇 し 、そ の 後 静 脈 の 輝 度 が 上 昇 す る 。
足 背 の 広 範 囲 の 輝 度 を time-int ensity curve に プ ロ ッ ト し た 。 上 昇 開 始 か ら 最 大 値 の 1/ 2 の 輝 度 に 達 し た 時 間 を 測 定 し T1/2 と 規 定 し 、 そ の 値 を Font aine II 度 と III 度 で 比 較 検 討 し た 。 さ ら に 経 皮 酸 素 分 圧 検 査 の プ ロ ブ 貼 付 部 位 の 狭 い 範 囲 の 輝 度 を time-inte nsity curv e に プ ロ ッ ト し た 。上 昇 開 始 か ら 10秒 後 の 輝 度 を 測 定 し PDE1 0と 規 定 し 、 TcP02の 測 定 値 と 比 較 検 討 し た 。
【 結 果 】
血 液 と ICG の 混 和 実 験 で は ICG 濃 度 0.0001-0 .001(mg/m l) ま で は 輝 度 が ほ ぼ ICG 量 に 比 例 し 、 輝 度 =1.8×103 ×濃 度 (mg/ml )で あ っ た 。
症 例 は 平 均 年 齢 70.9 ± 9.4 歳 、 男 女 比 29:5 で あ っ た 。 Fontaine 分 類 で は II 度 ： 11肢 、 III度 ： 7肢 、 IV度 ： 16肢 で あ っ た 。
T1/ 2で は 、Fon taine II度 :23sec（ 中 央 値 ）、III度 :41sec（ 中 央 値 ）と Mann-Wh itne y 順 位 和 検 定 を 用 い て 有 意 差 (p<0.01) を 認 め た 。
: y =0.88x+8. 2、 相 関 係 数 :R2=0.5 0で あ っ た 。 TASC I Iに お け る 重 症 虚 血 肢 の 指 標
で あ る TcP02<30 mmHg に 対 し ROC c urveを 用 い る と カ ッ ト オ フ 値 と し て 28が 得 ら れ
、 重 症 虚 血 の 診 断 能 は 感 度 100%、 特 異 度 86.6%で あ っ た 。
【 考 察 】
Lan geら に よ っ て フ ル オ レ セ イ ン を 用 い た PADに 関 す る 血 流 評 価 の 報 告 が な さ れ て 以 来 、 局 所 の 血 流 や 皮 膚 潅 流 を 評 価 す る 様 々 な 方 法 が 開 発 さ れ て き た 。 欧 米 で は 投 与 し た ICGを レ ー ザ ー で 励 起 可 視 化 さ せ 、体 外 か ら 観 察 す る こ と に よ っ て 局 所 の 組 織 濯 流 を 測 定 す る IC-View (Pulsion Medi cal System AG)が 商 品 化 さ れ て い る 。 視 覚 化 用 の ソ フ ト ウ ェ ア が 付 属 し 画 像 上 で 健 常 部 の 一 定 部 位 の 輝 度 を 測 定 し て 基 準 値 と し 、 輝 度 が 強 い 部 分 か ら 弱 い 部 分 へ 色 分 け し て 表 示 し て い る 。 ま た そ の 傾 き を 比 較 し て Perfusio n index と し て 算 出 し て い る 。 Holmら は こ の 機 器 を 用 い て 輝 度 の 上 昇 率 と 組 織 潅 流 に 相 関 が あ る こ と を 実 際 の 症 例 を 用 い て 報 告 し て い る 。 Wuestenf ieldら は こ の 機 器 を 用 い て マ ウ ス の 大 腿 動 脈 を 結 紫 し 虚 血 モ デ ル を 作 成 、 そ の 後 の 側 副 血 行 路 の 発 達 を 輝 度 の 上 昇 で 観 察 し て い る 。 PDEも 原 理 は こ の IC-Vie wと 同 様 で あ る 。 ICG は 分 子 量 約 770で 主 に 肝 機 能 検 査 薬 と し て 古 く か ら 使 わ れ て い る 薬 剤 だ が 、蛍 光 を 発 す る こ と も 知 ら れ て い る 。ICGの 蛍 光 は ピ ー ク が 845n mの 近 赤 外 領 域 に あ る た め 肉 眼 で は 観 察 で き な い 。生 体 内 で は 光 吸 収 物 質 と し て 水 と ヘ モ グ ロ ビ ン が 存 在 し て い る が 、 ヘ モ グ ロ ビ ン は 600n mよ り 短 波 長 の 可 視 光 を 吸 収 し 、 水 は 900 nmよ り 長 波 長 の 光 を 吸 収 す る た め 600-900nmの 近 赤 外 光 領 域 で は 減 衰 の 度 合 い が 小 さ い 。 こ の 領 域 を optical window( OW)と い う 。 