CMセルロースとプロナーゼ及びナガーゼの結合
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(2) . ｌｏｆ Ｈｏｋｋａ ｉｄｏ Ｕｎｉ Ｊｏｕｒｎａ ｉ ｉ ｉ ｔ ｔ ｔ ｓ ｏｎ （Ｓｅｃ ｏｎ 口 Ａ） ｖｅｒ ｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａ. Ｖｏｌ ．２４ ．Ｉ ， Ｎｏ. ｏｃ ｔ ｏｂｅｒ ｌ９７３. ＣＭ セ ルロー スと プロ ナー ゼ及び ナ ガー ゼの 結合. 東. 尚巳・寺本栄 二 ｏ 高野行夫 北海道教育大学旭川分校化学教室. Ｓｔｕｄｉ ｌｕｌｏｓｅ ｅｓ ｏｎ Ｐｒｏｎａｓｅ ａｎｄ Ｔ ａｇａｒｓｅ Ｂｏｕｎｄｔｏ Ｃａｒｂｏｘｙ ｃｅｌ ーｍｅｔｈｙｌ ．. Ｎａｏｍｉ ＡＺＵＭＡ ｉ ＴＢＲＡＭＯＴｏ ａｎｄ Ｙｕｋｉ ｉ Ｏ ＴＡＫＡＮＯ ， Ｅｉ Ｄｅｐａｒ ｔｍｅｎｔｏｆ Ｃｈｅｍｉ ｔ ｓ ｒｙ ， ， Ａｓａｈｉｋａｗａ Ｂｒａｎｃｈ Ｈｏｋｋａ ｉｄｏ Ｕｎｉｖｅ ｉ ｉ ｔｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａ ｔ ｒ ｓ ｏｎ. Ａｂｓｔｒａｃｔ. Ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏ ｆｉ ｌ ｅｅｎｚｙｍｅ ｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ， Ｃａｒｂｏｘｙα１ｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｎｓｏ ｕｂｌ. （ＣＭＣ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｃａｒｒｉｅｒ， ｐｒｏｎａｓｅ ａｎｄ ｎａｇａｒｓｅ. ｉｎａｓｅ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｐｒｏｔｅ ．. Ｔｈｅ ｐＨ ｆ ｉｎｇ Ｃハ ｄｅ ｗｉ ４Ｃ‐ ｉ ｔｈ ｅｎｚｙｍｅ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｏｒ ｃｏｕｐｌ ａｚ ｉ ｏｂｔ ａ ｎｅｄ ａｔ ａｒｏｕｎｄ ｐＨ ８．７． Ｔｈｅ ａｃｔ ｉｖｉ ｆ ＣＡ４Ｃ‐ｐｒｏｎａｓｅ ｉｍｕｍ ｏ ｔｙ ｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉ ｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｃｏｕｐｌｉｎｇｔｉｍｅ． ＴｈｅｐＨ ｏｐｔ ０ ｉｎｅ ｐＨ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｉ ｔｓ ｔｏｗａｒｄｓ ｍｏｒｅ ａｌｋａｌ ｗａｓ ９ ｓ ｖａｌｕｅ ｉ ｓｄ ａｃｅｄ ｂｙ ２ｐＨ ｕｎｉ ｓｐｌ ． ， ｔｈｉ ０ ゴ 登ｃａｎｔ １ｏｓｓ ｏｆ ｉｇｎｉ ｃ ｗｉ ｉＶｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉ ｔｈ ｎｏ ｓ ｎａｔ ｅｄ ｉｎｓｏ１ｕｂ１ ｅ ｅｎｚｙｍｅ ｃａｎ ｂｅ ｓｔｏｒｅｄ ａｔ ２ １ ． Ｔｈｅ ｄｒ. ｔｙ ａｃｔ ｌｖｌ ．. 不溶性酵素は， そのすぐれた特性によって， 最近広く利用されつつある． 即ち， 懸濁液として， 又は， カラムに， これ ら不溶性酵素を用いることにより， 反応液と酵素の分離が極めて容易となる 他に， くり返え し酵素を使用することも可能である． 更に， 構造既知の担体に酵素を結合させて，. １ ） 酵素の環境を変えることにより， 酵素の活性中心近傍についての知見を得ることも出来る （ ，２ ． ３ 抗原， 抗体反応に於ける利用も著 しい（ ） ．. ４ ｉ ｔ ）の ｒ ａ（ 不溶性担体の種類及び結合の方法には種々あるが， ＣＭ セ ル ロ ー ス に Ｍｉ ｚ ａｎｄ ｓｕｍａ. ６ ５ ） ） 方 法 で， 蛋 白分 解 酵 素 を 結 合 さ せ た 例 と して は， トリ プシ ン （ ，６ ， キ モ トリ プシ ン （ ， フィ シ. ７ ８ ソ（ ） ） などがあり， これら不溶性酵素の調製法についても， 最近よくまとめら ， ブロメ ライ ン （. ９ れている （ ） ，１０ ．. 我々は， 別な目的の為に不溶性酵素を使 用する必 要を生 じたので， ＣＭ セ ル ロ ー ス に Ｓ妙ゆＺｏ‐ ｚ ‘ ｓ 及 び βα “⑦ｙｃｅｓ ｇγＺｓｅ ｃ辺“ｓ 錫魔霧ｓｖａｒ． βＺＯＺＢα‘ｓ， Ａ より得らオ ている蛋白分解酵素 プロナー ゼ 及びナ ガー ゼを結合させたところ， 条件により， 収量及び活性に著 しい差を生 じることを見た． こ れ ら プ ロ ナ ー ゼ 及 びナ ガー ゼの ＣＭ セルロース誘導体は， 未だ報告されていないので， これらを. 調製する際の条件及び得られた酵素の性質につき， 若干検討 した結果を報告する．. 実験材料及び方法 実験材料： （５４）.
(3) . 第２４巻 第１号. １ 部 Ａ） 北海道教育大学紀要 （第 １. 昭和４８年１０月. ＣＭ セルロース （交換基容量 ０．７２ ｍｅｑ／ｇ ４５ ） は ミ ドリ 十 字， プ ロ ナ ー ゼ （ ００ＯＰＵＫ／ ） は科研工 ｇ ，. １０ ００ＯＰＵＮ／ 業， ナ ガー ゼ （ ｔｕｂｅ ） は 長 瀬 産 業， セ フ ァ デ ッ ク ス Ｇ－２００ は Ｐｈａｒｍａｓｉａ， ＡＴＰ は ，. Ｓｉｇｍａ よ り夫 々 購入し. い た．. ｔ ） その他の試薬は， すべて 和光純薬特級試薬を用 ｒ ｅｎ ｓ ， カゼイ ン （Ｈａｍｍａ. 実験方法： １ ） 酵素活性測定 蛋白分解酵素の場合：リ ン酸緩衝液 （ ０ ） 中に， 不溶性酵素を懸濁し， ２ ５ｏＣ の水浴中で， マ ＰＨ７ ，. グネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー を用 い， １０ 分 間 斑 拝 した 後 ， カ ゼイ ンを 吹 き こ み， 適 当 な 時 間 々 隔 で，. ５ ｍＺ ずつ反応液をとり出 し （通常５乃至６点） ， トリ ク ロ ル 酢 酸 ｌ ｍＺ を含む遠沈管 ， 水 ０， ｏｏｏｒ 中 に 吹 き こ み， 反 応 を 停 止 させ る， ３ ｐｍ．１０分間の遠心分離後， 上澄みの ｌ ｍ／ を と り， 酢 酸 ，. ０， ５ ｍＺ. ０ ５ ｍＺ と 振 り ま ぜ る そ の 後の 操 作 は Ｙｅｍｍ ａｎｄ Ｃｏｃｋｉ 緩衝液 （ １１ ） の ニ ンヒ ＰＨ５ ｎｇ （ ． ， ，４ Ｍ）０ ， ，. ドリ ソ法に従い， 加熱開始後４５ 分 で， ５７０ｎｍ で の 吸 光 度 を 測 定 し， 別 に， Ｌ‐ ロイ ツ ン を用 い て 全 く同じ操作を行なって作成した標準曲線を用い， 活性を求めた． 反応液中での濃度は， 通常４０ｍＭ. ５％ カ ゼイ ンで， 全 容 ５ ｍＺ で行なった 活性は Ｌ‐ ロ イ シ ソ ｍ” ｍｏ リ ン酸 緩 衝 液， ０ ｌ ｅ ｍｉ ， ｎ／ｍｇ ．. で表わした，. ＡＴｐａｓｅ の 場 合： 我 々の 方 法 で 測 定 した （ １２ ）. ０ ５Ｍ ） ＰＨ７ ， ． ． 即 ち， ２０ ｍ Ｍ トリ ソー マ レイ ン酸 （ ，０ ｏＣ で反応させ １分から４分までの１分毎に生成す ＫＣ１ ５ Ｃ Ｃ １ ｌ Ｍ ＡＴ Ｐ Ｍ ５ ２ の 成 で 組 ａ ｍ ｍ ， ２ ， ， ， る Ｐｉ を Ｍａｒ ｔ紙 Ｄｏ ｔ １３ ） に従って求め 活性を Ｐｉ ”ｍｏｌｅｓ／ｍｇ／ｍｉｎ で表わした ｙ 法（ ２ ） ミ オ シ ン Ａ の調製. ，. ，. １４ ウサギ骨格筋か ら， 我々の方法 （ ） に従って調製 したが， 最後の超遠心分離による精製は， 行. ２６０ｎｍ の 比 は １ ４４ で， こ れ を ＤＥＡＥ‐ セ ル ロ ー ス カ ラ な わ な か っ た． こ の ミ オ シ ンの ２８０ｎｍ／ ， ８３ と な っ た しか し こ の 実 験 に は ＤＥＡＥ‐ セ ル ロ ー ス 処 理 を 行 な わ ム に 通 す と， こ の 比 は， １ ． ， ， ， な い ミ オ シ ンを用 い た，. ３ ） 蛋白質の定量. 