PDEで 使 用 す る 励 起 光 (76 0nm)も ICGか ら 発 す る 蛍 光 (845 nm)も OWの 範 囲 内 で あ る た め 、 生 体 の 深 部 ま で 到 達 す る こ と が で き る 。現 行 の 機 器 で は 反 射 光 を 使 用 し て お り 、体 内 で は 主 に 脂 肪 に よ り 散 乱 す る た め 、体 表 か ら 10mmま で の 深 さ に 存 在 す る 血 管 や リ ン パ 管 の 観 察 が 可 能 で あ る 。 Bake rら は ICGが 血 中 で 直 ち に そ の 約 98%が α リ ポ 蛋 白 と 結 合 す る こ と を 報 告 し た 。α リ ポ 蛋 白 は 比 較 的 分 子 量 が 大 き い た め 血 管 内 に 留 ま り 、そ の 後 ICGは 速 や か に 肝 で 排 池 さ れ る 。 し た が っ て ICG 蛍 光 法 で 観 察 さ れ る 蛍 光 は 血 管 内 か ら 発 し て い る も の と 考 え ら れ る 。 ICGは 発 疹 ・ 嘔 気 な ど の 有 害 事 象 が あ り 、 ヨ ー ド ア レ ル ギ ー の 既 往 が 禁 忌 で あ る 。 ま た 使 用 し て い る LEDも
IEC (internat ional ele ctrotechn ical comm ission)の ク ラ ス Iで 人 体 に ほ と ん ど 影 響 が な い と さ れ て い る 。 肝 機 能 検 査 で 使 用 さ れ る ICGの 血 中 濃 度 は 0.5mg/kgだ が 、 こ の 濃 度 で は ROI sに よ る 測 定 限 界 を 超 え て い る 。 そ こ で ICGの 血 中 濃 度 に よ る 輝 度 を 測 定 し 前 述 の 結 果 を 得 た 。 こ の 中 で 0.001mg/ml を 至 適 濃 度 と し 、 通 常 の 約 50kg の 成 人 の 生 体 内 の 血 液 量 約 5Lか ら 概 算 し 、 ICGの 投 与 量 を 0.1mg/kgと 決 定 し た 。 ま た こ の 測 定 で の 最 大 値 は 230程 度 で 輝 度 が 測 定 限 界 を 逸 脱 す る こ と は な か っ た 。 定 量 化 の た め に 種 々 の パ ラ メ ー タ ー を 検 討 し た 。 ま ず 輝 度 の 絶 対 値 あ る い は
- 4 - 基 準 値 に つ い て は 、 症 例 数 が 少 な い こ と 、 脂 肪 に よ る 散 乱 や 心 拍 出 量 な ど の 生 体 に よ る 影 響 に 関 す る デ ー タ も 十 分 で は な い た め 今 回 は 除 外 し た 。 検 査 開 始 時 か ら 最 大 値 ま で の 輝 度 の 変 化 量 や 上 昇 率 が 実 際 の 重 症 度 と 相 関 が み ら れ た た め 足 部 全 体 の 評 価 と し て T1/2、 局 所 の 評 価 と し て PDE1 0を 用 い る こ と と し た 。 T1/2 を 用 い た と こ ろ 間 欠 性 跛 行 症 例 （ 軽 症 例 ） と 安 静 時 疼 痛 症 例 （ 重 症 例 ） で 有 意 差 が 見 ら れ 、 症 状 に よ る 分 類 を 定 量 化 で き た と 考 え ら れ る 。 重 症 度 分 類 と し て は Fontaine分 類 が 使 用 さ れ て い る が 、 自 覚 症 状 や 外 傷 な ど の 必 ず し も 虚 血 と 直 接 関 連 し な い 要 素 が 加 味 さ れ て い る 。 し た が っ て 虚 血 の 程 度 は 軽 症 で あ る が 外 傷 な ど に よ り 重 症 と 分 類 さ れ る こ と が あ る 。 そ こ で TASC -I I で は CLIと し て TP<50mmH g、TcP02<30 mmHgな ど の 基 準 を 定 め て い る 。Fagliaら は C L I 症 例 564例 に 対 す る 後 ろ 向 き 研 究 で TcP02<34 mmHg 以 下 で は 血 行 再 建 が 必 要 と 報 告 し て い る 。当 科 で は CLI症 例 の 重 症 度 評 価 に TcP02を 用 い て い る 。ROIsで は 比 較 的 狭 い 範 囲 の 測 定 も 可 能 で あ り TcP02の 測 定 部 に 一 致 さ せ た 部 位 で 輝 度 を 測 定 し 両 者 を 比 較 検 討 し た と こ ろ 、TcP 02<30mmHg に 対 し 感 度 100%、特 異 度 86.6%の カ ッ ト オ フ 値 PDE1 0:28が 得 ら れ た 。 