不 溶 性 酵 素 に 結 合 して い る 蛋 白 質 は， ミ ク ロ キ エ ル ダ ー ル 法 に よ り， ミ オ シ ンは ピュ ー レ ッ ト ，. 法に よ っ て 定 量 した．. ４ ） ディ スク電気泳動. ５％ ア ク リ ル アミ ドゲル を用 い， Ｗｅｂｅ １５ ） の ＳＤＳ‐ ディ ス ク 法 に よ っ た ｒ ａｎｄ ｏｓｂｏｒｎ（ ，. ５ ） 不溶性酵素の調製. ＣＭ セ ル ロ ー ス ・ ヒ ドラ ジ ドの 調 製： 概 ね， 高 見， 安 藤 （ ６ ） の 方 法 に 依 っ た。 即 ち， ＣＭ セ ル ９０％） を用 い， ＣＭ セ ル ロ ー ス 。 ヒ ド ラ ジ ロ ース をメ チ ル エ ス テ ル と した の ち， 抱 水 ヒ ドラ ジ ン （ ンを 得 た．. ５ｇ の ＣＭ セ ル ロ ー ス ． ｔ 不溶性酵素の調製： Ｍｉ ｚ ａｎｄ ｓｕｍ ｍａｒｉａ の 方 法 （４） に よ っ た， 即 ち， ０．. ５Ｎ‐ ＨＣ１５０ｍＺ に 懸 濁 し， －２ｏ－－ ヒ ドラ ジ ドを ０ ．. Ｃ で撹拝しなが ら 氷冷した ０ ５Ｎ‐ ＮａＮ０２ ． ， Ｋ を静かに滴下 し， １ ‐ デンプン試験紙で確認 しながら適当量 を加え， 更に同温度で３０分間機洋を － 続ける． これを猿過し， 生成 した ＣＭ セ ル ロ ー ス ｏ ア ジ ドを氷 冷 しな が ら， ＣＩ－ ， Ｎ０２ の消失す. るまで， 充分量の氷冷水で洗う， 得られたアジ ドは， 直ちに氷冷下で ４０ ｍ Ｍ ホウ酸緩衝液中で ， 酵素とカッ プリ ングさせ， 生成した不溶性酵素を充分量の氷冷水で未結合酵素を洗際し 去 っ て か ら， シリカゲル上で減圧乾燥し， 冷所に保存する，. （５５）.
(4) . ＶＯ Ｉ ．２４ ，ｌ ， Ｎｏ. ｆ Ｅｄｕｃａ ｉｏｎ（Ｓｅｃ ｉｏｎ 江 Ａ） ｉ ｌｏ ｆ Ｈｏｋｋａ ｔ ｉｄｏ Ｕｎｉ ｔ ｔｙ ｏ ｊｏｕｒｎａ ｓ ｖｅｒ. 験. 実. 結. ｏｃ ｔ ｏｂｅｒ ｌ９７３. 果. Ａ） ＣＭＣ‐ プ ロ ナ ー ゼ （ＣＭＣ－Ｐ） １ ） カ ッ プ リ ン グ時 の ｐＨ の影響 通 常， カ ッ プリ ン グは， 若 干 ア ル カ リ 側 で 行 な わ れ る が， こ の ｐＨ. に大きく影響する． ＣＭ. ５ｇ セ ル 口 ← ス ・ ヒ ド ラ ジ ド ０．. が不溶性酵素の収量及び活性. から得られた ＣＭ セ ル ロ ー ス ・ ア ジ ドに. プ ロ ナ ー ゼ ２００ ｍｇ を， 種 々 の ｐＨ のホウ酸緩衝液 ２０ ｍ／ 中 で １ 時 間 カ ッ プ リ ン グさせ， 生 成 し Ｐ の 収量 Ｘ 単位活性）と ｐＨ と の 関 係 を 図 ”こ 示 す， た不溶性 プロナー ゼの全活性 （ＣＭＣ‐. ７５ に於ける活性 が最も高く， この ｐＨ よ り も 酸 性 側 で も， ア ル カ リ 側 で も， 全 活 性 は 低 か っ ｐＨ８ ， た， ２ ） カ ッ プリ ン グ時 間 の 影 響. ＣＭ セ ル ロ ー ス ． ヒ ド ラ ジ ド １．２５ｇ よ り 調 製 した ＣＭ セ ル ロ ー ス ・ ア ジ ドに プ ロ ナ ー ゼ ５００ ｍｇ ７５ ） ５０ ｍＺ 中 で カ ッ プリ ン グさせ， 時 間 毎 に １ｏ ｍＺ ず っ と り出 し を ５０ ｍ Ｍ ホ ウ 酸 緩 衝 液 （ＰＨ８． て， 洗線， 乾燥させて得た ＣＭＣ‐Ｐ の活性と， カ ッ プリ ング時間の関係を図２に示す， 活性は， 時. 間と共に増加するが， 反応１時間までの増加 が特に著しい．. ３ ） 酸素量の影響 ５ ５ｇ の ＣＭ セ ル ロ ー ス ・ ヒ ドラ ジ ドよ り 調 製 し た ア ジ ドに， ５０ ｍ Ｍ ホウ酸緩衝液 （ ）中 ０． ＰＨ８ ． ｓ ×ｌ ｏ. 一 ＝ の 罫 コ 心 － の 一 ー ｕ ー. 一 亡 ＼ に ） － ① 〇 に ユ ヒ. ８ ０ ，. 図 Ｉ ＣＭＣ. ０ 誓２. . ８ ５ ，. ＰＨ. ９ ｏ ．. 一一－ － － －. ９ ５ ，. ０ｏ. ，. ２ ｈ ） 時 間（. ３. Ｐ 図 ２ カ ッ プ リ ン グ 時 間 と ＣＭＣ‐. アジ ドと プ ロ ナー ゼ がカ ッ プ リ ン. の関係. Ｐ 活性との関 グする際の ｐＨ と ＣＭＣ‐. ４. 活性. 横 軸： カ ッ プ リ ン グ時 間， 縦 軸： 活. 係. 性， 各点は， ３回の実験の平均値で. 横軸：ｐＨ，縦軸： 全活性 （収量ｘ活性）. ５ｇ よ り 得 ら れ た ＣＭＣ ヒ ドラ ジ ド ０ ． ＣＭこＣ ア ジ ドと プ ロ ナー ゼ を ４ ０ｍＭ ホ. あ る，. ウ酸緩衝液中でカッ プリン グ し， 得 た ＣＭＣ Ｐ の量と単位活性の積を全活性と ‐ した， 各点は， ３回の実験の平均値であ る，. （５６）.
(5) . （ △ ）. 十 ； ＼ 叩 「 ＼ ① 区 コ ① 十 の ① → ロ Ｙ 仁. 昭和４８年１０月. 北海道教育大学紀要 （第 ｎ 部 Ａ）. 第２４巻 第１号. 戸 」 ヒ ヒ ヒ ｕ ｙ 一. 、 、 － － １ １ ‐ １ ‐ １ ． ・ １ ， Ｉ Ｑ 十. Ｍ Ｓ 。 一 院 き ｅ Ａ Ｉ 。 芝 ｏ. ○ ー Ｊ 、 一. ，. ＼， 、 、 、 、. 、 、. ０ ５ Ｃ ） 温 度ぐ. ３ ０ １ ０ ０. ２ ｏ ｏ Ｐ ） ｅ（ ｒ ｍａ ｓ ｍ ｇ. ｏザ ３. 図５. 図 ３ プロナー ゼ使用量と ＣＭＣ‐Ｐ の活 性 及び. 結合蛋白量との関係 横軸： プロナ ゼ使用量， 縦軸：活性（０） ， 結合蛋白 ｍｇ／ＣＭＣ‐Ｐ １ｏｏｍｇ （□） ， 各点は２回の実験の平均値である．. プ ロ ナー ゼ及 び ＣＭＣ Ｐ の耐熱性 ‐ 横軸： 処理温度， 縦軸：活性 ／ｍＺ（△） 叉 反応条件： プロナー ゼ １０”ｇ ＰＯ ５ｍｇ ／ｍＺ（０） は ＣＭＣ － ． ，４０ｍＭ リン ０ ）を各温度で１０分間処 酸緩衝液 （ ＰＨ７ ． 理後， ３分間流水で冷 却する， こ れ を ｏＣ に１ ２５ ０分 間 保った後， カ ゼインを 加え， 反応を開始して活性を測定した，. （ ○ ）. （ △ ）. Ｊ 一 ＼ 加 ー ＼ の ス コ 」 の ① 文 ｒ 辻 声 －. 馨ｌｏ. . ７. Ｈ ｐ. ８. 図 ４ プロナー ゼ及び ＣＭＣ‐Ｐ の最適 ｐＨ. ９. ０ｍＭ ５％カゼイン， ４ 横軸：ｐＨ， 縦軸： 活性， 反応条件：０ ． プ 線 ） ナ 緩 衝 液 （ 点 ロ ーゼ ホウ酸 リン酸緩衝液 （実線） ， ， ２５０Ｃ． ５ ｍＺ ＣＭＣ Ｐ Ｚ 全容 ／ ／ （ ○ ） １０β副ｍｚ（△） ｍ ｍ － ｇ ， ， ， （５７）. ７ ０. 憲 ヒ ヒ こ Ｕ の ー Ｕ に －.