TcPO2は 皮 膚 へ 拡 散 し て く る 酸 素 分 圧 を 測 定 す る こ と に よ っ て 微 小 循 環 を 評 価 す る 方 法 で あ る が 、 PDEは 毛 細 管 中 の ICG蛍 光 を 直 接 測 定 す る た め 微 小 循 環 を 直 接 的 に 評 価 し 得 る 。 ICG蛍 光 は 脂 肪 組 織 が 光 を 散 乱 す る 度 合 い が 大 き い た め 肥 満 者 の 場 合 、血 流 が 良 好 で も 輝 度 が 低 く な る 可 能 性 が あ る 。 ま た TcP02は 毛 細 血 管 網 か ら 遊 離 し て く る 酸 素 分 子 が 皮 膚 か ら 拡 散 し て く る の を 捉 え て 電 極 で 測 定 し て い る 。 そ の 測 定 原 理 の た め に 皮 膚 の 菲 薄 化 に よ っ て 高 値 と な り 、 皮 膚 の 酸 素 消 費 、 加 齢 や 心 肺 機 能 低 下 に よ る 動 脈 血 酸 素 分 圧 (Pa02)の 低 下 、交 感 神 経 活 動 に よ る 末 梢 血 管 の 収 縮 、 皮 下 脂 肪 や 角 質 の 厚 さ に よ り 低 値 と な る 。 今 回 の 結 果 で は PDEに 比 べ TcP02 が 低 値 の 例 が 散 見 し た が 、 い ず れ も 潰 瘍 症 例 で あ り 、 炎 症 な ど に よ り 皮 膚 の 酸 素 消 費 が 増 加 し た こ と が 原 因 と 考 え ら れ る 。 本 邦 で は 保 険 収 載 の 関 係 で 微 小 循 環 の 評 価 に は SPPが 使 用 さ れ る こ と が 多 い が 前 述 の TASC IIの よ う に 文 献 的 に は TcPO2が 評 価 さ れ て い る 。ど ち ら も プ ロ ブ や
マ ン シ ェ ッ ト な ど 接 触 型 の 検 査 の う え 、 接 触 し て い る 部 位 の み の 評 価 で あ る 。 ICG蛍 光 法 で は 観 察 し て い る 範 囲 全 て の 評 価 、さ ら に 経 時 的 な 観 察 に よ り 側 副 血 行 を 介 し た 血 流 も 評 価 可 能 で あ る 。 こ の 点 は 血 行 再 建 の 方 法 を 検 討 す る 上 で 非 常 に 重 要 で あ る 。 【 結 語 】 ICG蛍 光 法 を 用 い て 局 所 の 組 織 血 流 の 定 量 的 な 評 価 が 可 能 で あ っ た 。本 法 は 低 侵 襲 で 安 全 な 検 査 法 で あ り 、 ま た 非 接 触 的 な 測 定 法 で あ る た め 疼 痛 が 強 く プ ロ ブ 貼 付 が 困 難 な 部 位 や 、 潰 瘍 底 自 体 を も 直 接 的 に 評 価 で き 、 治 癒 予 測 や 虚 血 の 程 度 、 さ ら に 治 療 前 後 の 評 価 な ど に 有 用 で あ る 。
論文審査の要旨および担当者
報 告 番 号 乙 第 2333 号 寺﨑 宏明 論文審査担当者 主 査 下門 顕太郎 副 査 岡﨑 睦、大橋 勇 （論文審査の要旨） 虚血肢の微小循環の評価は、虚血肢の創傷治癒予想、手術適応や術後の追加治療の必要性を判 断するために重要である。従来用いられてきた検査方法は皮膚に直接プローブを装着する接触型 の検査であり、壊疽を伴う重症虚血肢等では利用できない欠点を有していた。申請者は ICG （indocyanine green）angiography を末梢動脈疾患（PAD）の診断に用いるために、検査条件を 最適化するとともに定量的な分析法を開発してその有効性を検討した。2007 年から 2009 年に当院血管外科に入院した PAD 患者 34 例、34 肢を対象に気温 18-28 度、15 分の安静臥位で足背を上に向け 20cm の距離に設置した検出器（photodynamic eye）を用い、経静 脈的に投与された ICG を検出した。初めに ex vivo の検討で ICG の至適投与量（0.1m g/kg）を 決定した。足背の比較的広い範囲を測定対象とし ICG の検出開始から最大値の 1/2 に達するまで の時間（T1/2）と、比較的狭い範囲の輝度を測定し検出開始から 10 秒後の蛍光強度（PDE10）を定
量的指標として 経皮酸素分圧(TcP02)による重症度と比較し有用性を検討した。
T1/2は Fontaine II 度と III 度で有意差を認めた。PDE10に関しては ROC 分析で得られた閾値
を用いて、TcP02 30mmHg 未満の重症虚血肢を感度１００％、特異度８６．６％で診断すること
ができた。
本法は安全で簡便な方法であり、非接触検査なので潰瘍を伴う重症下肢虚血にも応用可能であ る。定量的な分析を可能にしたことは、臨床的に有意義な研究であると評価できる。