(6) . ＶＯ Ｉ ．２４ ，ｌ ， Ｎｏ. ｌｏｆ Ｈｏｋｋａ ｊｏｕｒｎａ ｉｄｏ Ｕｎｉｖｅｒ ｉ ｉｏｎ（Ｓｅｃ ｔｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａ ｉ ｔ ｔ ｓ ｏｎ ｎ Ａ）. ｏｃ ｔ ｏｂｅ ｒ ｌ９７３. で プ ロ ナ ー ゼ 量 を変 え て， ２ 時 間 カ ッ プリ ン グさ せ て 得 た 酵 素 の 活 性 は 図 ３ に 示 さ れ る よ う に ， ， おおむね， 酵素量の増加と共に活性は増加するが 約 ２００ ｍｇ 以 上 の プ ロ ナ ー ゼ に よ っ て 略 々 一 ， ，. 定の活性を有する ＣＭＣ‐ Ｐ が得られる 又， 図に示される様に ＣＭ セルロースに結合した蛋白 ， ， 量の増加と， 活性の増加とは略 々一致 した ，. Ｂ） ＣＭＣ－ ナ ガー ゼ （ＣＭＣ‐Ｎ） ‐ と して プ ロ ナ ー ゼと 同様 に ナ ガー ゼ も ＣＭＣ‐Ｎ ， ， 不 溶 化 させ る こ と が 出 来 る． ＣＭ セ ル ロ ー ５ｇ か ら 得 た ア ジ ドに 直 ち に 種 々 の 量 の ナ ガー ゼ をカ ス ・ ヒ ド ラ ジ ン ０． ッ プ リ ン グさせ て 不 溶 ， ，. 化 し， その活性と使用酵素量の関係を表１に示 した この場合も ＣＭＣ‐Ｐ の 場 合 と 同様 に カ ッ ． ， プリングに使用 した酵素量の増加と共に 活性は増加 したが 使用酵素量に対する結合酵素の割合 ， ， は 略 々 ３５％ と 一 定 に な っ た ．. Ｃ） ＣＭＣ‐Ｐ と ＣＭＣ‐Ｎ の 性 質. １ ） 最適 ｐＨ プ ロ ナ ー ゼ の 最 適 ｐＨ は 図 ４ に 示 さ れ る 様 に ， ， 中性 附 近 で あ る． 一 方， こ の プ ロ ナ ー ゼが， ＣＭ セ ル ロ ー ス に 結 合 した ＣＭＣ‐Ｐ で は ＰＨ９ 附近に最適 ｐＨ が移動 している 酵素の不溶化 ，. ．. 表１. 使用酵素量 収 （ｍｇ ）. （ｍｇ ）. ５ ５ ， ８. ２５４. １７. 量. 活. 性. 結合酵素 ｍｇ ｍ〆 ｍｏｌｅｓＬｅｕｃｉｎｅ／ ＣＭ［Ｃ 『 － ｌｏｏｍ Ｌ ｇ ／ｍｉ ／ｍＺ ｍｇ ｎ ２２ ０ ． １ ０９ ． ２ ６ ．３. ２４０ ２２８. ２１. ２４２. ３６. ２５５. （ ○）. ３ ４３ ． ５ ３ ．１. （船譲）瀞. ．. （ △ ） 初０ ０. ご. ミ . ー Ｅ ２ ０ ０ ０き ＼ の こ ６ 話 一 語 ぎ き ｌ ｏ ｏ亀 ｏ. １ ０ ０. ー ０. ２ ０ ３ ｏ 時間（ ｉ ） ｍ ｎ ．. ４ ０. ０. ６ － ａ： 分解時間とミオツソ Ａ‐ＡＴｐａｓｅ 及 び ニ ソ ヒ ドリソ反応 横軸： 分解時間 （分） ｓ ｅ 活性 ， 縦軌：ＡＴｐａ （○） ， ニソヒドリソ呈色（△） ． 反応条件： ミオツソ Ａ ５７ ｍｇ，０ ６ Ｍ ＫＣ１ ． ， １ｏｍＭ Ｔｒ ｉｓＭａ ｌ ｔ ｅａ ｅ緩衝液（ ＰＨ ０） ，ＣＭＣ－ Ｎ ５０ｍｇ 全容 １ ２ｍＺ を ２５ｏＣ で反応し， ， 各時間毎に櫨過し， 各櫨液について， 活性 を測定した． 図６. ２ ０ フラクション Ｎ ｏ ，. ３ ０. ６ －ｂ： セ フ ァ デ ッ ク ス Ｇ‐ ２００ によるゲル櫨過 ８×６０ｃｍ，５ カ ラ ム：２ ３ ｍ″ｔｕｂｅ ｈ ／ ， ． ， 流 速：５ｍｚ ， 溶 媒： ０ ６Ｍ ＫＣ１ ） ， ，２００ｍ Ｍ トリ ス ー ＨＣ１（ＰＨ ６ ．ミ オ ツ ソ Ａ （未処理） ６ ７ｍｇ（……） ５分間分解：蛋白 ；１ ．. ， 量７ｍｇ（ －－－－ ） ，２０分間分解： 蛋白量 ７ｍｇ（－－） ．. ミ オ ツ ソ Ａ の ＣＭＣ－Ｎ による分解. （５８）.
(7) . 第２４巻 第１号. 北海道教育大学紀要 （第 ｎ 部 Ａ）. 昭和４８年１０月. 一. 国 霧. １. ｉ ２. 画 一 ５. ３. ６ ー ｃ：ＳＤＳ ディスク電気泳動 ｔ ｕｂｅ 泳動方向は上から下である． ２ｍＡ／ ３：２０分分解， ５分分解 ２ ｌ：ミオッソＡ（未処理） ： ， ， ４：４５分分解， ５： 標準蛋白 （上から ＢＳＡ ダイ マ ー， ＢＳＡ， リ ゾ チー ム） ， コ マ ジ ー ・ ブ リ リ ア ン ト・ ブ ル ー で染 色し， 酢 酸・ メ タノー ル 溶 液で 脱 色 し た， 図 ６ ミ オ ツ ソ Ａ の ＣＭＣ－Ｎ による分解. ９ ） （ １６ ） によって， ＰＨ‐ 活性曲線が， 殆ど変 らない場合もあるが （ ， 移動する例は 多い ， ２ ） 熱 変 性 ０ 分間処理すると， 何れの温 図 ５ に 示 さ れ る様 に， プ ロ ナ ー ゼ 及 び ＣＭＣ‐Ｐ を， 種々の温度で１ が著 度 に於 て も ＣＭＣ‐Ｐ の方がプロナー ゼよりも若干安定 であり， 特に， 高温に於て， その傾向 ， しい． ３ ） ＣＭＣ‐Ｎ に よ る ミ オ シ ソの 分解. ニ ソヒ ド ミ オ シ ソ Ａ は， ＣＭＣ‐Ｎ に よ っ て， 小 さ い フ ラ グメ ン トに分 解 さ れ る， こ の こ と は， が次 リ ソ呈 色 法 で 測 定 す る と， ミ オ シ ソ Ａ と ＣＭＣ‐Ｎ の反応時間経過に従 って， ＴＣＡ 可溶成分. 殆ど変 化 第に増加することからも推定される． 一方， ミオシ ン Ａ‐ＡＴｐａｓｅ 活性は， この処 理で， ００ カ ラ 間 ５ 分 及 び ２０ 分 解 液 を， セ フ ァ デ ッ ク ス Ｇ÷２ ） しない （図 ６－ａ ， しか し， こ の 時， 分 解 時 ＣＭＣ‐Ｎ に よ る処 ム でフ ラ ク シ ョ ンす る と， 図 ６－ｂ に示される様な溶出曲線を示 し， ミオシ ソは 理で， 短時間に， 多くの小片を生成すること が認められる．. の ゲル 内 に 入 こ の こ と は， 図 ６－ｃ の ア ク リ ル ア ミ ドゲル に よ る 電 気 泳 動 に 於 て， ５％ ゲル 上 端 ，. 良く り込まなかっ た蛋白が， 分解時間と共に減少 し， 分子量の小さい断片の増加 していることと， 対 応 して い る，. 察. 考. どの方法で 不溶性酵素の調製にあたり， 不溶化しようとする酵素及び， 用いる担体の性質， 又， ス◎アジド 結合させ るか， によって， その条件は極めて多種に亘る． 本報に於ては， ＣＭ セ ル ロ ー ４ ）を用いた， この方法 では， 主と して， 蛋白質中 と酵素とを， カッ プリ ングして結合させ る方法 （ のアミノ 基が反応すると考え られているが， 他の基も， 当然反応に関与するものと思われる． 従っ て， それらの基が， 酵素の活性中心近傍に存在する場合には， 酵素は不溶化されても， 酵素活性を 失う場合もあ るが， ここに用いた プロナーゼ， 及び， ナ ガーゼの場合には， 共に充分の活性を有す ｏ る状態で不溶化し得た， この方法は， すべての操作が， ｏ Ｃ 附近で行なわれるので， 更に又， 反応 も穏やかである為に， 酵素の変性が一般に少ないのであろう． ７ 附近に最適があるということは， ＣＭ セ ル ロ ー ス ・ ア ジ ドと 酵 素 の カ ッ プリ ン グの 際 に ＰＨ８ ， ，. （５９）.
(8) . Ｉ ＶＯ ．２４ ，Ｉ ， Ｎｏ. Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｈｏｋｋａ ｉｄｏ Ｕｎ ｉｖｅ ｉ ｔｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔ ｉｏｎ（Ｓｅｃ ｉ Ｉ Ａ） ｒ ｓ ｔ ｏｎ ｌ. ｏｃ ｔ ｏｂｅ ｒ ｌ９７３. 生成 した ＣＭＣ‐Ｐ の最適 ｐＨ が ９ 附 近 に あ る こ と と 関 係 が あ る の か 否 か は 不 明 で あ る ， ， ． 使用 する酵素量が多ければ 結合する酵素量も多いであろうと推定され Ｋａ ｋ ｈ ｌ ｔ ｉ １７ ）も， ら（ ｃ ａ ｓ ， ，. トリ プ シ ン ‐ マ レイ ン酸 重 合 体 の 調 製 に 当 た っ て こ の 事 実 を 認 めて い る こ の こ と は プ ロナ ー ， 。 ，. ゼ， ナ ガーゼを不溶化する場合 共に事実であるが 最適量の存在が認められた 又 酵素の結合 ， ， ． ， 量の増大に伴 って， その単位活性の増加 が認め られた ． 酵素の不溶化によ って 酵素の性質が若干変わることが知られている 未処理の プロナーゼに比 ， 。 し， ＣＭＣ‐Ｐ の耐熱性は 若干ではあるが増大した 又 プロナーゼの最適 Ｈ ｐ は中性附近である ， 、 ， の に 対 して ＣＭＣ‐Ｐ では 約９附近へと移動した ， ． 耐熱性が増大したのは， ＣＭ セルロースに酵素が結合 した為に 酵素の構造が 安定したのが原 ， ， 因と考え られる． しか し， ここで得た結果とは違って 酵素の不溶化によ て 耐熱ｒ注が 若干失 っ ， ， ， ８ われる例 （ ）も報 告されている ． Ｋａ ｌ ｋ ｔ ｉ ら（ １８ ｃｈａ ｓ ） は， 蛋白分解酵素の担体と して 陰イ オン性担体を用いて得た不溶性酵素の ， ｐＨ‐活性曲線は， アルカリ側へ移動し， 陽イ オン性担体を用いた場合には 酸性側へ移動すること ， を見た． 彼らは， 担体表面と周囲の溶液との間で 水素イ オンが均等に分布していないので 陰イ ， ， オン性担体を用いた場合には 担体附近の ｐＨ は 溶液全体の ｐＨ よ り も 低 く 従 て ， っ ， ， ， 酵素活 性の ｐＨ 依存性は， アルカリ側へ移動する 陽イ オン性担体を用い た場合には この逆の状態に ． ， な る こ と に よ る の で あ る う と 説 明 して い る ， ＣＭＣ‐Ｐ に於 て も こ の様 な 環 境 の 変 化 が 酵 素 近 傍 で起 こ て い る の で ろ あ う． 即 ち， ＣＭＣ‐Ｐ ， っ ， で最適 ｐＨ が アルカリ側へ移動 したのは 担体力ルポキ シル基が酵. 素の近傍を酸性化した為に， ， ， 反応液全体の ＰＨ よりも 酵素近傍では ＰＨ が低く その為に 最適 Ｈ が アル カ リ 側 へ 移 ， ｐ ， ， ， ， ， 動 した の で あ ろ う と 考 え られ る しか も ＣＭ セ ル ロ ー ス と 酵 素 が 結 合 す る 場 合 に ， 。 ， ， 酵素表面 の アミ ノ 基 の 他 に リ シ ソ残 基 の み ア ミノ 基 や グァ ニ ジ ン基 が 結 合 に な る こ と ， もあ る と す る と， ，. 全体と して， 酵素表面 の負電荷の増加をもた らし このことも 最適 Ｈ 移動の原 因とな ている ｐ ， っ ， のかも知れない． プロナーゼは 多くの蛋白分解酵素を含む系であることが知られていて （ １９ ） ， ， 非特異的作用を示. すの で， 広 く 利 用 さ れ て い る。 一 方 ナ ガー ゼ は 単 一 の蛋 白 分解 酵 素 で あ て トリ プ シ ン， キ っ ， ， ， モ トリ プ シ ンよ り も 非特 異 的 で あ る と 考 え られ て い る （ ２ ０ ） 従 て 蛋 白構 造 の 研 究 に は しば ， っ ， ， ， しば利用 されている酵素である これらの特性 を有したまま 不溶化された ＣＭＣ‐Ｐ 及 び ＣＭＣ Ｎ ‐ ， ，. は， 従来通りの利用の他に， 更に 広く利用 され得るものと考え られる ， ． 文. 献. １ ｌｍａｎ ） Ｓｉ ｌ ｉ ｔ ｃｈａ ｓｋ １９６６） ． Ｈ． ，１ ，ａｎｄ Ｅ， Ｋａ ． 尺β〃 ． β海豹ｅ粥． ， Ａ”” ，３５ ，８７３（ ．. ２ ） 千畑一郎， 土佐哲也： 蛋白質・核酸・酵素 １ １９ ６６ ） ，２３（ ， １ ．. ｌ ｉｋｙ ３） 帆／ ｌ ｌ ｅ ｔ ｅｅ ａ ７ ｚ例の例の庇粥〆ダリ，２ １９６５ ） ， Ｎ． ，ａｎｄ Ｈ． Ｈ． 帆′ ，Ｚ ，２９３（ ． ４ ） Ｍｉ ｔ ｚ ｉ １９６１） ａ ， Ｍ， Ａ， ，ａｎｄ Ｌ，Ｊ ， Ｓｕｍｍａｒ ， 対の 鰯ｅ ，５７６（ ，１８９ ， ５ ｉｎ ） ＥＰｓ ｔ ｅ Ｚ ｅｎ １９６２ Ｏ ．ａｎｄ Ｃ， Ｂ． Ａｎ五ｎｓ ） ， Ｃ．Ｊ ． Ｃたのれ ， ヱ βＺ ， ，２３７ ，２１７５（ ．. ６ ） 高見徹， 安藤鋭郎： 生化学， ４０ １ ９６８ ） ，７４９（ ， ７ ） Ｈｏｒｎｂｙ ｌ ｌｙ ａｎｄ Ｅ， Ｍ． Ｃｒｏｏｋ βおをの獲 工 ９８ ４２０（ １９６６ ｄ ， Ｗ． Ｈ． ）；ｉｂｉ ， Ｍ． Ｄ． Ｌｉ １９６８ ） ， ， ， ，１０７ ，６６９（ ， ８ ） Ｗｈａｒｔｏｎ， Ｃ． Ｗ． ２ １ βお物 鰯２ １９６８ ， Ｅ． Ｍ， Ｃｒｏｏｋ ａｎｄ Ｋ． Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔ ） ， β解 ゆ 鯛’ ． ，６ ，５６５（ ． ｋ ‘ ９ Ｃ ‘ Ｅ ） ｒｏｏ ， ， Ｍ， ， Ｋ， Ｂｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔａｎｄ Ｃ， Ｗ， Ｗ，ｈａｒｔｏｎ， 肌郷”ｏｄｓ “２ ８旧ツブ”ｏＺｏｇｙ“ ＶＯ１ ，１９ Ｅｄ ， ｂｙ Ｇ， Ｅ，. Ｐｅｒ ｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｌ． Ｌｏｒａｎｄ Ａｃａｄｅｍｉ １９７０ ｃ Ｐｒｅｅｓ ） ， ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ ，９６３ ． ，ｐ ‘ ‘ 肌訪ねｏｄ １０ ’ ＶＯ ） Ｃｕａ ｔ ｒｅｃａｓ ａｓ １ ｓ 彰 β”砂夕卿 勿ｇｙ’ ， Ｐ，ａｎｄ Ｃ， Ｂ， Ａｎ６ｎｓｅｎ ， ，２２ ，ｂｙ Ｗ，Ｂ，Ｊａｋｏｂｙ ｃ ，Ｅｄ ，Ａｃａｄｅｍｉ Ｐｒｅｓ １９７１ ｓ ） ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （ ．３４３ ， ，ｐ １１ ） Ｙｅｍｍ ，Ｅ １９５５ ） ． Ｗ．ａｎｄ Ｅ． Ｃ， Ｃｏｃｋｉｎｇ， Ａ”錫寛ご ，８０ ，２０９（ ，. （６０）.
(9) . 第２４巻 第１号. 北海道教育大学紀要 （第 ｎ 部 Ａ）. １９６３ ） ＯＰ角ｙｓ ． ，７３ １２ ‐αの ） Ａｚｕｍａ ，Ａ ，４９９（ ， βぜの乃粥． βＺ ， Ｎ．ａｎｄ Ｙ， Ｔｏｎｏｍｕｒａ. １９４５ ） ｉｎ １３ ｔ ） Ｍａｒ ｙ ． ，９６５（ ，２１ ， Ｂ．ａｎｄ Ｄ． Ｍ． Ｄｏｔ ， Ａ”〆． Ｃ膨創． ，ー ９ ８ ４ １ ６５ ４ ０ ７（ Ｃ脳 ３ Ｚ Ｚ ２ ） ｂ β 汎 ｒ Ｎ ｓ ｄ 朔 Ａ ｔ ヱ Ｏ １４ ａ ａ ａ ｎ ｅ ） ｚｕｍａ ． ， ． ． ， ， ， ，ａｎ ． １９６９ ４４ ４４０６ （ Ｃ卿 ２ ） β Ｚ ｏ Ｚ Ｍ ｂ Ｋ ｄ 粥 ノ Ｏ １５ ｏ ｒ ｓ ｎ ａ ） 頓′ ｎ ， ｅｂｅｒ ， ， ， ． ， ． ， ， ， １９７１ ） ｅ １６ ） Ｇ１ ． ａ ｓ ｓｍｅｙｅｒ ｃ．ａｎｄＪ ，７８６（ ，１０ ． Ｄ． ０ｇｌ ， βぎの膨”ぬかｙ １９６４ ｋ ｉ β ｉ 膨創亮かγ ） ｈ ｌ ｄ Ｅ Ｋ Ｇ ｄ ｉ ｃ ｌ ｔ ｏ ｈ Ｌ ａ ｓ Ｙ Ｐ ｔ ａ ｃ Ｍ ａ ｎ Ｌ ｉ ｔ ｏ ｓ ｅ ｎ ． ｃ ，１９０５（ １ ｅ ，３ ７ ｎ ， ， ） ｅｖ ， ． ， ． ， ． １９６４ ｋｉ ３ １９１３（ ） ｈａ ｌ Ｂお物ｅ創おかツ ｄ Ｅ， Ｋａ ｉ ｔ Ｙ Ｌ ｓ ｃ ｎ ａ ｎ ｅ ． ｖ １８ ， ， ） Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｌ， ， ． ， １９６８ ） ｔ Ｙ， Ｋ， Ｓｈｉ ｂｕｙａ ａｎｄ Ｍ， Ｙａｎａｇｉ ｏｃ膨創， ａ ， １９ ， βＺ ，６４ ，４２７（ ） Ｎａｒａｈａｓｈｉ ，！ ， ，. ‘ 朝倉書店 東京 （ ２２ １９ ６６ ）ｐ ２０ ．５ ， ） 吉田文彦：”酵素ハン ドブック‘ ，. 昭和４８年１０月.
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